Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدكتورة إيفيت راديسكي وألكسندرا هوكلا في Mayo Clinic في جاكسونفيل بولاية فلوريدا ، لتوفيرهما بلازميد pET-3a-pro-MMP-3cd كنموذج لاستنساخ جين Hisx6pro-MMP-3cd ، وتعليقاتهما ، إلى جانب الدكتور بول هارتلي من مركز نيفادا للجينوم في جامعة نيفادا ، رينو ، لتسلسل الحمض النووي. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا كاساندرا هيرجنرادر على المساعدة في جزء من التعبير عن البروتين. م.ر.-س. أود أن أشكر منحة NIH-P20 GM103650-COBRE لعلم الأعصاب التكاملي وجائزة منحة UNR R & D mICRO SEED.

1. تعبير MMP
<ol><li>استنساخ وتحويل pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd إلى خلايا R2DP<ol>
<li>هضم البلازميد pET-3a (انظر جدول المواد) مع إنزيمات تقييد NdeI و BamHI في Digest Buffer (انظر جدول المواد). في حجم تفاعل إجمالي قدره 40 ميكرولتر ، أضف 4 ميكرولتر من Digest Buffer ، و 33 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر من البلا...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method.">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).</li><li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography.">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).</li><li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

لا يزال الإنتاج الواسع النطاق ل MMPs القابلة للذوبان والبشرية والمؤتلفة مهمة صعبة. يمكن لخلايا الثدييات التعبير عن MMPs الوظيفية بتكاليف عالية وأوقات انتظار طويلة ، في حين أن E. coli تنتج بسرعة كميات كبيرة من أجسام تضمين MMP التي يجب تنقيتها وإعادة طيها11,16. تزي...

تخضع معظم البروتينات حقيقية النواة المعقدة لتعديلات متقنة بعد الترجمة بعد التعبير، مما يتطلب طي البروتين بمساعدة عالية والعوامل المساعدة لتكون وظيفية1. لا يزال إنتاج كميات كبيرة من البروتين البشري القابل للذوبان في مضيف بكتيري يمثل تحديا كبيرا بسبب ارتفاع التكاليف وعدم وجود طرق قوية للتعبير والتنقية، حتى بالنسبة للتجارب المعملية الأصغر حجما2،3. عادة ما يتم التعبير عن MMPs ، endopeptidases البشرية ذات الوزن الجزيئي الكبير ، كأجسام تضمين غير قابلة للذوبان عند التعبير عنها في E. coli. غالبا ما يؤدي استخراج MMPs البشرية القابلة للذوبان إلى عملية ذوبان وإعادة طي شاقة وتستغرق وقتا طويلا4.
MMPs لها أدوار حاسمة في كل من العمليات الفسيولوجية والمسببة للأمراض. MMPs البشرية هي عائلة من 23 إندوببتيداز الزنك ، مصنفة حسب بنية وخصوصية الركيزة ، ويتم التعبير عنها بشكل تفاضلي على الرغم من المجال الحفاز المحفوظ للغاية5,6. يتم إفراز MMPs كزيموجينات غير نشطة ، يتم تنظيمها عن طريق التنشيط بعد الترجمة ومثبطاتها الداخلية ، مثبطات الأنسجة من ميتالوبروتيناز (TIMPs) 7،8،9،10. على الرغم من الاعتراف بها في البداية لدورها في دوران ECM ، إلا أن MMPs متورطة أيضا في التطوير ، والتشكل ، وإصلاح الأنسجة ، وإعادة التشكيل8. تم ربط خلل تنظيم MMPs بشكل ملحوظ بالسرطان إلى جانب الأمراض العصبية التنكسية والقلب والأوعية الدموية والتليف ، من بين أمراض أخرى5,7.
يعد تطوير طرق إنتاج MMP قوية على نطاق واسع أمرا بالغ الأهمية لضمان نجاح الدراسات المستقبلية لآليات MMP من خلال الفحوصات الكيميائية الحيوية والقائمة على الخلايا. تم التعبير عن MMPs المختلفة سابقا في البكتيريا11 ، بما في ذلك MMPs الموسومة ب Hisx6 ، دون تغيير نشاط MMP12،13،14،15. ومع ذلك ، تتضمن هذه الطرق خطوات طويلة مملة قد يكون من الصعب تكرارها.
يمكن أيضا استخدام خلايا الثدييات للتعبير عن العديد من البروتينات البشرية المختلفة مع ضمان التعديلات المناسبة بعد الترجمة16. على الرغم من أن نظام التعبير عن الثدييات هو الخيار المثالي لإنتاج البروتينات البشرية المؤتلفة مع التعديلات المناسبة بعد الترجمة، فإن العيوب الرئيسية لهذه الطريقة هي الغلة المنخفضة الأولية، ووسائط النمو والكواشف المكلفة، والجداول الزمنية الطويلة للوصول إلى خطوط التعبير المستقرة، وخطر التلوث بأنواع أخرى مثل الفطريات أو البكتيريا2،11 . علاوة على ذلك ، ينتج إنتاج MMP في خطوط خلايا الثدييات شوائب من البروتينات الخلوية المرتبطة مثل TIMPs أو fibronectins11. على عكس نمو الخلايا البطيء الذي لوحظ في خلايا الثدييات ، يوفر نظام التعبير البكتيري إنتاج البروتين على نطاق واسع في فترة قصيرة إلى جانب متطلبات أبسط للوسائط والنمو. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود بروتينات خلوية أخرى مرتبطة (أي TIMPs) في أنظمة التعبير البكتيري ، فإن MMPs النشطة بتركيزات أعلى عرضة للتدهور من خلال التحلل الذاتي ، مما يؤدي إلى ضعف إنتاجية MMP 17.
تصف هذه الورقة طريقة مفصلة للتعبير البكتيري وتنقية وتنشيط المؤتلف Hisx6-pro-MMP-3cd باستخدام E. coli كمضيف تعبير بسبب قدرته على تحمل التكاليف وبساطته ونجاحه في إنتاج غلات أعلى من MMPs2,3,18. نظرا لأن الإشريكية القولونية تفتقر إلى آلات طي البروتين والمعالجة اللاحقة للترجمة اللازمة ل MMPs المؤتلف والبروتينات المعقدة الأخرى ، فقد تم تصميم العديد من سلالات E. coli للتغلب على هذه القيود ، مما يجعل E. coli مضيف أكثر ملاءمة للتعبير عن MMP-3cd البشري المؤتلف ،19،20 . على سبيل المثال ، تعزز سلالة R2DP المستخدمة في هذه الدراسة التعبير حقيقي النواة عن طريق توفير بلازميد مقاوم للكلورامفينيكول يحتوي على كودونات نادرا ما تستخدم في الإشريكية القولونية.
كما هو موضح في هذا البروتوكول ، بعد الإفراط في التعبير عن أجسام التضمين النقية نسبيا من متجه pET-3a (الشكل 1) في خلايا R2DP ، يتم استخراج بروتينات المجال الحفاز Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) وتشويهها4. تم تنقية Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 باستخدام كروماتوغرافيا علامة التقارب. عند إعادة الطي وغسيل الكلى ، تم تنشيط pro-MMP-3cd (zymogen) بواسطة خلات 4-aminophenylmercuric (APMA) ، ويستخدم تحليل SDS-PAGE لتقييم الغلة والحاجة إلى مزيد من التنقية 5,21. يصف هذا البروتوكول التعبير والتنقية والتنشيط MMP-3cd القابل للذوبان كمثال. ومع ذلك ، يمكن استخدامه أيضا كدليل للتعبير عن MMPs الأخرى والبروتياز البشري مع تعبير مماثل ، وآليات التنشيط (الشكل 2). بالنسبة للبروتينات الأخرى غير MMP-3cd ، ينصح القارئ بتحديد التراكيب والطرق العازلة المثلى للبروتين المستهدف قبل محاولة هذا البروتوكول.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> الشكل 1: خريطة البلازميد للبلازميد pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. يتضمن ناقل pET-3a جينا مقاوما للأمبيسلين. يتم استنساخ تسلسل علامة Hisx6 الطرفية N في المتجه المستند إلى pET-3a ، بما في ذلك pro-MMP-3cd ، لإنتاج بنية pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd تحت سيطرة مروج T7 بين مواقع تقييد BamHI و NdeI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> الشكل 2: التعبير البكتيري ل pro-MMP-3cd ، والتنقية ، وإعادة الطي ، والتنشيط. 1.1: تم تحويل بلازميد pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd إلى خلايا BL21 (DE3) أو R2DP. 1.2: تم تحفيز التعبير عن البروتين Pro-MMP-3cd باستخدام IPTG. 1.3: يتم استخدام التحلل الكيميائي والصوتنة لاستخراج بروتينات Hisx6-pro-MMP-3cd التي هي أساسا غير قابلة للذوبان ووجدت في هيئات التضمين. تم استخدام اليوريا لتشويه وإذابة البروتين من أجسام التضمين. 2.1. تم تنقية بروتين Hisx6-pro-MMP-3cd المشوه عن طريق تنقية كروماتوغرافيا التقارب. 3. تم إعادة طي Hisx6-pro-MMP-3cd ببطء أثناء غسيل الكلى من خلال الإزالة التدريجية لليوريا من المخزن المؤقت. 4. أخيرا ، تم تنشيط بروتين MMP-3cd المعاد طيه باستخدام APMA عن طريق إزالة مجال N-terminal pro-peptide. تتم إزالة APMA لاحقا من المحلول من خلال تحلية المياه. تتوافق الأرقام مع أقسام البروتوكول التي تصف هذه الخطوات. الاختصارات: MMP-3cd = المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 مصفوفة ؛ APMA = 4-أمينوفينيل أسيتات الزئبق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

تنتمي المصفوفة الميتالوبروتيناز (MMPs) إلى عائلة بروتياز الميتزينسين مع أدوار مركزية في تحلل وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، بالإضافة إلى التفاعلات مع العديد من عوامل النمو والسيتوكينات. الإفراط في التعبير عن MMPs محددة هو المسؤول في العديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض العصبية التنكسية وأمراض القلب والأوعية الدموية. كانت MMPs مركز الاهتمام مؤخرا كأهداف لتطوير العلاجات التي يمكن أن تعالج الأمراض المرتبطة بالتعبير المفرط MMP.
لدراسة آلية MMP في المحلول ، هناك حاجة إلى طرق تنقية وتنقية أكثر سهولة وقوة للتعبير عن البروتين المؤتلف لإنتاج MMPs النشطة والقابلة للذوبان. ومع ذلك ، لا يمكن التعبير عن المجال الحفاز لمعظم MMPs في الإشريكية القولونية (E. coli) في شكل قابل للذوبان بسبب نقص آلات ما بعد الترجمة ، في حين أن أنظمة التعبير عن الثدييات عادة ما تكون مكلفة ولها عوائد أقل. يجب أن تخضع هيئات تضمين MMP لعملية شاقة وشاقة للتنقية وإعادة الطي على نطاق واسع ، مما يقلل بشكل كبير من غلة MMPs في المطابقة الأصلية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا باستخدام خلايا Rosetta2(DE3)pLysS (المشار إليها فيما يلي باسم R2DP) لإنتاج المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 مصفوفة (MMP-3cd) ، والذي يحتوي على علامة N-terminal His-tag متبوعة بالمجال المؤيد (Hisx6-pro-MMP-3cd) للاستخدام في تنقية التقارب. تعزز خلايا R2DP التعبير عن البروتينات حقيقية النواة من خلال بلازميد مقاوم للكلورامفينيكول يحتوي على كودونات نادرة عادة في أنظمة التعبير البكتيري. بالمقارنة مع خط الخلية التقليدي المفضل للتعبير عن البروتين المؤتلف ، BL21 (DE3) ، فإن التنقية باستخدام هذه السلالة الجديدة حسنت إنتاجية Hisx6-pro-MMP-3cd المنقى . عند التنشيط وإزالة الملح ، يتم شق المجال الاحترافي جنبا إلى جنب مع N-terminal His-tag ، مما يوفر MMP-3cd نشطا للاستخدام الفوري في عدد لا يحصى من التطبيقات في المختبر . لا تتطلب هذه الطريقة معدات باهظة الثمن أو بروتينات اندماج معقدة وتصف الإنتاج السريع ل MMPs البشرية المؤتلفة في البكتيريا.

عند تشغيل العينات على SDS-PAGE ، نظرا لأن البروتين يتم التعبير عنه في شكل أجسام تضمين غير قابلة للذوبان ، يجب أن تحتوي الكسور المحللة والصوتية على القليل من مستخلص Hisx6-pro-MMP-3cd ، حيث لم يتم بعد إعادة إذابة البروتين في اليوريا. يقارن الشكل 3 أجزاء إزالة تنقية علامته من Hisx6-pro-MMP-3cd من ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

يتم استخدام تنقية علامته وغسيل الكلى والتنشيط لزيادة غلة التعبير عن بروتين المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 القابل للذوبان والنشط في البكتيريا. يتم تحليل كسور البروتين عبر المواد الهلامية SDS-PAGE.

التعبير البكتيري وتنقية ميتالوبروتيناز المصفوفة البشرية -3 باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

يصف هذا البروتوكول المفصل طريقة عالية الكفاءة وفعالة من حيث التكلفة للتعبير البكتيري للمجال الحفاز MMP-3 المؤتلف في E.Coli ، والتي يمكن تطبيقها على الأهداف العلاجية MMP الأخرى. تفتقر E.coli إلى نظام معقد للطي البروتيني ومعالجة ما بعد الترجمة. تستخدم هذه الطريقة سلالة الخلايا R2DP لتعزيز تعبير البروتين حقيقي النواة في E.coli.الإفراط في إنتاج MMPs محددة يؤدي إلى العديد من الأمراض مثل السرطان والقلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية التنكسية. هناك حاجة إلى MMPs قابلة للذوبان النشطة لتطوير العلاجات المثبطة MMP. قم بتلقيح مستعمرة معزولة واحدة من المجال الحفاز pET His-tag pro MMP-3 المحول من لوحة مقاومة للأمبيسلين كلورامفينيكول LB في خمسة ملليلترات من وسائط مقاومة للأمبيسيلين كلورامفينيكول LB عند 37 درجة مئوية.حفظ aliquots من كل ثقافة وإعداد 40 ٪ من مخزونات الجلسرين. قم بتلقيح قارورة سعة لتر واحد تحتوي على 500 ملليلتر من وسط مقاومة لكلورامفينيكول الأمبيسلين LB إلى كثافة بصرية تتراوح من 0.05 إلى 0.1 عند 600 نانومتر مع الثقافة الليلية. قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر في عدة نقاط زمنية ، عادة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات حتى تقع بين 0.4 و 0.6.حث الثقافات مع مخزون IPTG مولاري واحد إلى تركيز نهائي من ملليمولار واحد. احتضان في شاكر 37 درجة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات إضافية. الطرد المركزي للخلايا في زجاجات مخروطية 250 ملليلتر في 13،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، مع تكرار حتى يتم تكوير الثقافات بالكامل.أضف ثلاثة ملليلترات من مخزن التحلل العازل لكل غرام من الكريات وأعد تعليق الكريات عن طريق الدوامة أو السحب. أضف 1.25 ملليلتر من وزن 10٪ حسب حجم ديوكسيكولات الصوديوم لكل لتر واحد من الثقافة. أضف 10 ميكرولترات من DNase I لكل لتر واحد من الثقافة.رجه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 150 دورة في الدقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 جم وأربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.أعد تعليق الكريات في 100 ملليلتر لكل لتر من المخزن المؤقت لجسم التضمين عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتفظ بالعينات على الجليد أثناء الصوتنة لمنع ارتفاع درجة الحرارة. قم بسونيك كل عينة لمدة ست دورات مدتها 15 ثانية ، وخرج من خمسة ونبض 50٪.الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 13،000 غرام وأربع درجات مئوية. تحقق من الكريات. إذا كانت الكريات مدمجة ، فتخلص من السوبرناتانت.أعد تعليق كل حبيبة من مزرعة لتر واحد وخمسة ملليلترات من المخزن المؤقت للذوبان. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل على الجليد للسماح للبروتينات بالذوبان. الطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق في 13،000 مرة G في أربع درجات مئوية.إذا تشكلت الكرية بعد الطرد المركزي ، صب supernatant في أنبوب مخروطي منفصل 50 ملليلتر. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلترات أخرى من المخزن المؤقت للذوبان لكل لتر واحد من الثقافة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 جم وأربع درجات مئوية.بعد ذلك ، اسحب السوبرناتونات. تخلص من الكريات أو خزنها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من الصوتنة. فارغ ضد المخزن المؤقت لغسيل HT وسجل A280 لجزء الغسيل الأول.كرر ذلك مع الكسور الأخرى حتى يقترب A280 من خط الأساس. قم على الفور بالتخلص من البروتينات الموسومة عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من مخزن HT elution المؤقت. جمع التدفق من خلال 0.5 إلى واحد ملليلتر الكسور في أنابيب microfuge المسمى HT elution.قم بقياس A280 لكسر الاستلصال. إذا كان A280 أكبر من 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر، فقم بتخفيف الكسر باستخدام مخزن مؤقت لتوازن HT. اغمر أجزاء MMP المنبعثة في أنابيب غسيل الكلى في لتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الكلى واحد وحرك الأنبوب ومحتوياته على تحريك مغناطيسي لمدة ثماني ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية.نقل إلى لتر واحد من غسيل الكلى المخزن المؤقت اثنين وتحريك الأنابيب ومحتوياتها على تحريك مغناطيسي لمدة ثماني ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل إلى لتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الكلى ثلاثة وحرك الأنابيب ومحتوياتها على تحريك مغناطيسي لمدة لا تقل عن ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية. انقل العينة إلى حاوية مناسبة وقم بتصنيفها على أنها MMP مطلوبة.افحص الأنبوب بحثا عن أي راسب. لكل ملليلتر واحد من أليكوت واحد ملليغرام لكل ملليلتر MMP ، أضف 50 ميكرولتر من 20 ملليمول APMA للوصول إلى تركيز APMA النهائي من ملليمول واحد. إذا تشكل راسب ، فقم بطرده المركزي بسرعة قصوى لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.قم بتخزين السوبرناتانت في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر يحمل علامة MMP المنشطة. تخلص من الراسب في حاوية تحمل علامة نفايات APMA. تم تشغيل SDS-PAGE لمقارنة كسور تنقية العلامة الخاصة به من المجال الحفاز His-tag pro MMP-3 من خلايا BL21 DE3 في خلايا R2DP.أظهرت الكسور الثمانية الأولى من المجال الحفاز MMP الموسوم وخلايا BL21 DE3 بروتينا أقل من تلك الموجودة في المجال الحفاز MMP الموسوم به في خلايا R2DP. يتم عرض الأجزاء المستحثة والمعاد طيها والمركزة والمنشطة والمملحة من خلايا MMP3 CD و R2DP. عند التنشيط ، يبلغ الوزن الجزيئي لنطاق القرص المضغوط MMP-3 المنشط حوالي 20 كيلودالتون ، على عكس الزيموجين الموسوم الذي يبقى عند حوالي 30 كيلودالون.عند الطرد المركزي للخلايا ، قد لا تكون الكريات مضغوطة. عندما يحدث ذلك ، سونيك أكثر وأجهزة الطرد المركزي لفترة أطول. عند إعادة تركيز البروتين ، قد يحدث هطول الأمطار.قم بإذابته في مخزن مؤقت للذوبان وكرر العملية. يوفر الإجراء الموضح هنا طريقة مفصلة للتعبير القابل للذوبان عن MMPs البشرية النشطة التي يمكن استخدامها في النهاية لفهم الآلية الجزيئية للنشاط الأنزيمي MMP. يمكن إجراء طرق تنقية البروتين البديلة مثل FPLC لبروتينات MMP النقية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...