Name: purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31870746), מענקי מחקר בסיסיים של שנזן (JCYJ20200109140414636), והקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס '2021A1515010796) ל- W. L. אנו מודים ל-LetPub (www.letpub.com) על עזרתה הלשונית במהלך הכנת כתב יד זה.

1. טיהור מקטעי TRP המתויגים ב-GST ושברי NORPA המתויגים שלו
<ol><li>לטהר את שבר TRP 1261-1275 המתויג ב-GST<ol>
<li>הפוך את pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 פלסמיד10 לתאי Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) באמצעות שיטת התמרת הלם חום CaCl2 21. לחסן מושבה בודדת ב 10 מ"ל של לוריא ברטאני בינוני (LB) ולגדול בן ליל?...

<ol>
	<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL.">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode.">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracellular+Ca2++chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors:+the+role+of+Ca2++and+trp.">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li><li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors.">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li><li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system.">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li><li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels:+Ca2++is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient.">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li><li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol.">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).</li><li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line.">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li><li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels.">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075 (2019).</li><li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channel:+The+structural+era.">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191 (2020).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms.">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INAD+scaffold+is+a+dynamic,+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye.">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li><li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exquisitely+specific+PDZ/target+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel.">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc&#946;+binding+in+Drosophila+photo+receptors.">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plc&#946; binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency.">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).</li><li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects.">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li><li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins.">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li><li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+TRP+channels.">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li></ol>

INAD, המכיל חמישה תחומי PDZ, הוא מארגן הליבה של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. מחקרים קודמים הראו כי INAD PDZ3 נקשר לזנב מסוף C של ערוץ TRP עם ספציפיות מעודנת (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 טנדם מקיים אינטראקציה עם שבר NORPA 863-1095 עם זיקת קשירה גבוהה במיוחד (KD = 30 ננומטר). ממצאים אלה מ?...

פוטו-טרנסדוקציה היא תהליך שבו פוטונים נספגים מומרים לקודים חשמליים של נוירונים. הוא מעביר באופן בלעדי אופסינים ואת מפל האיתות המצומד לחלבון G הבא הן אצל בעלי חוליות והן אצל חסרי חוליות. ב-Drosophila, על-ידי שימוש בחמשת תחומי ה-PDZ שלה, פיגום חלבון ההשבתה-ללא-אחרי-פוטנציאל D (INAD) מארגן קומפלקס איתות סופראמולקולרי, המורכב מתעלת פוטנציאל קולטן חולף (TRP), פוספוליפאז Cβ/ללא פוטנציאל קולטן A (PLCβ/NORPA), וחלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC)1. היווצרותו של קומפלקס איתות סופראמולקולרי זה מבטיחה לוקליזציה תת-תאית נכונה, יעילות גבוהה וספציפיות של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. בקומפלקס זה, ערוצי TRP רגישים לאור פועלים כאפקטים במורד הזרם של NORPA ומתווכים את זרם הסידן ואת הדה-פולריזציה של פוטורצפטורים. מחקרים קודמים הראו כי פתיחת ערוץ ה-TRP של דרוזופילה מתווכת על ידי פרוטונים, שיבוש של סביבת השומנים המקומית או כוח מכני 2,3,4. ערוץ ה- TRP של Drosophila מקיים אינטראקציה גם עם calmodulin5 ומווסת על ידי סידן על ידי משוב חיובי ושליליכאחד 6,7,8.
עד כה, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים על מנגנון הגידור של תעלות Drosophila TRP ו-TRP דמויות TRP (TRPL) התבססו על טלאי ממברנה שנכרתה, הקלטות של תאים שלמים מפוטורצפטורים מסוג Drosophila מסוג פרא מנותקים, ותעלות הטרו-ביטוי בתאי S2, SF9 או HEK 2,9,10,11,12,13, אך לא בערוצים מטוהרים. גם המידע המבני של ערוץ ה-TRP Drosophila באורך מלא עדיין אינו ברור. על מנת לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של חלבון מטוהר בסביבת ממברנה משוחזרת ולקבל מידע מבני של תעלת ה- Drosophila TRP באורך מלא, קבלת תעלות TRP מטוהרות באורך מלא היא הצעד הראשון הנחוץ, בדומה למתודולוגיות המשמשות במחקרי תעלות TRP של יונקים 14,15,16,17.
לאחרונה, בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD 18,19,20, פותחה לראשונה אסטרטגיית טיהור זיקה בתוספת תחרות כדי לטהר את תעלת ה-TRP מהומוגנטים של ראש דרוזופילה על ידי חרוזי סטרפטווידין 5. בהתחשב בקיבולת הנמוכה ובהעלות היקרה של חרוזי סטרפטווידין, מוצג כאן פרוטוקול טיהור משופר המשתמש בחלבון הפיתיון המתויג שלו ובחרוזי Ni תואמים בעלות נמוכה עם קיבולת גבוהה בהרבה. השיטה המוצעת תסייע לחקור את מנגנון ה-gating של תעלת ה-TRP מזוויות מבניות ולמדוד את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלת ה-TRP באמצעות חלבונים מטוהרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>Protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.melanogaster: W1118 strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>BDSC:3605</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/30/40 mesh stainless steel sieves</td>
			<td>Jiufeng metal mesh company</td>
			<td>GB/T6003.1</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>A3291</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HC2005</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05892953001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100472-0025</td>
			<td>SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A620058-0100</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500838-0500</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610235-0005</td>
			<td>SDS-PAGE buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17513202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0001</td>
			<td>Elution buffer preparation for Ni-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600168-0025</td>
			<td>Induction of protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002-0250</td>
			<td>E.coli. cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G4251-100G</td>
			<td>Elution buffer preparation for Glutathione beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-Sepharose excel beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17371202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610424-001</td>
			<td>Detergent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T9281-100ML</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607008-0500</td>
			<td>Homogenization buffer for E.coli. cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>P0754-25G</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26619/26616</td>
			<td>Prestained protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (preparation grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28989336</td>
			<td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (analytical grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500228-0001</td>
			<td>SDS-PAGE gel/buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1503-10KG</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096/801096</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td>APX-60</td>
			<td>Metage of Drosophila head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0015</td>
			<td>TRP protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0017</td>
			<td>Bait and competitor protein purification from E.coli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td>
			<td>SDS-PAGE imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti J-26 XP</td>
			<td>Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>UNION-BIOTECH</td>
			<td>UH-05</td>
			<td>Homogenization of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen tank</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>CX-100</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>AKTA purifier</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80&#176;C)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>900GP</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>MAPADA</td>
			<td>UV-1200</td>
			<td>OD600 measurement of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels

פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה היא אחד ממסלולי האיתות המצומדים לחלבון G המהירים ביותר הידועים. כדי להבטיח את הספציפיות והיעילות של מפל זה, תעלת הקטיון החדירה של הסידן (Ca2+), פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP), נקשרת בחוזקה לחלבון הפיגום, D (INAD) ללא הפסקה-ללא-אחרי-פוטנציאל, ויוצרת קומפלקס גדול של חלבון איתות עם חלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC) ופוטנציאל פוספוליפאז Cβ/No קולטן A (PLCβ/NORPA). עם זאת, התכונות הביוכימיות של ערוץ ה- TRP של דרוזופילה עדיין אינן ברורות. בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD, פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה שונה בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני. ראשית, שבר ההיסטידין המטוהר (שלו) מתויג NORPA 863-1095 נקשר לחרוזי Ni ושימש כפיתיון למשיכת קומפלקס חלבון INAD אנדוגני מראש דרוזופילה הומוגנטים. לאחר מכן, גלוטתיון S-transferase (GST) מטוהר יתר על המידה מתויג TRP 1261-1275 קטע נוסף ל- Ni-beads כדי להתחרות בערוץ TRP. לבסוף, תעלת ה-TRP בסופר-נטנט הופרדה מהפפטיד המוגזם TRP 1261-1275 על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. שיטה זו מאפשרת לחקור את מנגנון הגטינג של תעלת ה-TRP Drosophila מזוויות ביוכימיות ומבניות כאחד. את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלות TRP דרוזופילה מטוהרות ניתן למדוד גם בעתיד.

במאמר זה, שיטת טיהור חלבונים מוכחת כדי לטהר את ערוץ ה-TRP האנדוגני Drosophila (איור 1).
ראשית, ביטוי וטיהור חלבונים רקומביננטיים מיושמים כדי להשיג את הפיתיון ואת החלבונים המתחרים. לאחר מכן, מקטע TRP 1261-1275 המתויג ב-GST מבוטא בתאי E. coli BL21 (DE3) במדיום LB ומטוהר באמצע?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels at JoVE.com

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את תהליך הטיהור כדי להשיג תעלות TRP מטוהרות באורך מלא, שהוא הצעד הראשון ההכרחי לחקר תכונות אלקטרופיזיולוגיות, ולקבל מידע מבני של ערוץ ה- Drosophila TRP באורך מלא. בהתבסס על מנגנון הדגימה של קומפלקס החלבון INAD ושימוש בחרוזי ניקל בעלות נמוכה עם קיבולת גבוהה בהרבה, ניתן לטהר כמות מספקת של תעלות TRP מראשי זבובים. מי שידגים את ההליך יהיה יו-יאנג ליו, טכנאי מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל, להפוך את pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 פלסמיד לתאי E.coli BL21, באמצעות שיטת התמרת הלם חום סידן כלוריד. לחסן מושבה אחת ב 10 מיליליטרים של מדיום לוריא ברטאני, ולגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו את 10 המיליליטרים של תרבות הזריעה לליטר אחד של מדיום לוריא ברטאני ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שהצפיפות האופטית של התאים מגיעה ל-0.5, קררו את התאים ל-16 מעלות צלזיוס, והוסיפו 0.1 מילימולר איזופרופיל-בטא-D-1-תיוגאלאקטופירנוזיד. לאחר הבעת יתר, גלולה ליטר אחד של תאים בתרבית על ידי צנטריפוגה, ו resuspend ב 40 מיליליטר של מלוחים חצוצר פוספט. טען את התאים ההזויים לתוך הומוגנייזר בלחץ גבוה, מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס.לאט לאט להגדיל את לחץ הומוגנייזר ל 800 בר. פתח את לשונית הכניסה ותן לתאים המוחזרים לעבור באופן מעגלי דרך שסתום עם חריצים צרים. טענו חמישה מיליליטרים של חרוזי גלוטתיון לעמוד זרימת כבידה, ושטפו את החרוזים ב-50 מיליליטרים של חיץ מלוחים בעל מאגר מלוחים בעל מאגרי פוספט, בסך הכל שלוש פעמים.צנטריפוגה התא ליזט מההומוגנייזר בלחץ גבוה ב-48, 384 פעמים G.הוסף כ-40 מיליליטרים של הסופרנאטנט של התא הצנטריפוגי ליאזט לחרוזי הגלוטתיון המשוזבים בעמוד זרימת הכבידה, ודגירה במשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בצעו החייאה של חרוזי הגלוטתיון כל 10 דקות. לאחר 30 דקות של דגירה, פתח את לשונית יציאת העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה.השליכו את השבר העובר דרך הזרימה, ושטפו פעמיים את חרוזי הגלוטתיון הנותרים, עם 50 מיליליטרים של חיץ מלוחים בעל מאגרי פוספטים. מוסיפים 15 מיליליטרים של חיץ אלוטיון לחרוזי הגלוטתיון, ומחזירים את החרוזים כל 10 דקות. אלחזרו את שבר TRP 1261-1275 המתויג ב-GST לצינור חרוטי של 50 מ"ל, וטענו אותו לעמודת אי-הכללת גודל.אספו חמישה מיליליטרים של החלבונים המבוקרים לכל צינור, ותרכזו את השברים המטוהרים למיליליטר אחד על ידי צנטריפוגה בעמודת ספין אולטרה-סינון בצנטריפוגה מקוררת. כדי לטהר את קטע NORPA 863-1095 המתויג שלו, בצע את הנוהל שהודגם בעבר באמצעות חרוזי ניקל. אספו זבובים בוגרים בצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מיליליטר, והקפיאו אותם בחנקן נוזלי למשך 10 דקות.לנער במרץ את הצינורות הקפואים ביד ולהעביר את התערובת לשלוש מסננות נירוסטה, שנערמו ברצף, מקוררות מראש. מנענעים את המסננות, ומטאטאים את ראשי הזבובים מהמסננת בת 40 הרשת באמצעות מברשת. מעבירים אותם לחמישה צינורות חרוטיים מיליליטר ומאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.הומוגניזציה של 0.5 גרם ראשים בחנקן נוזלי באמצעות טיט מקורר מראש ומזיק. ממיסים את הראשים ההומוגניים בחמישה מיליליטרים של חיץ ליזיס 10X, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20, 817 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסופרנטנט הסיבובי הוא צנטריפוגה נוספת 100, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.מוסיפים מיליליטר אחד של חרוזי ניקל לעמוד זרימת הכבידה, ושוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים בארבע מעלות צלזיוס. שיווי משקל את החרוזים עם 10 כרכים טורים של מאגר ליזיס, שלוש פעמים בארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 600 מיקרומולרים שטוהרו על ידי חלבון NORPA 863-1095 המתויג שלו לעמודת הניקל, והדגמו את העמודה.בצעו החייאה של החרוזים כל 10 דקות. פתחו את ברז היציאה של העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה, ושטפו את חרוזי הניקל ב-10 מיליליטרים של חיץ ליזיס קר. לאחר מכן, הוסיפו סופרנאטנט קר של ראש דרוזופילה הומוגנט לעמוד הניקל.לאחר הדגירה, לשטוף את החרוזים עם 10 מיליליטרים של מאגר lysis ולהוסיף 500 microliters של 600 מיקרומולר GST מתויג TRP 1261-1275 חלבון לתוך החרוזים. לאסוף את השבר הסמוי מעמודת הכבידה. לשטוף את חרוזי ניקל עם 10 מיליליטר של חיץ מחייב.לאחר מכן, הוסף חיץ אלוטיון ואסוף את שבר האלוטיון מעמודת זרימת הכבידה. רכז את השברים שהתחמקו מטיהור תעלות TRP של Drosophila, באמצעות עמודת ספין אולטרה-סינון של ארבעה מיליליטר. הזריקו את הדגימה לעמודת אי-הכללת הגודל, והוסיפו לחלבונים קצב זרימה סביר.מקטע TRP 1261-1275 המתויג ב-GST התבטא בתאי E.coli וטוהר באמצעות חרוזי גלוטתיון ועמודת הרחקת גודל. באופן דומה, הקטע NORPA 863-1095 המתויג שלו הובטא וטוהר באמצעות חרוזי ניקל ועמודת הרחקת גודל. תעלת ה-TRP המרופטת מופרדת מהפפטיד TRP 1261-1275 המתויג יתר על המידה ב-GST, על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל.כתוצר לוואי, קומפלקסים INAD, ePKC, NORPA 863-1095 מתקבלים לאחר תחרות פפטידים TRP 1261-1275. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים את הפרוטוקול הזה, הוא הומוגניזציה של ראשי הזבובים בחנקן נוזלי ולפתור את ההומוגנט בחיץ המכיל חומר ניקוי בשם DDM. בעקבות הליך זה, אנו יכולים גם לטהר את כל קומפלקס החלבון INAD אשר ניתן להשתמש בו כדי לחקור את מנגנוני ההרכבה והוויסות שלו.יישום עתידי פוטנציאלי של שיטה זו יהיה ללמוד את המידע המבני של ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila באמצעות טכניקות Cryo-EM. בנוסף, מדידת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלות TRP דרוזופילה אנדוגניות מטוהרות בקרום שומנים דו-שכבתי מלאכותי אפשרי גם כן.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

הקרנה ספקטרופוטומטרית עבור מעכבים פוטנציאליים של גלוטתיון ציטוסולי S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...