Name: purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) e Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (n. 2021A1515010796) a W. L. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.

1. Purificazione di TRP con tag GST e frammenti NORPA con tag His
<ol><li>Purificare il frammento TRP 1261-1275 con tag GST<ol>
<li>Trasformare il plasmide 10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 in celle Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 mL di terreno di Luria Bertani (LB) e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare i 10 mL ...

<ol>
	<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL.">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode.">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracellular+Ca2++chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors:+the+role+of+Ca2++and+trp.">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li><li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors.">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li><li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system.">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li><li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels:+Ca2++is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient.">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li><li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol.">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).</li><li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line.">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li><li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels.">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075 (2019).</li><li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channel:+The+structural+era.">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191 (2020).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms.">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INAD+scaffold+is+a+dynamic,+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye.">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li><li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exquisitely+specific+PDZ/target+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel.">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc&#946;+binding+in+Drosophila+photo+receptors.">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plc&#946; binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency.">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).</li><li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects.">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li><li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins.">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li><li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+TRP+channels.">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li></ol>

INAD, che contiene cinque domini PDZ, è l'organizzatore principale del macchinario di fototrasduzione Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che INAD PDZ3 si lega al canale TRP C-terminale coda con squisita specificità (KD = 0,3 μM)18. Il tandem INAD PDZ45 interagisce con il frammento NORPA 863-1095 con un'affinità di legame estremamente elevata (KD = 30 nM). Questi risultati forniscono una solida base biochimica per progettare la purificazione dell'affini...

La fototrasduzione è un processo in cui i fotoni assorbiti vengono convertiti in codici elettrici dei neuroni. Trasmette esclusivamente opsine e la successiva cascata di segnalazione accoppiata alla proteina G sia nei vertebrati che negli invertebrati. In Drosophila, utilizzando i suoi cinque domini PDZ, l'inattivazione della proteina scaffold-no-after-potential D (INAD) organizza un complesso di segnalazione supramolecolare, che consiste in un canale del potenziale recettore transitorio (TRP), potenziale del recettore Cβ / No della fosfolipasi A (PLCβ / NORPA) e chinasi C (ePKC) specifica dell'occhio. La formazione di questo complesso di segnalazione supramolecolare garantisce la corretta localizzazione subcellulare, l'alta efficienza e la specificità del macchinario di fototrasduzione Drosophila. In questo complesso, i canali TRP sensibili alla luce agiscono come effettori a valle del NORPA e mediano l'afflusso di calcio e la depolarizzazione dei fotorecettori. Studi precedenti hanno dimostrato che l'apertura del canale TRP di Drosophila è mediata da protoni, interruzione dell'ambiente lipidico locale o forza meccanica 2,3,4. Il canale Drosophila TRP interagisce anche con calmodulina5 ed è modulato dal calcio con feedback sia positivo che negativo 6,7,8.
Finora, gli studi di elettrofisiologia sul meccanismo di gating dei canali Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) erano basati su patch di membrana asportate, registrazioni di cellule intere da fotorecettori Drosophila wild-type dissociati e canali etero-espressi in cellule S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, ma non su canali purificati. Anche le informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera rimangono poco chiare. Al fine di studiare le proprietà elettrofisiologiche della proteina purificata in un ambiente di membrana ricostituito e di ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera, ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera è il primo passo necessario, simile alle metodologie utilizzate negli studi sui canali TRP dei mammiferi 14,15,16,17.
Recentemente, sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD 18,19,20, è stata sviluppata per la prima volta una strategia di purificazione dell'affinità più competizione per purificare il canale TRP dagli omogeneizzati della testa di Drosophila da perline di streptavidina 5. Considerando la bassa capacità e il costo costoso delle perle di streptavidina, qui viene introdotto un protocollo di purificazione migliorato che utilizza la proteina esca his-tagged e le corrispondenti perle Ni a basso costo con capacità molto più elevata. Il metodo proposto aiuterà a studiare il meccanismo di gating del canale TRP da angoli strutturali e a misurare le proprietà elettrofisiologiche del canale TRP con proteine purificate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>Protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.melanogaster: W1118 strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>BDSC:3605</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/30/40 mesh stainless steel sieves</td>
			<td>Jiufeng metal mesh company</td>
			<td>GB/T6003.1</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>A3291</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HC2005</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05892953001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100472-0025</td>
			<td>SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A620058-0100</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500838-0500</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610235-0005</td>
			<td>SDS-PAGE buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17513202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0001</td>
			<td>Elution buffer preparation for Ni-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600168-0025</td>
			<td>Induction of protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002-0250</td>
			<td>E.coli. cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G4251-100G</td>
			<td>Elution buffer preparation for Glutathione beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-Sepharose excel beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17371202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610424-001</td>
			<td>Detergent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T9281-100ML</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607008-0500</td>
			<td>Homogenization buffer for E.coli. cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>P0754-25G</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26619/26616</td>
			<td>Prestained protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (preparation grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28989336</td>
			<td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (analytical grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500228-0001</td>
			<td>SDS-PAGE gel/buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1503-10KG</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096/801096</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td>APX-60</td>
			<td>Metage of Drosophila head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0015</td>
			<td>TRP protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0017</td>
			<td>Bait and competitor protein purification from E.coli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td>
			<td>SDS-PAGE imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti J-26 XP</td>
			<td>Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>UNION-BIOTECH</td>
			<td>UH-05</td>
			<td>Homogenization of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen tank</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>CX-100</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>AKTA purifier</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80&#176;C)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>900GP</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>MAPADA</td>
			<td>UV-1200</td>
			<td>OD600 measurement of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels

La fototrasduzione della drosophila è una delle vie di segnalazione accoppiate alla proteina G più veloci conosciute. Per garantire la specificità e l'efficienza di questa cascata, il canale cationico permeabile al calcio (Ca2+), il potenziale recettore transitorio (TRP), si lega strettamente alla proteina dello scaffold, all'inattivazione-no-after-potential D (INAD) e forma un grande complesso proteico di segnalazione con proteina chinasi C (ePKC) specifica per l'occhio e fosfolipasi Cβ / Nessun potenziale recettore A (PLCβ / NORPA). Tuttavia, le proprietà biochimiche del canale TRP Drosophila rimangono poco chiare. Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale TRP endogeno. In primo luogo, il frammento NORPA 863-1095 purificato con istidina (His) è stato legato a Ni-beads e utilizzato come esca per abbattere il complesso proteico INAD endogeno dagli omogeneizzati della testa di Drosophila. Quindi, un eccessivo frammento di glutatione S-transferasi (GST) purificato con tag TRP 1261-1275 è stato aggiunto alle ni-perline per competere con il canale TRP. Infine, il canale TRP nel surnatante è stato separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo metodo consente di studiare il meccanismo di gating del canale Drosophila TRP sia da angolazioni biochimiche che strutturali. Le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP di Drosophila purificati possono anche essere misurate in futuro.

In questo articolo, viene dimostrato un metodo di purificazione delle proteine per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP (Figura 1).
In primo luogo, l'espressione e la purificazione delle proteine ricombinanti vengono applicate per ottenere l'esca e le proteine concorrenti. Quindi, un frammento TRP 1261-1275 con tag GST viene espresso in cellule E. coli BL21 (DE3) in mezzo LB e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di ...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels at JoVE.com

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.

Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

In questo protocollo, dimostriamo il processo di purificazione per ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera, che è il primo passo necessario per studiare le proprietà elettrofisiologiche e ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera. Sulla base del meccanismo di campionamento del complesso proteico INAD e utilizzando perle di nichel a basso costo con capacità molto più elevata, una quantità sufficiente di canali TRP può essere purificata dalle teste di mosca. A dimostrare la procedura sarà Yuyang Liu, un tecnico del nostro laboratorio.Per iniziare, trasformare il plasmide pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 in cellule E.coli BL21, utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico del cloruro di calcio. Inoculare una singola colonia in 10 millilitri di Luria Bertani medium, e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere i 10 millilitri di coltura di semina in un litro di Luria Bertani medium e incubare a 37 gradi Celsius.Dopo che la densità ottica delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 gradi Celsius e aggiungere 0,1 millimolari isopropil-beta-D-1-tiogalattopoliranoside. Dopo la sovraespressione, pellet un litro di cellule coltivate per centrifugazione e risospeso in 40 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Caricare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius.Aumentare lentamente la pressione dell'omogeneizzatore a 800 bar. Aprire la linguetta di ingresso e lasciare che le celle risospese passino circolarmente attraverso una valvola con fessure strette. Caricare cinque millilitri di perline di glutatione in una colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 50 millilitri di tampone salino tamponato con fosfato, per un totale di tre volte.Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48, 384 volte G.Aggiungere circa 40 millilitri del surnatante del lisato cellulare centrifugato alle perle di glutatione equilibrate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Sospendere le perle di glutatione ogni 10 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, aprire la linguetta di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso.Scartare la frazione di flusso e risciacquare due volte le restanti perle di glutatione, con 50 millilitri di tampone salino tamponato con fosfato. Aggiungere 15 millilitri di tampone di eluizione alle perle di glutatione e risospesciare le perline ogni 10 minuti. Eluire il frammento TRP 1261-1275 con tag GST in un tubo conico da 50 ml e caricarlo in una colonna di esclusione delle dimensioni.Raccogliere cinque millilitri delle proteine eluite per tubo e concentrare i frammenti purificati in un millilitro mediante centrifugazione in una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione in una centrifuga refrigerata. Per purificare il frammento NORPA 863-1095 con etichetta His, seguire la procedura precedentemente dimostrata utilizzando perline di nichel. Raccogliere mosche adulte in tubi centrifughi conici da 50 millilitri e congelarli in azoto liquido per 10 minuti.Agitare vigorosamente i tubi congelati a mano e trasferire la miscela su tre setacci in acciaio inossidabile impilati in sequenza e preraffreddati. Agitare i setacci e spazzare via le teste di mosca dal setaccio a 40 maglie usando un pennello. Trasferirli in cinque tubi conici millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius.Omogeneizzare 0,5 grammi di teste in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello pre-raffreddati. Sciogliere le teste omogeneizzate in cinque millilitri di tampone di lisi 10X, seguito da centrifugazione a 20, 817 volte G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Il surnatante spin down viene ulteriormente centrifugato 100.000 volte G a quattro gradi Celsius per 60 minuti.Aggiungere un millilitro di perline di nichel nella colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline tre volte con 10 millilitri di acqua a doppia distillazione a quattro gradi Celsius. Equilibrare le perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi, tre volte a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di 600 micromolari purificati his-tagged proteina NORPA 863-1095 nella colonna di nichel e incubare la colonna.Sospendere le perline ogni 10 minuti. Aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso e lavare le perle di nichel con 10 millilitri di tampone di lisi fredda. Quindi, aggiungere il surnatante freddo di omologenato della testa di Drosophila nella colonna di nichel.Dopo l'incubazione, lavare le perline con 10 millilitri di tampone di lisi e aggiungere 500 microlitri di 600 micromolari gst-tagged TRP 1261-1275 proteina nelle perline. Raccogliere la frazione eluita dalla colonna di gravità. Lavare le perle di nichel con 10 millilitri di tampone legante.Quindi, aggiungere il tampone di eluizione e raccogliere la frazione di eluizione dalla colonna del flusso di gravità. Concentrare le frazioni eluite dalla purificazione del canale TRP di Drosophila, utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da quattro millilitri. Iniettare il campione nella colonna di esclusione delle dimensioni ed eluire le proteine con una portata ragionevole.Il frammento TRP 1261-1275 con tag GST è stato espresso in cellule di E.coli e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di esclusione delle dimensioni. Allo stesso modo, il frammento NORPA 863-1095 con tag His è stato espresso e purificato utilizzando perline di nichel e colonna di esclusione delle dimensioni. Il canale TRP eluito è separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 marcato con GST, per cromatografia di esclusione dimensionale.Come sottoprodotto, i complessi INAD, ePKC, NORPA 863-1095 sono ottenuti dopo la competizione peptidica TRP 1261-1275. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo, è omogeneizzare le teste di mosca in azoto liquido e risolvere l'omogeneizzato in tampone contenente un detergente chiamato DDM. Seguendo questa procedura, possiamo anche purificare l'intero complesso proteico INAD che può essere utilizzato per studiarne i meccanismi di assemblaggio e regolazione.Una potenziale applicazione futura di questo metodo sarà quella di studiare le informazioni strutturali del canale Endogeno Drosophila TRP utilizzando tecniche Cryo-EM. Inoltre, è anche possibile misurare le proprietà elettrofisiologiche dei canali Endogeni Drosophila TRP purificati nella membrana lipidica a doppio strato artificiale.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Ricerca

Biochimica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Screening spettrofotometrico per potenziali inibitori di Glutathione Cytosolic S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...