Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Evette Radisky und Alexandra Hockla von der Mayo Clinic in Jacksonville, Florida, für die Bereitstellung des pET-3a-pro-MMP-3cd-Plasmids als Vorlage für die Klonierung des Hisx6pro-MMP-3cd-Gens und ihre Kommentare sowie Dr. Paul Hartley vom Nevada Genomics Center an der University of Nevada, Reno, für die DNA-Sequenzierung danken. Die Autoren möchten auch Cassandra Hergenrader dafür danken, dass sie bei einem Teil der Proteinexpression geholfen hat. M.R.-S. möchte dem NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience Grant und dem UNR R&D mICRO SEED Grant Award danken.

1. MMP-Ausdruck
<ol><li>Klonen und Transformation von pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd in R2DP-Zellen<ol>
<li>Fermentieren Sie das pET-3a-Plasmid (siehe Materialtabelle) mit NdeI- und BamHI-Restriktionsenzymen im Digest-Puffer (siehe Materialtabelle). Bei einem Gesamtreaktionsvolumen von 40 μL werden 4 μL Digest-Puffer, 33 μL 100 ng/μL Plasmid und 1,5 μL jedes Restriktionsenzyms zugegeben und die Reaktion ~2 h bis zum Abschluss bei 37 °C fortgesetzt.</li>
		<li>Führen S...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method.">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).</li><li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography.">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).</li><li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

Die großtechnische Produktion von löslichen, humanen, rekombinanten MMPs bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe. Säugetierzellen können funktionelle MMPs mit hohen Kosten und langen Wartezeiten exprimieren, während E. coli schnell hohe Mengen an MMP-Einschlusskörpern produzieren, die gereinigt und wieder gefaltet werden müssen11,16. R2DP-Zellen erhöhen die Ausbeute von MMP-Einschlusskörpern signifikant und ermöglichen einen kostengünstigeren und p...

Die meisten komplexen eukaryotischen Proteine durchlaufen nach der Expression ausgeklügelte posttranslationale Modifikationen, die eine hochunterstützte Proteinfaltung und Co-Faktoren erfordern, um funktionsfähig zu sein1. Die Herstellung großer Mengen löslichen menschlichen Proteins in einem bakteriellen Wirt bleibt aufgrund der hohen Kosten und des Mangels an robusten Expressions- und Reinigungsmethoden eine erhebliche Herausforderung, selbst für kleinere Laborexperimente2,3. MMPs, humane Endopeptidasen mit großem Molekulargewicht, werden normalerweise als unlösliche Einschlusskörper exprimiert, wenn sie in E. coli exprimiert werden. Die Extraktion von löslichen humanen MMPs führt oft zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Solubilisierungs- und Umfaltungsprozess4.
MMPs spielen eine entscheidende Rolle sowohl in physiologischen als auch in pathogenen Prozessen. Humane MMPs sind eine Familie von 23 Zink-Endopeptidasen, kategorisiert nach Struktur- und Substratspezifität und differentiell exprimiert trotz einer hochkonservierten katalytischen Domäne5,6. MMPs werden als inaktive Zymogene sezerniert, reguliert durch posttranslationale Aktivierung und ihre endogenen Inhibitoren, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs)7,8,9,10. Obwohl MMPs ursprünglich für ihre Rolle beim ECM-Umsatz anerkannt waren, waren sie auch an der Entwicklung, Morphogenese, Gewebereparatur und -umgestaltung beteiligt8. Die Dysregulation von MMPs wurde unter anderem mit Krebs sowie neurodegenerativen, kardiovaskulären und fibrotischen Erkrankungen in Verbindung gebracht5,7.
Die Entwicklung robuster MMP-Produktionsmethoden im großen Maßstab ist entscheidend, um den Erfolg zukünftiger Studien von MMP-Mechanismen durch biochemische und zellbasierte Assays sicherzustellen. Verschiedene MMPs wurden zuvor in Bakterien exprimiert11, einschließlich Hisx6-markierter MMPs, ohne die MMP-Aktivität zu verändern12,13,14,15. Diese Methoden umfassen jedoch mühsame, lange Schritte, die möglicherweise schwer zu replizieren sind.
Säugetierzellen können auch verwendet werden, um viele verschiedene menschliche Proteine zu exprimieren und gleichzeitig die richtigen posttranslationalen Modifikationen zu gewährleisten16. Obwohl das Expressionssystem für Säugetiere eine ideale Wahl ist, um rekombinante menschliche Proteine mit geeigneten posttranslationalen Modifikationen herzustellen, sind die Hauptnachteile dieser Methode anfänglich niedrige Ausbeuten, kostspielige Wachstumsmedien und Reagenzien, lange Zeiträume zum Erreichen stabiler Mimiklinien und das Risiko einer Kontamination mit anderen Spezies wie Pilzen oder Bakterien2,11 . Darüber hinaus führt die MMP-Produktion in Zelllinien von Säugetieren zu Verunreinigungen aus assoziierten zellulären Proteinen wie TIMPs oder Fibronektinen11. Im Gegensatz zu dem langsamen Zellwachstum, das in Säugetierzellen beobachtet wird, bietet das bakterielle Expressionssystem eine groß angelegte Proteinproduktion in kurzer Zeit sowie einfachere Medien- und Wachstumsanforderungen. Aufgrund des Fehlens anderer assoziierter zellulärer Proteine (d. h. TIMPs) in bakteriellen Expressionssystemen unterliegen aktive MMPs in höheren Konzentrationen jedoch dem Abbau durch Autoproteolyse, was zu einer schlechten MMP-Ausbeute führt17.
Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode zur bakteriellen Expression, Reinigung und Aktivierung von rekombinantem Hisx6-pro-MMP-3cd unter Verwendung von E. coli als Ausdruckshost aufgrund seiner Erschwinglichkeit, Einfachheit und seines Erfolgs bei der Erzeugung höherer Ausbeuten von MMPs2,3,18. Da E. coli nicht über die Proteinfaltungsmaschinerie und die posttranslationale Verarbeitung verfügt, die für rekombinante MMPs und andere komplexe Proteine erforderlich sind, wurden viele E. coli-Stämme entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, was E. coli zu einem geeigneteren Wirt für die Expression von rekombinantem humanem MMP-3cd macht,19,20 . Zum Beispiel verbessert der in dieser Studie verwendete R2DP-Stamm die eukaryotische Expression, indem er ein chloramphenicolresistentes Plasmid liefert, das Codons enthält, die selten in E. coli verwendet werden.
Wie in diesem Protokoll beschrieben, werden nach Überexpression von relativ reinen Einschlusskörpern aus dem pET-3a-Vektor (Abbildung 1) in R2DP-Zellen Hisx6-pro-MMP-3-Proteine (MMP-3cd) extrahiert und denaturiert4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 wurde mittels Affinitäts-Tag-Chromatographie gereinigt. Nach der Rückfaltung und Dialyse wurde das Pro-MMP-3cd (Zymogen) durch 4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) aktiviert, und die SDS-PAGE-Analyse wird verwendet, um die Ausbeuten und die Notwendigkeit einer weiteren Reinigung zu bewerten5,21. Dieses Protokoll beschreibt als Beispiel den Ausdruck, die Reinigung und die Aktivierung von löslichem MMP-3cd. Es kann jedoch auch als Leitfaden für die Expression anderer MMPs und menschlicher Proteasen mit ähnlicher Expression und Aktivierungsmechanismen verwendet werden (Abbildung 2). Für andere Proteine als MMP-3cd wird dem Leser empfohlen, optimale Pufferzusammensetzungen und -methoden für sein Zielprotein zu bestimmen, bevor er dieses Protokoll versucht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Abbildung 1: Plasmidabbildung des pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Plasmids. Der pET-3a-Vektor enthält ein Ampicillin-Resistenz-Gen. Eine N-terminale Hisx6-Tag-Sequenz wird in den pET-3a-basierten Vektor, einschließlich pro-MMP-3cd, geklont, um das pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Konstrukt unter Kontrolle des T7-Promotors zwischen BamHI- und NdeI-Restriktionssites zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Abbildung 2: Bakterielle Expression von Pro-MMP-3cd, Reinigung, Rückfaltung und Aktivierung . 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Plasmid wurde in BL21(DE3)- oder R2DP-Zellen umgewandelt. 1.2: Die Pro-MMP-3cd-Proteinexpression wurde mittels IPTG induziert. 1.3: Chemische Lyse und Beschallung werden verwendet, um Hisx6-pro-MMP-3cd-Proteine zu extrahieren, die hauptsächlich unlöslich sind und in den Einschlusskörpern vorkommen. Harnstoff wurde verwendet, um Protein aus Einschlusskörpern zu denaturieren und zu lösen. 2.1. Das denaturierte Hisx6-pro-MMP-3cd-Protein wurde durch affinitätschromatographische Reinigung gereinigt. 3. Die eluierte Hisx6-pro-MMP-3cd wurde während der Dialyse durch allmähliche Entfernung von Harnstoff aus dem Puffer langsam wieder gefaltet. 4. Schließlich wurde das gefaltete MMP-3cd-Protein mit APMA aktiviert, indem die N-terminale Pro-Peptid-Domäne entfernt wurde. APMA wird später durch Entsalzen aus der Lösung entfernt. Die Zahlen entsprechen den Protokollabschnitten, die diese Schritte beschreiben. Abkürzungen: MMP-3cd = Matrix-Metalloproteinase-3-katalytische Domäne; APMA = 4-Aminophenylquecksilberacetat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) gehören zur Familie der Metzincinproteasen mit zentralen Rollen beim Abbau und Remodeling der extrazellulären Matrix (ECM) sowie bei Wechselwirkungen mit mehreren Wachstumsfaktoren und Zytokinen. Die Überexpression spezifischer MMPs ist für verschiedene Krankheiten wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verantwortlich. MMPs standen in letzter Zeit im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit als Ziele für die Entwicklung von Therapeutika, die Krankheiten behandeln können, die mit MMP-Überexpression korrelieren.
Um den MMP-Mechanismus in Lösung zu untersuchen, sind einfachere und robustere rekombinante Proteinexpressions- und Reinigungsmethoden für die Herstellung von aktiven, löslichen MMPs erforderlich. Der katalytische Bereich der meisten MMPs kann jedoch in Escherichia coli (E. coli) aufgrund fehlender posttranslationaler Mechanismen nicht in löslicher Form exprimiert werden, während Expressionssysteme für Säugetiere in der Regel teuer sind und geringere Erträge aufweisen. MMP-Einschlussgremien müssen den langwierigen und mühsamen Prozess der umfangreichen Reinigung und Wiederfaltung durchlaufen, wodurch die Ausbeute an MMPs in der nativen Konformation erheblich reduziert wird. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das Rosetta2 (DE3) pLysS-Zellen (im Folgenden als R2DP bezeichnet) verwendet, um eine katalytische Matrix-Metalloproteinase-3-Domäne (MMP-3cd) zu erzeugen, die einen N-terminalen His-Tag gefolgt von einer Pro-Domäne (Hisx6-pro-MMP-3cd) für die Verwendung in der Affinitätsreinigung enthält. R2DP-Zellen verstärken die Expression eukaryotischer Proteine durch ein Chloramphenicol-resistentes Plasmid, das Codons enthält, die normalerweise in bakteriellen Expressionssystemen selten sind. Im Vergleich zur traditionellen Zelllinie der Wahl für die rekombinante Proteinexpression, BL21(DE3), verbesserte die Aufreinigung mit diesem neuen Stamm die Ausbeute an gereinigtem Hisx6-pro-MMP-3cd. Nach der Aktivierung und Entsalzung wird die Pro-Domäne zusammen mit dem N-terminalen His-Tag gespalten, wodurch aktives MMP-3cd für den sofortigen Einsatz in unzähligen In-vitro-Anwendungen bereitgestellt wird. Diese Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder komplexe Fusionsproteine und beschreibt die schnelle Produktion von rekombinanten menschlichen MMPs in Bakterien.

Wenn Proben auf SDS-PAGE ausgeführt werden, da das Protein in Form von unlöslichen Einschlusskörpern exprimiert wird, sollten die lysierten und beschallten Fraktionen wenig bis gar keinen Hisx6-pro-MMP-3cd-Extrakt enthalten, da das Protein noch nicht in Harnstoff resobilisiert wurde. Abbildung 3 vergleicht die His-tag-Reinigungselutionsfraktionen von Hisx6-pro-MMP-3cd aus BL21(DE3)-Zellen und R2DP-Zellen. Elution-Fraktionen wurden vor der Dialyse sowohl für BL21(DE3)- als auch für R2DP-...

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Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

His-Tag-Reinigung, Dialyse und Aktivierung werden eingesetzt, um die Ausbeute an löslicher, aktiver Matrix-Metalloproteinase-3-katalytischer Domänenproteinexpression in Bakterien zu erhöhen. Proteinfraktionen werden über SDS-PAGE-Gele analysiert.

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Dieses detaillierte Protokoll beschreibt eine hocheffiziente und kostengünstige Methode der bakteriellen Expression für die rekombinante MMP-3-katalytische Domäne in E.Coli, die auf andere MMP-therapeutische Ziele angewendet werden kann. E.coli fehlt ein komplexes Proteinfaltungs- und posttranslationales Verarbeitungssystem. Diese Methode verwendet den R2DP-Zellstamm, um die eukaryotische Proteinexpression in E.coli zu verbessern.Die Überproduktion spezifischer MMPs führt zu verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen. Aktiv lösliche MMPs werden für die Entwicklung von MMP-hemmenden Therapeutika benötigt. Beimpfen Sie eine einzelne isolierte Kolonie von pET His-tag pro MMP-3 katalytischen Domänentransformanten aus einer LB-Ampicillin-chloramphenicol-resistenten Platte in fünf Millilitern LB-Ampicillin-Chloramphenicol-resistenten Medien bei 37 Grad Celsius.Speichern Sie Aliquots aus jeder Kultur und bereiten Sie 40% Glycerinvorräte vor. Beimpfen Sie einen Ein-Liter-Kolben mit 500 Millilitern LB-Ampicillin-Chloramphenicol-resistentem Medium auf eine optische Dichte von 0,05 bis 0,1 bei 600 Nanometern mit der Übernachtkultur. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern zu mehreren Zeitpunkten, typischerweise für drei bis vier Stunden, bis sie zwischen 0,4 und 0,6 fällt.Induzieren Sie die Kulturen mit einem molaren IPTG-Stamm zu einer Endkonzentration von einem Millimolaren. Im 37-Grad-Shaker weitere drei bis vier Stunden inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen in 250-Milliliter-konischen Flaschen bei 13.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten und wiederholen Sie sie, bis die Kulturen vollständig pelletiert sind.Fügen Sie drei Milliliter Lysepuffer pro Gramm Pellet hinzu und suspendieren Sie das Pellet durch Vortexen oder Pipettieren. Fügen Sie 1,25 Milliliter 10% Volumengewicht Natriumdesoxycholat pro Liter Kultur hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter DNase I pro Liter Kultur hinzu.Bei Raumtemperatur 30 Minuten bei 150 U/min schütteln. Zentrifuge für 10 Minuten bei 13.000 g und vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand.Resuspendiert das Pellet in 100 Milliliter pro Liter Kultur des Einschlusskörperpuffers durch Pipettieren nach oben und unten. Bewahren Sie die Proben während der Beschallung auf Eis auf, um eine Überhitzung zu vermeiden. Beschallen Sie jede Probe für sechs Zyklen von 15 Sekunden, eine Ausgabe von fünf und einen Puls von 50%.Die Proben werden 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Überprüfen Sie das Pellet. Wenn das Pellet kompakt ist, entsorgen Sie den Überstand.Resuspendiert jedes Pellet aus einer Ein-Liter-Kultur und fünf Milliliter Solubilisierungspuffer. Inkubieren Sie mindestens 30 Minuten auf Eis, damit die Proteine auflösen können. Zentrifen Sie die Zellen für 10 Minuten bei 13.000 mal G bei vier Grad Celsius.Wenn sich das Pellet nach der Zentrifugation bildet, gießen Sie den Überstand in ein separates konisches 50-Milliliter-Rohr. Resuspendiert das Pellet in weiteren fünf Millilitern Solubilisierungspuffer pro Liter Kultur durch Pipettieren auf und ab. Zentrifuge für 10 Minuten bei 13.000 g und vier Grad Celsius.Als nächstes ziehen Sie die Überstände. Entsorgen Sie das Pellet oder lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für zusätzliche Beschallung. Gegen HT-Waschpuffer leeren und den A280 der ersten Waschfraktion aufzeichnen.Wiederholen Sie dies mit anderen Brüchen, bis sich A280 dem Ausgangswert nähert. Sofort His-markierte Proteine durch Zugabe von fünf Millilitern HT-Elutionspuffer eluieren. Sammeln Sie den Durchfluss bei 0,5 bis einem Milliliter Fraktionen in Mikrofugenröhrchen, die mit HT-Elution gekennzeichnet sind.Messen Sie den A280 der Elutionsfraktion. Wenn der A280 größer als 0,3 Milligramm pro Milliliter ist, verdünnen Sie die Fraktion mit HT-Gleichgewichtspuffer. Tauchen Sie die eluierten MMP-Fraktionen in Dialyseschläuche in einen Liter Dialysepuffer ein und rühren Sie den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius.Auf einen Liter Dialysepuffer zwei geben und den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius rühren. Als nächstes auf einen Liter Dialysepuffer drei übertragen und den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für nicht weniger als acht Stunden bei vier Grad Celsius rühren. Geben Sie die Probe in einen geeigneten Behälter und kennzeichnen Sie sie als gewähltes MMP.Untersuchen Sie das Rohr auf Niederschlag. Fügen Sie pro Milliliter Aliquot von einem Milligramm pro Milliliter MMP 50 Mikroliter 20 millimolar APMA hinzu, um eine endgültige APMA-Konzentration von einem Millimolar zu erreichen. Wenn sich ein Niederschlag bildet, zentrifugieren Sie ihn mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Lagern Sie den Überstand in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das mit aktiviertem MMP gekennzeichnet ist. Entsorgen Sie den Niederschlag in einen für APMA-Abfälle gekennzeichneten Behälter. SDS-PAGE wurde durchgeführt, um die His-Tag-Reinigungselutionsfraktionen der katalytischen Domäne His-tag pro MMP-3 von BL21 DE3-Zellen in R2DP-Zellen zu vergleichen.Die ersten acht Elutionsfraktionen der His-markierten MMP-Katalytikdomäne und BL21 DE3-Zellen zeigten weniger Protein als die in der His-markierten MMP-Katalytikdomäne in R2DP-Zellen. Es werden die induzierten, gefalteten, konzentrierten, aktivierten und entsalzten Fraktionen von MMP3-CD- und R2DP-Zellen gezeigt. Bei der Aktivierung beträgt das Molekulargewicht des aktivierten MMP-3-CD-Bandes etwa 20 Kilodalton, im Gegensatz zum His-markierten Zymogen, das bei etwa 30 Kilodalton verbleibt.Beim Zentrifugieren von Zelllysaten sind Pellets möglicherweise nicht kompakt. Wenn das passiert, beschallen Sie mehr und zentrifen Sie länger. Bei der Rekonzentration des Proteins kann es zu Ausfällungen kommen.Lösen Sie es in einem Lösungsvermittlerpuffer auf und wiederholen Sie den Vorgang. Das hier beschriebene Verfahren bietet eine detaillierte Methode zur löslichen Expression aktiver menschlicher MMPs, die schließlich verwendet werden kann, um den molekularen Mechanismus der enzymatischen Aktivität von MMP zu verstehen. Alternative Proteinreinigungsmethoden wie FPLC können an gereinigten MMP-Proteinen durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...