Name: purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (제 31870746 호), 심천 기본 연구 보조금 (JCYJ20200109140414636) 및 중국 광동성 자연 과학 재단 (No. 2021A1515010796)이 W. L. L. 이 원고를 준비하는 동안 언어 적 도움을 주신 LetPub (www.letpub.com)에게 감사드립니다.

1. GST 태깅된 TRP 및 그의 태그된 NORPA 단편의 정제
<ol><li>GST 태그 TRP 1261-1275 단편 정화<ol>
<li>pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 플라스미드10을 CaCl2 열충격형질전환 방법 21을 이용하여 대장균(E. coli) BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 10 mL의 루리아 베르타니(LB) 배지에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 37°C...

<ol>
	<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL.">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode.">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracellular+Ca2++chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors:+the+role+of+Ca2++and+trp.">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li><li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors.">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li><li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system.">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li><li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels:+Ca2++is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient.">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li><li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol.">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).</li><li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line.">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li><li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels.">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075 (2019).</li><li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channel:+The+structural+era.">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191 (2020).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms.">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INAD+scaffold+is+a+dynamic,+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye.">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li><li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exquisitely+specific+PDZ/target+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel.">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc&#946;+binding+in+Drosophila+photo+receptors.">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plc&#946; binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency.">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).</li><li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects.">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li><li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins.">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li><li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+TRP+channels.">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li></ol>

다섯 개의 PDZ 도메인을 포함하는 INAD는 초파리 광전달 기계의 핵심 조직자입니다. 이전의 연구는 INAD PDZ3이 절묘한 특이성(KD = 0.3 μM)18을 갖는 TRP 채널 C 말단 꼬리에 결합한다는 것을 보여주었다. INAD PDZ45 탠덤은 매우 높은 결합 친화도(KD = 30 nM)를 갖는 NORPA 863-1095 단편과 상호작용한다. 이러한 발견은 친화성 정제와 경쟁 전략을 설계하기 위한 견고한 생화?...

광전달은 흡수된 광자가 뉴런의 전기 코드로 변환되는 과정입니다. 그것은 독점적으로 척추 동물과 무척추 동물 모두에서 옵신과 다음 G 단백질 결합 신호 전달 캐스케이드를 전달합니다. 초파리에서, 그의 다섯 PDZ 도메인을 사용하여, 스캐폴드 단백질 불활성화-없음-사후 전위 D(INAD)는 일시적인 수용체 전위(TRP) 채널, 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA) 및 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC)1로 구성된 초분자 신호전달 복합체를 조직한다. 이 초분자 신호 복합체의 형성은 Drosophila 광전달 기계의 정확한 세포 내 국소화, 고효율 및 특이성을 보장합니다. 이 복합체에서 빛에 민감한 TRP 채널은 NORPA의 하류 이펙터 역할을하며 칼슘 유입과 광수용체의 탈분극을 매개합니다. 이전의 연구는 초파리 TRP 채널의 개방이 양성자, 국소 지질 환경의 파괴 또는 기계적 힘 2,3,4에 의해 매개된다는 것을 보여주었습니다. 초파리 TRP 채널은 또한 calmodulin 5와 상호 작용하며 긍정적 인 피드백과 부정적인 피드백 6,7,8 모두에 의해 칼슘에 의해 변조됩니다.
지금까지 초파리 TRP 및 TRP 유사 (TRPL) 채널의 게이팅 메커니즘에 대한 전기 생리학 연구는 절제된 막 패치, 해리 된 야생형 초파리 광수용체로부터의 전체 세포 기록 및 S2, SF9 또는 HEK 세포 2,9,10,11,12,13의 헤테로 발현 채널을 기반으로했지만 정제 된 채널에서는 그렇지 않았습니다. 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보도 불분명하다. 재구성된 막 환경에서 정제된 단백질의 전기생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조적 정보를 얻기 위해, 정제된 전장 TRP 채널을 얻는 것은 포유동물 TRP 채널 연구14,15,16,17에서 사용된 방법론과 유사한 첫 번째 단계이다.
최근에, INAD 단백질 복합체18,19,20의 조립 메카니즘에 기초하여, 스트렙타비딘 비드5에 의해 초파리 머리 균질물로부터 TRP 채널을 정제하기 위해 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 처음 개발되었다. 스트렙타비딘 비드의 낮은 용량과 비싼 비용을 고려하여, His-태깅된 미끼 단백질과 훨씬 더 높은 용량의 상응하는 저가의 Ni-비드를 사용하는 개선된 정제 프로토콜이 여기에 도입된다. 제안된 방법은 구조적 각도에서 TRP 채널의 게이팅 메카니즘을 연구하고 정제된 단백질로 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 데 도움이 될 것이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>Protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.melanogaster: W1118 strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>BDSC:3605</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/30/40 mesh stainless steel sieves</td>
			<td>Jiufeng metal mesh company</td>
			<td>GB/T6003.1</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>A3291</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HC2005</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05892953001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100472-0025</td>
			<td>SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A620058-0100</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500838-0500</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610235-0005</td>
			<td>SDS-PAGE buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17513202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0001</td>
			<td>Elution buffer preparation for Ni-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600168-0025</td>
			<td>Induction of protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002-0250</td>
			<td>E.coli. cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G4251-100G</td>
			<td>Elution buffer preparation for Glutathione beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-Sepharose excel beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17371202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610424-001</td>
			<td>Detergent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T9281-100ML</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607008-0500</td>
			<td>Homogenization buffer for E.coli. cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>P0754-25G</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26619/26616</td>
			<td>Prestained protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (preparation grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28989336</td>
			<td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (analytical grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500228-0001</td>
			<td>SDS-PAGE gel/buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1503-10KG</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096/801096</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td>APX-60</td>
			<td>Metage of Drosophila head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0015</td>
			<td>TRP protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0017</td>
			<td>Bait and competitor protein purification from E.coli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td>
			<td>SDS-PAGE imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti J-26 XP</td>
			<td>Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>UNION-BIOTECH</td>
			<td>UH-05</td>
			<td>Homogenization of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen tank</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>CX-100</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>AKTA purifier</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80&#176;C)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>900GP</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>MAPADA</td>
			<td>UV-1200</td>
			<td>OD600 measurement of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels

초파리 광형질도입은 가장 빠르게 알려진 G 단백질 결합 신호전달 경로 중 하나이다. 이 캐스케이드의 특이성과 효율을 보장하기 위해, 칼슘 (Ca2+)-투과성 양이온 채널, 일시적 수용체 전위 (TRP)는 스캐폴드 단백질에 긴밀하게 결합하고, 불활성화-불활성화-무-전위 D(INAD), 그리고 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC) 및 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA)와 함께 큰 신호전달 단백질 복합체를 형성한다. 그러나 초파리 TRP 채널의 생화학 적 특성은 불분명하다. INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 내인성 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다. 먼저, 정제된 히스티딘 (His)-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 Ni-비드에 결합시키고, 초파리 머리 균질물로부터 내인성 INAD 단백질 복합체를 끌어내리기 위한 미끼로 사용하였다. 이어서, 과량의 정제된 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 TRP 채널과 경쟁하기 위해 Ni-비드에 첨가하였다. 마지막으로, 상청액 내의 TRP 채널을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리하였다. 이 방법은 생화학 적 및 구조적 각도 모두에서 초파리 TRP 채널의 게이팅 메커니즘을 연구 할 수있게합니다. 정제된 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성은 또한 미래에 측정될 수 있다.

이 기사에서는 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하는 단백질 정제 방법을 시연합니다 (그림 1).
먼저, 재조합 단백질 발현 및 정제가 미끼 및 경쟁자 단백질을 얻기 위해 적용된다. 이어서, GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 LB 배지의 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다 (?...

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Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

이 프로토콜에서는 전기 생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 얻는 데 필요한 첫 번째 단계인 정제된 전장 TRP 채널을 얻기 위한 정제 과정을 시연합니다. INAD 단백질 복합체의 샘플링 메카니즘에 기초하고 훨씬 더 높은 용량의 저가의 니켈 비드를 사용하여, 충분한 양의 TRP 채널이 플라이 헤드로부터 정제될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 Yuyang Liu가 될 것입니다.먼저, 염화칼슘 열충격 형질전환 방법을 이용하여 pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 플라스미드를 E.coli BL21 세포로 형질전환시킨다. Luria Bertani 배지 10 밀리리터에 단일 식민지를 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다. 10 밀리리터의 시딩 배양물을 Luria Bertani 배지 1 리터에 넣고 섭씨 37도에서 배양하십시오.세포의 광학 밀도가 0.5에 도달 한 후 세포를 섭씨 16도까지 냉각시키고 0.1 밀리몰 이소프로필 - 베타 -D-1- 티오갈락토피라노사이드를 첨가하십시오. 과발현 후, 원심분리에 의해 배양된 세포를 한 리터 펠릿하고, 40 밀리리터의 포스페이트 완충 식염수에 재현탁시켰다. 재현탁 된 세포를 고압 균질 기에 넣고 섭씨 네 도까지 미리 냉각하십시오.천천히 호모게나이저 압력을 800 bar로 증가시킨다. 입구 탭을 열고 재현탁 된 셀이 좁은 슬릿이있는 밸브를 원형으로 통과하도록하십시오. 글루타티온 비드 5 밀리리터를 중력 흐름 컬럼에 적재하고 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수 완충액으로 비드를 총 세 번 세척하십시오.48, 384배 G.에서 고압 호모게나이저로부터 세포 용해물을 원심분리하고, 원심분리된 세포 용해물의 상등액 약 40 밀리리터를 중력 유동 컬럼 내의 평형화된 글루타티온 비드에 첨가하고, 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 글루타티온 비드를 10분마다 재현탁합니다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다.유동 분획을 버리고, 나머지 글루타티온 비드를 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수 완충액으로 두 번 헹구십시오. 글루타티온 비드에 15 밀리리터의 용출 완충액을 첨가하고, 10분마다 비드를 재현탁시킨다. GST 태그가 지정된 TRP 1261-1275 단편을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 크기 배제 컬럼에 로딩한다.튜브 당 다섯 밀리리터의 용출된 단백질을 수집하고, 냉장 원심분리기의 한외여과 스핀 컬럼에서 원심분리하여 정제된 단편을 하나의 밀리리터로 농축시킨다. His-tagged NORPA 863-1095 단편을 정제하려면 니켈 비드를 사용하여 이전에 입증된 절차를 따르십시오. 성인 파리를 50 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에 모으고 액체 질소에서 10 분 동안 동결시킵니다.얼어 붙은 튜브를 손으로 격렬하게 흔들고 혼합물을 순차적으로 쌓인 세 개의 미리 냉각 된 스테인레스 스틸 체로 옮깁니다. 체를 흔들고 브러시를 사용하여 40 메쉬 체에서 플라이 헤드를 닦아냅니다. 다섯 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮겨 영하 80도에 보관하십시오.미리 냉각 된 모르타르와 유모차를 사용하여 액체 질소에서 0.5 그램의 머리를 균질화하십시오. 균질화된 헤드를 5밀리리터의 10X 용해 완충액에 용해시키고, 섭씨 4도에서 20, 817배 G에서 20분 동안 원심분리하였다. 스핀 다운 상청액을 섭씨 4도에서 60분 동안 100, 000배 G로 더 원심분리한다.중력 흐름 컬럼에 니켈 비드 1 밀리리터를 넣고 섭씨 4도에서 이중 증류수 10 밀리리터로 비드를 세 번 씻으십시오. 구슬을 섭씨 네 도에서 세 번 10 컬럼 부피의 용해 버퍼로 평형화하십시오. 500 마이크로리터의 600 마이크로몰 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질을 니켈 컬럼에 첨가하고, 컬럼을 인큐베이션한다.10 분마다 구슬을 재현탁하십시오. 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 스루 분획을 분리하고, 니켈 비드를 10 밀리리터의 냉 용해 완충액으로 세척한다. 그런 다음 Drosophila head homogenate의 차가운 상청액을 니켈 컬럼에 첨가하십시오.인큐베이션 후, 비드를 10 밀리리터의 용해 완충액으로 세척하고 500 마이크로리터의 600 마이크로몰 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단백질을 비드에 첨가한다. 중력 컬럼으로부터 용출된 분획을 수집한다. 니켈 비드를 10 밀리리터의 결합 완충액으로 씻으십시오.그런 다음, 용출 완충액을 첨가하고, 중력 유동 컬럼으로부터 용출 분획을 수집한다. 초파리 TRP 채널 정제로부터 용출된 분획을 네 밀리리터 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축한다. 샘플을 크기 배제 컬럼에 주입하고, 합리적인 유속으로 단백질을 용출시킨다.GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 E.coli 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다. 유사하게, His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 니켈 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 발현되고 정제되었다. 용출된 TRP 채널은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 GST 태깅된 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리된다.부산물로서, INAD, ePKC, NORPA 863-1095 복합체는 TRP 1261-1275 펩티드 경쟁 후에 수득된다. 이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 액체 질소에서 플라이 헤드를 균질화하고 DDM이라는 세제를 함유 한 완충액에서 균질액을 해결하는 것입니다. 이 절차에 따라, 우리는 또한 조립 및 조절 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 전체 INAD 단백질 복합체를 정제 할 수 있습니다.이 방법의 잠재적 인 향후 적용은 Cryo-EM 기술을 사용하여 내인성 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 연구하는 것입니다. 또한, 인공 이중층 지질막에서 정제된 내인성 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 것도 실현 가능하다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

연구

생화학

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

세포성 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 잠재적 억제제에 대한 분광측정 검사

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...