Name: purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (No. 2021A1515010796) a W. L. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.

1. Purificación de fragmentos de TRP etiquetados con GST y NORPA con su etiqueta
<ol><li>Purificar el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST<ol>
<li>Transformar el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 en células de Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl2 21. Inocular una sola colonia en 10 mL de Luria Bertani (LB) mediana y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, am...

<ol>
	<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL.">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode.">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intracellular+Ca2++chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors:+the+role+of+Ca2++and+trp.">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li><li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors.">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li><li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system.">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li><li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels:+Ca2++is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient.">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li><li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol.">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).</li><li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line.">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li><li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels.">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075 (2019).</li><li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channel:+The+structural+era.">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191 (2020).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms.">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INAD+scaffold+is+a+dynamic,+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye.">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li><li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exquisitely+specific+PDZ/target+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel.">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc&#946;+binding+in+Drosophila+photo+receptors.">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plc&#946; binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency.">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).</li><li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects.">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li><li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins.">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li><li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+TRP+channels.">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li></ol>

INAD, que contiene cinco dominios PDZ, es el organizador central de la maquinaria de fototransducción Drosophila. Estudios previos demostraron que INAD PDZ3 se une a la cola terminal C del canal TRP con una especificidad exquisita (KD = 0,3 μM)18. El tándem INAD PDZ45 interactúa con el fragmento NORPA 863-1095 con una afinidad de unión extremadamente alta (KD = 30 nM). Estos hallazgos proporcionan una base bioquímica sólida para diseñar la estrategia de purif...

La fototransducción es un proceso en el que los fotones absorbidos se convierten en códigos eléctricos de las neuronas. Transmite exclusivamente opsinas y la siguiente cascada de señalización acoplada a proteína g tanto en vertebrados como en invertebrados. En Drosophila, mediante el uso de sus cinco dominios PDZ, la inactivación de la proteína de andamio-no-después del potencial D (INAD) organiza un complejo de señalización supramolecular, que consiste en un canal de potencial de receptor transitorio (TRP), potencial de receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA) y proteína quinasa C específica del ojo (ePKC)1. La formación de este complejo de señalización supramolecular garantiza la correcta localización subcelular, alta eficiencia y especificidad de la maquinaria de fototransducción Drosophila. En este complejo, los canales TRP sensibles a la luz actúan como efectores aguas abajo de NORPA y median la afluencia de calcio y la despolarización de los fotorreceptores. Estudios previos mostraron que la apertura del canal TRP de Drosophila está mediada por protones, interrupción del entorno lipídico local o fuerza mecánica 2,3,4. El canal TRP de Drosophila también interactúa con la calmodulina5 y es modulado por el calcio por retroalimentación positiva y negativa 6,7,8.
Hasta ahora, los estudios de electrofisiología sobre el mecanismo de cierre de los canales TRP de Drosophila y TRP-like (TRPL) se basaron en parches de membrana extirpados, registros de células enteras de fotorreceptores disociados de Drosophila de tipo silvestre y canales heteroexpresados en células S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, pero no en canales purificados. La información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa tampoco está clara. Para estudiar las propiedades electrofisiológicas de la proteína purificada en un entorno de membrana reconstituida y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa, la obtención de canales TRP de longitud completa purificados es el primer paso necesario, similar a las metodologías utilizadas en los estudios de canales de TRP de mamíferos 14,15,16,17.
Recientemente, sobre la base del mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD 18,19,20, se desarrolló por primera vez una estrategia de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal TRP de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila mediante perlas de estreptavidina 5. Teniendo en cuenta la baja capacidad y el costoso costo de las perlas de estreptavidina, aquí se introduce un protocolo de purificación mejorado que utiliza proteína de cebo marcada con His y las correspondientes perlas de Ni de bajo costo con una capacidad mucho mayor. El método propuesto ayudará a estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP desde ángulos estructurales y a medir las propiedades electrofisiológicas del canal TRP con proteínas purificadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>Protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment models</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.melanogaster: W1118 strain</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>BDSC:3605</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/30/40 mesh stainless steel sieves</td>
			<td>Jiufeng metal mesh company</td>
			<td>GB/T6003.1</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>A3291</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HC2005</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05892953001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100472-0025</td>
			<td>SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A620058-0100</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500838-0500</td>
			<td>Size-exclusion column buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610235-0005</td>
			<td>SDS-PAGE buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17513202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0001</td>
			<td>Elution buffer preparation for Ni-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600168-0025</td>
			<td>Induction of protein overexpression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002-0250</td>
			<td>E.coli. cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G4251-100G</td>
			<td>Elution buffer preparation for Glutathione beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-Sepharose excel beads</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17371202</td>
			<td>Affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610424-001</td>
			<td>Detergent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T9281-100ML</td>
			<td>SDS-PAGE gel preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607008-0500</td>
			<td>Homogenization buffer for E.coli. cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Lablead</td>
			<td>P0754-25G</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26619/26616</td>
			<td>Prestained protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (preparation grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28989336</td>
			<td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion column (analytical grade)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500228-0001</td>
			<td>SDS-PAGE gel/buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1503-10KG</td>
			<td>Protein purification buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096/801096</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td>APX-60</td>
			<td>Metage of Drosophila head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0015</td>
			<td>TRP protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>738-0017</td>
			<td>Bait and competitor protein purification from E.coli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td>
			<td>SDS-PAGE imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti J-26 XP</td>
			<td>Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>UNION-BIOTECH</td>
			<td>UH-05</td>
			<td>Homogenization of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen tank</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>CX-100</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>AKTA purifier</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80&#176;C)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>900GP</td>
			<td>Drosophila head preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>MAPADA</td>
			<td>UV-1200</td>
			<td>OD600 measurement of E.coli. cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of endogenous drosophila transient receptor potential channels

La fototransducción de Drosophila es una de las vías de señalización acopladas a proteínas G más rápidas conocidas. Para asegurar la especificidad y eficiencia de esta cascada, el canal catiónico permeable al calcio (Ca2+), el potencial del receptor transitorio (TRP), se une estrechamente a la proteína del andamio, inactivación-no-post-potencial D (INAD), y forma un gran complejo proteico de señalización con proteína quinasa C específica del ojo (ePKC) y potencial del receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA). Sin embargo, las propiedades bioquímicas del canal TRP de Drosophila siguen sin estar claras. Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno TRP. Primero, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con histidina purificada (His) se unió a cuentas de Ni y se usó como cebo para derribar el complejo endógeno de proteína INAD de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila. Luego, se agregó un fragmento excesivo de glutatión S-transferasa purificada (GST) marcado con TRP 1261-1275 a las cuentas de Ni para competir con el canal TRP. Finalmente, el canal TRP en el sobrenadante se separó del péptido TRP 1261-1275 excesivo mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método permite estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP de Drosophila desde ángulos bioquímicos y estructurales. Las propiedades electrofisiología de los canales TRP de Drosophila purificados también se pueden medir en el futuro.

En este artículo, se demuestra un método de purificación de proteínas para purificar el canal endógeno de Drosophila TRP (Figura 1).
En primer lugar, se aplica la expresión y purificación de proteínas recombinantes para obtener las proteínas de cebo y de la competencia. Luego, un fragmento de TRP 1261-1275 marcado con GST se expresa en células de E. coli BL21 (DE3) en medio LB y se purifica utilizando perlas de glutatión y una columna ...

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Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

En este protocolo, demostramos el proceso de purificación para obtener canales TRP purificados y de longitud completa, que es el primer paso necesario para estudiar las propiedades electrofisiológicas, y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa. Sobre la base del mecanismo de muestreo del complejo de proteínas INAD y utilizando perlas de níquel de bajo costo con una capacidad mucho mayor, se puede purificar una cantidad suficiente de canales TRP de cabezas de mosca. Demostrando el procedimiento estará Yuyang Liu, un técnico de nuestro laboratorio.Para comenzar, transforme el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 en células E.coli BL21, utilizando el método de transformación de choque térmico de cloruro de calcio. Inocular una sola colonia en 10 mililitros de Luria Bertani medio, y crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Agregue los 10 mililitros de cultivo de siembra en un litro de medio Luria Bertani e incube a 37 grados centígrados.Después de que la densidad óptica de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 grados Celsius y agregue 0.1 milimolar isopropil-beta-D-1-tiogalactopyranoside. Después de la sobreexpresión, glet un litro de células cultivadas por centrifugación y resuspend en 40 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Cargue las células resuspendidas en un homogeneizador de alta presión, preenfriado a cuatro grados centígrados.Aumente lentamente la presión del homogeneizador a 800 bar. Abra la pestaña de entrada y deje que las celdas resuspendidas pasen circularmente a través de una válvula con ranuras estrechas. Cargue cinco mililitros de perlas de glutatión en una columna de flujo por gravedad y lave las perlas con 50 mililitros de tampón salino tampón salino tamponado con fosfato, para un total de tres veces.Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48, 384 veces G.Agregue alrededor de 40 mililitros del sobrenadante del lisado de células centrifugadas a las perlas de glutatión equilibradas en la columna de flujo de gravedad, e incube durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Resuspend las cuentas de glutatión cada 10 minutos. Después de 30 minutos de incubación, abra la pestaña de salida de la columna para separar las cuentas y la fracción de flujo.Deseche la fracción de flujo continuo y enjuague las perlas de glutatión restantes dos veces, con 50 mililitros de tampón salino tampón tampón de fosfato. Agregue 15 mililitros de tampón de elución a las cuentas de glutatión y vuelva a suspender las perlas cada 10 minutos. Eluya el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST en un tubo cónico de 50 ml y cárguelo en una columna de exclusión de tamaño.Recolecte cinco mililitros de las proteínas eluidas por tubo y concentre los fragmentos purificados en un mililitro por centrifugación en una columna de espín de ultrafiltración en una centrífuga refrigerada. Para purificar el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His, siga el procedimiento previamente demostrado utilizando perlas de níquel. Recoja las moscas adultas en tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros y congélelas en nitrógeno líquido durante 10 minutos.Agite vigorosamente los tubos congelados a mano y transfiera la mezcla a tres tamices de acero inoxidable preenfriados apilados secuencialmente. Agite los tamices y barre las cabezas de las moscas del tamiz de malla 40 con un cepillo. Transfiéralos a tubos cónicos de cinco mililitros y guárdelos a menos 80 grados centígrados.Homogeneizar 0,5 gramos de cabezales en nitrógeno líquido utilizando un mortero y mortero preenfriados. Disuelva las cabezas homogeneizadas en cinco mililitros de tampón de lisis 10X, seguido de centrifugación a 20, 817 veces G a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. El sobrenadante de giro hacia abajo se centrifuga aún más 100, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante 60 minutos.Agregue un mililitro de perlas de níquel en la columna de flujo de gravedad y lave las cuentas tres veces con 10 mililitros de agua destilada doble a cuatro grados centígrados. Equilibre las cuentas con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis, tres veces a cuatro grados centígrados. Agregue 500 microlitros de 600 micromolares purificados con proteína NORPA 863-1095 en la columna de níquel e incube la columna.Vuelva a suspender las cuentas cada 10 minutos. Abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo, y lave las perlas de níquel con 10 mililitros de tampón de lisis en frío. Luego, agregue el sobrenadante frío del homogeneizado de cabeza de Drosophila en la columna de níquel.Después de la incubación, lave las perlas con 10 mililitros de tampón de lisis y agregue 500 microlitros de 600 micromolares de proteína TRP 1261-1275 marcada con GST en las perlas. Recoge la fracción eluida de la columna de gravedad. Lave las perlas de níquel con 10 mililitros de tampón de unión.Luego, agregue el búfer de elución y recoja la fracción de elución de la columna de flujo de gravedad. Concentre las fracciones eluidas de la purificación del canal TRP de Drosophila, utilizando una columna de espín de ultrafiltración de cuatro mililitros. Inyecte la muestra en la columna de exclusión de tamaño y eluya las proteínas con un caudal razonable.El fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST se expresó en células de E. coli y se purificó utilizando perlas de glutatión y una columna de exclusión de tamaño. Del mismo modo, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His se expresó y purificó utilizando perlas de níquel y columna de exclusión de tamaño. El canal TRP eluido se separa del péptido TRP 1261-1275 marcado con GST excesivo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño.Como subproducto, los complejos INAD, ePKC, NORPA 863-1095 se obtienen después de la competencia de péptidos TRP 1261-1275. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo, es homogeneizar las cabezas de mosca en nitrógeno líquido y resolver el homogeneizado en tampón que contiene un detergente llamado DDM. Siguiendo este procedimiento, también podemos purificar todo el complejo de proteínas INAD que se puede utilizar para estudiar sus mecanismos de ensamblaje y regulación.Una posible aplicación futura de este método será estudiar la información estructural del canal endógeno Drosophila TRP utilizando técnicas Cryo-EM. Además, también es factible medir las propiedades electrofisiológicas de los canales endógenos purificados de Drosophila TRP en la membrana lipídica bicapa artificial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Investigación

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

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Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

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Expresión, solubilización y purificación de los transportadores de eucariotas borato de

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Examen espectrofotométrico para posibles inhibidores de la citosola glutatión S-transferasas

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...