Name: purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) en natural science foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2021A1515010796) aan W. L. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.

1. Zuivering van GST-gelabelde TRP- en His-tagged NORPA-fragmenten
<ol><li>Zuiveren GST-tagged TRP 1261-1275 fragment<ol>
<li>Transformeer de pGEX 4T-1 TRP 1261-1275plasmide 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) cellen met behulp van de CaCl2 heat-shock transformatiemethode21. Ent een enkele kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) medium en groei 's nachts bij 37 °C. Versterk vervolgens de 10 ml zaaicultuur in 1 L LB-medium bij 37 ...

<ol>
	<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL.">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode.">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracellular+Ca2++chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors:+the+role+of+Ca2++and+trp.">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li><li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors.">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li><li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system.">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li><li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels:+Ca2++is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient.">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li><li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol.">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).</li><li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line.">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li><li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels.">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075 (2019).</li><li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channel:+The+structural+era.">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191 (2020).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms.">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INAD+scaffold+is+a+dynamic,+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye.">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li><li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exquisitely+specific+PDZ/target+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel.">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc&#946;+binding+in+Drosophila+photo+receptors.">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plc&#946; binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency.">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).</li><li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects.">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li><li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins.">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li><li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+TRP+channels.">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li></ol>

INAD, dat vijf PDZ-domeinen bevat, is de kernorganisator van Drosophila-fototransductiemachines. Eerdere studies toonden aan dat INAD PDZ3 bindt aan de TRP-kanaal C-terminale staart met een voortreffelijke specificiteit (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interageert met NORPA 863-1095 fragment met een extreem hoge binding affiniteit (KD = 30 nM). Deze bevindingen bieden een solide biochemische basis voor het ontwerpen van de affiniteitszuivering plus concurrentiestr...

Fototransductie is een proces waarbij geabsorbeerde fotonen worden omgezet in elektrische codes van neuronen. Het geeft uitsluitend opsinen en de volgende G-eiwit-gekoppelde signaleringscascade door bij zowel gewervelde als ongewervelde dieren. In Drosophila organiseert scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) met behulp van zijn vijf PDZ-domeinen een supramoleculair signaleringscomplex, dat bestaat uit een transient receptor potential (TRP) kanaal, fosfolipase Cβ/No receptor potential A (PLCβ/NORPA) en oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC)1. De vorming van dit supramoleculaire signaleringscomplex garandeert de juiste subcellulaire lokalisatie, hoge efficiëntie en specificiteit van Drosophila-fototransductiemachines. In deze complexe, lichtgevoelige TRP fungeren kanalen als downstream effectoren van NORPA en bemiddelen calciuminstroom en de depolarisatie van fotoreceptoren. Eerdere studies toonden aan dat de opening van het Drosophila TRP-kanaal wordt gemedieerd door protonen, verstoring van de lokale lipidenomgeving of mechanische kracht 2,3,4. Het Drosophila TRP-kanaal interageert ook met calmodulin5 en wordt gemoduleerd door calcium door zowel positieve als negatieve feedback 6,7,8.
Tot nu toe waren elektrofysiologische studies over het gatingmechanisme van Drosophila TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen gebaseerd op weggesneden membraanpleisters, hele-cel opnames van gedissocieerde wild-type Drosophila-fotoreceptoren en hetero-uitgedrukte kanalen in S2-, SF9- of HEK-cellen 2,9,10,11,12,13, maar niet op gezuiverde kanalen. De structurele informatie van het drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte blijft ook onduidelijk. Om de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverd eiwit in een gereconstitueerde membraanomgeving te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte, is het verkrijgen van gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte de noodzakelijke eerste stap, vergelijkbaar met de methodologieën die worden gebruikt in TRP-kanaalstudies van zoogdieren 14,15,16,17.
Onlangs werd op basis van het assemblagemechanisme van INAD-eiwitcomplex 18,19,20 voor het eerst een affiniteitszuiverings- plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het TRP-kanaal te zuiveren van Drosophila-hoofdhomogenaten door streptavidin-kralen 5. Gezien de lage capaciteit en de dure kosten van streptavidin-kralen, wordt hier een verbeterd zuiveringsprotocol geïntroduceerd dat his-tagged aaseiwit en bijbehorende goedkope Ni-kralen met een veel hogere capaciteit gebruikt. De voorgestelde methode zal helpen om het gatingmechanisme van het TRP-kanaal vanuit structurele hoeken te bestuderen en de elektrofysiologische eigenschappen van het TRP-kanaal te meten met gezuiverde eiwitten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>Protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.melanogaster: W1118 strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>BDSC:3605</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/30/40 mesh stainless steel sieves</td>
			<td>Jiufeng metal mesh company</td>
			<td>GB/T6003.1</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>A3291</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HC2005</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05892953001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100472-0025</td>
			<td>SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A620058-0100</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500838-0500</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610235-0005</td>
			<td>SDS-PAGE buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17513202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0001</td>
			<td>Elution buffer preparation for Ni-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600168-0025</td>
			<td>Induction of protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002-0250</td>
			<td>E.coli. cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G4251-100G</td>
			<td>Elution buffer preparation for Glutathione beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-Sepharose excel beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17371202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610424-001</td>
			<td>Detergent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T9281-100ML</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607008-0500</td>
			<td>Homogenization buffer for E.coli. cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>P0754-25G</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26619/26616</td>
			<td>Prestained protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (preparation grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28989336</td>
			<td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (analytical grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500228-0001</td>
			<td>SDS-PAGE gel/buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1503-10KG</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096/801096</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td>APX-60</td>
			<td>Metage of Drosophila head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0015</td>
			<td>TRP protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0017</td>
			<td>Bait and competitor protein purification from E.coli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td>
			<td>SDS-PAGE imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti J-26 XP</td>
			<td>Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>UNION-BIOTECH</td>
			<td>UH-05</td>
			<td>Homogenization of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen tank</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>CX-100</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>AKTA purifier</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80&#176;C)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>900GP</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>MAPADA</td>
			<td>UV-1200</td>
			<td>OD600 measurement of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels

Drosophila fototransductie is een van de snelst bekende G-eiwit-gekoppelde signaalroutes. Om de specificiteit en efficiëntie van deze cascade te garanderen, bindt het calcium (Ca2+)-permeabele kationkanaal, transient receptor potential (TRP), zich stevig aan het steigereiwit, inactivatie-no-after-potential D (INAD), en vormt een groot signaleringseiwitcomplex met oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC) en fosfolipase Cβ/No-receptorpotentiaal A (PLCβ/NORPA). De biochemische eigenschappen van het Drosophila TRP-kanaal blijven echter onduidelijk. Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene TRP-kanaal te zuiveren. Ten eerste werd het gezuiverde histidine (His)-gelabelde NORPA 863-1095-fragment gebonden aan Ni-kralen en gebruikt als lokaas om het endogene INAD-eiwitcomplex uit Drosophila-hoofdhomogenaten naar beneden te halen. Vervolgens werd overmatig gezuiverd glutathion S-transferase (GST)-gelabeld TRP 1261-1275-fragment toegevoegd aan de Ni-kralen om te concurreren met het TRP-kanaal. Ten slotte werd het TRP-kanaal in het supernatant gescheiden van het overmatige TRP 1261-1275-peptide door grootte-uitsluitingschromatografie. Deze methode maakt het mogelijk om het gatingmechanisme van het Drosophila TRP-kanaal te bestuderen vanuit zowel biochemische als structurele hoeken. De elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde Drosophila TRP-kanalen kunnen ook in de toekomst worden gemeten.

In dit artikel wordt een eiwitzuiveringsmethode gedemonstreerd om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren (figuur 1).
Ten eerste worden recombinante eiwitexpressie en -zuivering toegepast om het aas en concurrerende eiwitten te verkrijgen. Vervolgens wordt een GST-gelabeld TRP 1261-1275-fragment uitgedrukt in E. coli BL21 (DE3) -cellen in LB-medium en gezuiverd met glutathionparels en een kolom met grootte-uitsluiting (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels at JoVE.com

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

In dit protocol demonstreren we het zuiveringsproces om gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte te verkrijgen, wat de noodzakelijke eerste stap is om elektrofysiologische eigenschappen te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte. Op basis van het bemonsteringsmechanisme van het INAD-eiwitcomplex en met behulp van goedkope nikkelparels met een veel hogere capaciteit, kan voldoende hoeveelheid TRP-kanalen uit vliegenkoppen worden gezuiverd. De procedure wordt gedemonstreerd door Yuyang Liu, een technicus uit ons lab.Transformeer om te beginnen de pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plasmide in E.coli BL21-cellen, met behulp van de calciumchloride warmteschoktransformatiemethode. Ent een enkele kolonie in 10 milliliter Luria Bertani medium en groei 's nachts bij 37 graden Celsius. Voeg de 10 milliliter zaaicultuur toe aan een liter Luria Bertani medium en incubeer bij 37 graden Celsius.Nadat de optische dichtheid van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 graden Celsius en voegt u 0,1 millimolaire isopropyl-bèta-D-1-thiogalactopyranoside toe. Na overexpressie pelleteert u een liter gekweekte cellen door centrifugatie en resuspendeert u in 40 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Laad de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator, voorgekoeld tot vier graden Celsius.Verhoog langzaam de homogenisatordruk tot 800 bar. Open het inlaatlipje en laat de geresuspendeerde cellen cirkelvormig door een klep met smalle spleten gaan. Laad vijf milliliter glutathionparels in een zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 50 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossingsbuffer, voor een totaal van drie keer.Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator op 48, 384 maal G.Voeg ongeveer 40 milliliter van het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat toe aan de gebalanceerde glutathionparels in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de glutathion kralen om de 10 minuten. Open na 30 minuten incubatie het tabblad kolomuitlaat om de kralen en doorstroomfractie te scheiden.Gooi de doorstroomfractie weg en spoel de resterende glutathionparels twee keer af, met 50 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossingsbuffer. Voeg 15 milliliter elutiebuffer toe aan de glutathionparels en resuspenseer de kralen elke 10 minuten. Eluteer het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment in een conische buis van 50 ml en laad het in een kolom met grootte-uitsluiting.Verzamel vijf milliliter van de geëlueerde eiwitten per buis en concentreer de gezuiverde fragmenten tot één milliliter door centrifugatie in een ultrafiltratiespinkolom in een gekoelde centrifuge. Om het His-tagged NORPA 863-1095-fragment te zuiveren, volgt u de eerder gedemonstreerde procedure met behulp van nikkelparels. Verzamel volwassen vliegen in conische centrifugebuizen van 50 milliliter en vries ze gedurende 10 minuten in vloeibare stikstof.Schud de bevroren buizen krachtig met de hand en breng het mengsel over op drie, sequentieel gestapelde, voorgekoelde roestvrijstalen zeven. Schud de zeven en veeg de vliegenkoppen met een borstel van de zeef van 40 mazen. Breng ze over in vijf milliliter conische buizen en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.Homogeniseer 0,5 gram koppen in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde vijzel en stamper. Los de gehomogeniseerde koppen op in vijf milliliter 10X lysisbuffer, gevolgd door centrifugatie bij 20, 817 maal G bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Het spin-down supernatant wordt verder 100.000 keer G gecentrifugeerd bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten.Voeg een milliliter nikkelparels toe aan de zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen drie keer met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water op vier graden Celsius. Breng de kralen in evenwicht met 10 kolomvolumes lysisbuffer, drie keer bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliter 600 micromolair gezuiverd His-tagged NORPA 863-1095-eiwit toe aan de nikkelkolom en incubeer de kolom.Resuspend de kralen elke 10 minuten. Open de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden en was de nikkelparels met 10 milliliter koude lysisbuffer. Voeg vervolgens koud supernatant van Drosophila-hoofdhomogenaat toe aan de nikkelkolom.Was na incubatie de kralen met 10 milliliter lysisbuffer en voeg 500 microliter 600 micromolaire GST-gelabelde TRP 1261-1275-eiwit toe aan de kralen. Verzamel de geëlueerde fractie uit de zwaartekrachtkolom. Was de nikkelparels met 10 milliliter bindingsbuffer.Voeg vervolgens de elutiebuffer toe en verzamel de elutiefractie uit de kolom met de zwaartekrachtstroom. Concentreer de fracties die zijn geëlueerd uit drosophila TRP-kanaalzuivering, met behulp van een ultrafiltratiespinkolom van vier milliliter. Injecteer het monster in de kolom met grootte-uitsluiting en elueerde de eiwitten met een redelijk debiet.GST-gelabeld TRP 1261-1275 fragment werd tot expressie gebracht in E.coli-cellen en gezuiverd met behulp van glutathionkorrels en een maatuitsluitingskolom. Op dezelfde manier werd het His-tagged NORPA 863-1095-fragment uitgedrukt en gezuiverd met behulp van nikkelparels en een kolom met grootte-uitsluiting. Het geëlueerde TRP-kanaal is gescheiden van het overmatige GST-gelabelde TRP 1261-1275-peptide, door grootte-exclusiechromatografie.Als bijproduct worden de INAD, ePKC, NORPA 863-1095 complexen verkregen na TRP 1261-1275 peptide competitie. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van dit protocol, is homogeniseren van de vliegenkoppen in vloeibare stikstof en het homogenaat oplossen in buffer met een reinigingsmiddel genaamd DDM. Na deze procedure kunnen we ook het hele INAD-eiwitcomplex zuiveren dat kan worden gebruikt om de assemblage- en regulatiemechanismen te bestuderen.Een mogelijke toekomstige toepassing van deze methode zal zijn om de structurele informatie van het endogene Drosophila TRP-kanaal te bestuderen met behulp van Cryo-EM-technieken. Daarnaast is het meten van de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde endogene Drosophila TRP-kanalen in kunstmatig dubbellaags lipidemembraan ook haalbaar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spectrofotometrische screening op potentiële remmers van Cytosolic Glutathione S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...