Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

लेखक जैक्सनविले, फ्लोरिडा में मेयो क्लिनिक में डॉ. एवेट रेडीस्की और एलेक्जेंड्रा हॉकला को स्वीकार करना चाहते हैं, जो कि Hisx6pro-MMP-3cd जीन की क्लोनिंग के लिए टेम्पलेट के रूप में pET-3a-pro-MMP-3cd प्लास्मिड प्रदान करने के लिए, और उनकी टिप्पणियां, डीएनए अनुक्रमण के लिए नेवादा विश्वविद्यालय, रेनो में नेवादा जीनोमिक्स सेंटर से डॉ पॉल हार्टले के साथ। लेखक प्रोटीन अभिव्यक्ति के हिस्से के साथ मदद करने के लिए कैसंड्रा हर्जेनेराडर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। M.R.-S. एनआईएच-P20 GM103650-COBRE एकीकृत तंत्रिका विज्ञान अनुदान और UNR आर एंड डी mICRO बीज अनुदान पुरस्कार धन्यवाद करना चाहते हैं।

1. एमएमपी अभिव्यक्ति
<ol><li>क्लोनिंग और PET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd का R2DP कोशिकाओं में रूपांतरण<ol>
<li>डाइजेस्ट बफर में NdeI और BamHI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ pET-3a प्लास्मिड ( सामग्री की तालिका देखें) को पचाएं ( सामग्री क?...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method.">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).</li><li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography.">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).</li><li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

घुलनशील, मानव, पुनः संयोजक एमएमपी का बड़े पैमाने पर उत्पादन एक चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है। स्तनधारी कोशिकाएं उच्च लागत और लंबे समय तक प्रतीक्षा समय पर कार्यात्मक एमएमपी व्यक्त कर सकती हैं, जबकि ई क?...

अधिकांश जटिल यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद विस्तृत पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों से गुजरते हैं, जिसके लिए अत्यधिक सहायता प्राप्त प्रोटीन तह और सह-कारकों को कार्यात्मक होने की आवश्यकता होती है। एक जीवाणु मेजबान में घुलनशील मानव प्रोटीन की बड़ी मात्रा का उत्पादन उच्च लागत और मजबूत अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण विधियों की कमी के कारण एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है, यहां तक कि छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए भी 2,3। एमएमपी, बड़े आणविक भार के साथ मानव एंडोपेप्टिडेस, आमतौर पर अघुलनशील समावेशन निकायों के रूप में व्यक्त किए जाते हैं जब ई कोलाई में व्यक्त किया जाता है। घुलनशील मानव एमएमपी का निष्कर्षण अक्सर एक श्रमसाध्य, समय लेने वाली घुलनशीलता और रीफोल्डिंग प्रक्रिया की ओर जाता है4।
एमएमपी दोनों शारीरिक और रोगजनक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मानव एमएमपी 23 जस्ता एंडोपेप्टिडेस का एक परिवार है, जिसे संरचना और सब्सट्रेट विशिष्टता द्वारा वर्गीकृत किया गया है, और अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक डोमेन 5, 6 के बावजूद अलग-अलग व्यक्त किया गया है। एमएमपी को निष्क्रिय zymogens के रूप में स्रावित किया जाता है, पोस्टट्रांसलेशनल सक्रियण और उनके अंतर्जात अवरोधकों के माध्यम से विनियमित किया जाता है, मेटालोप्रोटीनेस (टीआईएमपी) के ऊतक अवरोधक 7,8,9,10। हालांकि शुरू में ईसीएम टर्नओवर में उनकी भूमिका के लिए मान्यता प्राप्त है, एमएमपी को विकास, मॉर्फोजेनेसिस, ऊतक की मरम्मत और रीमॉडलिंग 8 में भी फंसाया गया है। एमएमपी के विकृतिकरण को विशेष रूप से अन्य बीमारियों के बीच न्यूरोडीजेनेरेटिव, कार्डियोवैस्कुलर और फाइब्रोटिक बीमारियों के साथ कैंसर से जोड़ा गया है5,7।
मजबूत बड़े पैमाने पर एमएमपी उत्पादन विधियों का विकास जैव रासायनिक और सेल-आधारित assays के माध्यम से एमएमपी तंत्र के भविष्य के अध्ययन की सफलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न एमएमपी को पहले बैक्टीरिया 11 में व्यक्त किया गया है, जिसमें एचएक्स 6-टैग किए गए एमएमपी शामिल हैं, एमएमपी गतिविधि 12,13,14,15 को बदलने के बिना। हालांकि, इन विधियों में थकाऊ, लंबे चरण शामिल हैं जिन्हें दोहराना मुश्किल हो सकता है।
स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग कई अलग-अलग मानव प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए भी किया जा सकता है, जबकि उचित पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को सुनिश्चित किया जा सकता है। यद्यपि स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली उचित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के साथ पुनः संयोजक मानव प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक आदर्श विकल्प है, इस विधि के मुख्य नुकसान प्रारंभिक कम पैदावार, महंगे विकास मीडिया और अभिकर्मक, स्थिर अभिव्यक्ति लाइनों तक पहुंचने के लिए लंबी समयसीमा, और कवक या बैक्टीरिया जैसे अन्य प्रजातियों के साथ संदूषण का जोखिम 2,11 हैं। . इसके अलावा, स्तनधारी सेल लाइनों में एमएमपी उत्पादन संबंधित सेलुलर प्रोटीन जैसे कि टीआईएमपी या फाइब्रोनेक्टिन 11 से अशुद्धियों को उत्पन्न करता है। स्तनधारी कोशिकाओं में देखे गए धीमी गति से सेल विकास के विपरीत, जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली सरल मीडिया और विकास आवश्यकताओं के साथ-साथ एक छोटी अवधि में बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन प्रदान करती है। हालांकि, बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणालियों में अन्य संबद्ध सेलुलर प्रोटीन (यानी, टीआईएमपी) की कमी के कारण, उच्च सांद्रता में सक्रिय एमएमपी ऑटोप्रोटियोलिसिस के माध्यम से गिरावट के अधीन हैं, जिसके परिणामस्वरूप खराब एमएमपी उपज 17 होती है।
यह पेपर बैक्टीरियल अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और पुनः संयोजक Hisx6-pro-MMP-3cd के सक्रियण के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है, जो ई कोलाई को अभिव्यक्ति होस्ट के रूप में उपयोग करता है क्योंकि इसकी सामर्थ्य, सादगी और MMPs2,3,18 की उच्च पैदावार का उत्पादन करने में सफलता। चूंकि ई कोलाई में पुनः संयोजक एमएमपी और अन्य जटिल प्रोटीन के लिए आवश्यक प्रोटीन तह मशीनरी और पोस्टट्रांसलेशनल प्रसंस्करण की कमी है, इसलिए इन सीमाओं को दूर करने के लिए कई ई कोलाई उपभेदों को इंजीनियर किया गया है, जिससे ई कोलाई पुनः संयोजक मानव एमएमपी -3सीडी, 19,20 की अभिव्यक्ति के लिए एक अधिक उपयुक्त मेजबान बन गया है। . उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला R2DP तनाव एक क्लोरैम्फेनिकोल-प्रतिरोधी प्लास्मिड की आपूर्ति करके यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति को बढ़ाता है जिसमें ई कोलाई में शायद ही कभी उपयोग किए जाने वाले कोडोन होते हैं।
जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, R2DP कोशिकाओं में pET-3a वेक्टर (चित्रा 1) से अपेक्षाकृत शुद्ध समावेशन निकायों के overexpression के बाद, Hisx6-pro-MMP-3 उत्प्रेरक डोमेन (MMP-3cd) प्रोटीन निकाले जाते हैं और विकृत 4 होते हैं। Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 को आत्मीयता टैग क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। refolding और डायलिसिस पर, प्रो-MMP-3cd (zymogen) को 4-aminophenylmercuric एसीटेट (APMA) द्वारा सक्रिय किया गया था, और SDS-PAGE विश्लेषण का उपयोग पैदावार का मूल्यांकन करने और आगे शुद्धिकरण की आवश्यकता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है5,21। यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में घुलनशील MMP-3cd की अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और सक्रियण का वर्णन करता है। हालांकि, इसका उपयोग समान अभिव्यक्ति के साथ अन्य एमएमपी और मानव प्रोटीज की अभिव्यक्ति के लिए एक गाइड के रूप में भी किया जा सकता है, और सक्रियण तंत्र (चित्रा 2)। एमएमपी -3सीडी के अलावा अन्य प्रोटीनों के लिए, पाठक को इस प्रोटोकॉल का प्रयास करने से पहले अपने लक्ष्य प्रोटीन के लिए इष्टतम बफर रचनाओं और विधियों को निर्धारित करने की सलाह दी जाती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> चित्रा 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd प्लास्मिड का प्लास्मिड मानचित्र। पीईटी -3 ए वेक्टर में एक एम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन शामिल है। एक N-टर्मिनल Hisx6-टैग अनुक्रम pET-3a-आधारित वेक्टर में क्लोन किया जाता है, जिसमें प्रो-MMP-3cd भी शामिल है, ताकि BamHI और NdeI प्रतिबंध साइटों के बीच T7 प्रमोटर के नियंत्रण में pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd निर्माण प्राप्त किया जा सके। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> चित्र 2: प्रो-एमएमपी-3सीडी, शुद्धिकरण, रीफोल्डिंग और सक्रियण की बैक्टीरियल अभिव्यक्ति। 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd प्लास्मिड को BL21 (DE3) या R2DP कोशिकाओं में बदल दिया गया था। 1.2: प्रो-एमएमपी-3सीडी प्रोटीन अभिव्यक्ति आईपीटीजी का उपयोग करके प्रेरित किया गया था। 1.3: रासायनिक lysis और sonication Hisx6-समर्थक-MMP-3cd प्रोटीन है कि मुख्य रूप से अघुलनशील हैं और शामिल निकायों में पाया जाता है निकालने के लिए उपयोग किया जाता है। यूरिया का उपयोग शामिल निकायों से प्रोटीन को विच्छेदित और घुलनशील बनाने के लिए किया गया था। 2.1. विकृत Hisx6-प्रो-MMP-3cd प्रोटीन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण के माध्यम से शुद्ध किया गया था. 3. eluted Hisx6-समर्थक-MMP-3cd धीरे-धीरे बफर से यूरिया के क्रमिक हटाने के माध्यम से डायलिसिस के दौरान refolded था. 4. अंत में, refolded MMP-3cd प्रोटीन एन टर्मिनल प्रो-पेप्टाइड डोमेन को हटाने से APMA का उपयोग कर सक्रिय किया गया था। एपीएमए को बाद में डिसाल्टिंग के माध्यम से समाधान से हटा दिया जाता है। संख्याएँ इन चरणों का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल अनुभागों के अनुरूप हैं. संक्षेप: MMP-3cd = मैट्रिक्स metaloproteinase-3 उत्प्रेरक डोमेन; APMA = 4-aminophenylmercuric एसीटेट। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

मैट्रिक्स metaloproteinases (MMPs) extracellular मैट्रिक्स (ECM) गिरावट और remodeling में केंद्रीय भूमिकाओं के साथ metzincin proteases के परिवार से संबंधित हैं, साथ ही साथ कई विकास कारकों और साइटोकिन्स के साथ बातचीत। विशिष्ट एमएमपी का ओवरएक्सप्रेशन कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और हृदय रोग जैसे कई रोगों में जिम्मेदार है। एमएमपी हाल ही में ध्यान का केंद्र रहा है क्योंकि चिकित्सीय विकसित करने के लक्ष्य हैं जो एमएमपी ओवरएक्सप्रेशन से संबंधित बीमारियों का इलाज कर सकते हैं।
समाधान में एमएमपी तंत्र का अध्ययन करने के लिए, सक्रिय, घुलनशील एमएमपी के उत्पादन के लिए अधिक सरल और मजबूत पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण विधियों की आवश्यकता होती है। हालांकि, अधिकांश एमएमपी के उत्प्रेरक डोमेन को पोस्टट्रांसलेशनल मशीनरी की कमी के कारण घुलनशील रूप में एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) में व्यक्त नहीं किया जा सकता है, जबकि स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली आमतौर पर महंगी होती है और कम पैदावार होती है। एमएमपी समावेशन निकायों को व्यापक शुद्धिकरण और रीफोल्डिंग की थकाऊ और श्रमसाध्य प्रक्रिया से गुजरना चाहिए, जो देशी संरचना में एमएमपी की उपज को काफी कम करता है। यह पेपर Rosetta2 (DE3) pLysS (इसके बाद R2DP के रूप में संदर्भित) कोशिकाओं का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ताकि मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस -3 उत्प्रेरक डोमेन (एमएमपी-3cd) का उत्पादन किया जा सके, जिसमें एक एन-टर्मिनल हिज़-टैग होता है जिसके बाद प्रो-डोमेन (Hisx6-pro-MMP-3cd) आत्मीयता शुद्धिकरण में उपयोग के लिए होता है। R2DP कोशिकाएं एक chloramphenicol-प्रतिरोधी प्लास्मिड के माध्यम से यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाती हैं जिसमें कोडोन आमतौर पर जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणालियों में दुर्लभ होते हैं। पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, BL21 (DE3) के लिए पसंद की पारंपरिक सेल लाइन की तुलना में, इस नए तनाव का उपयोग करके शुद्धिकरण ने शुद्ध Hisx6-pro-MMP-3cd की उपज में सुधार किया। सक्रियण और desalting पर, समर्थक डोमेन एन-टर्मिनल हिस-टैग के साथ cleaved है, विट्रो अनुप्रयोगों में अनगिनत में तत्काल उपयोग के लिए सक्रिय MMP-3cd प्रदान करते हैं। इस विधि को महंगे उपकरण या जटिल संलयन प्रोटीन की आवश्यकता नहीं होती है और बैक्टीरिया में पुनः संयोजक मानव एमएमपी के तेजी से उत्पादन का वर्णन करता है।

एसडीएस-पेज पर नमूने चलाते समय, क्योंकि प्रोटीन को अघुलनशील समावेशन निकायों के रूप में व्यक्त किया जाता है, लिसेटेड और सोनिकेटेड अंशों में कोई हिसक्स 6-प्रो-एमएमपी-3सीडी अर्क नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्र...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

उनके टैग शुद्धिकरण, डायलिसिस, और सक्रियण बैक्टीरिया में घुलनशील, सक्रिय मैट्रिक्स metaloproteinase-3 उत्प्रेरक डोमेन प्रोटीन अभिव्यक्ति की पैदावार बढ़ाने के लिए नियोजित कर रहे हैं। प्रोटीन अंशों का विश्लेषण एसडीएस-पेज जैल के माध्यम से किया जाता है।

बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और मानव मैट्रिक्स Metaloproteinase-3 के शुद्धिकरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

यह विस्तृत प्रोटोकॉल ई.कोलाई में पुनः संयोजक एमएमपी -3 उत्प्रेरक डोमेन के लिए जीवाणु अभिव्यक्ति की एक अत्यधिक कुशल और लागत प्रभावी विधि का वर्णन करता है, जिसे अन्य एमएमपी चिकित्सीय लक्ष्यों पर लागू किया जा सकता है। ई कोलाई में एक जटिल प्रोटीन तह और पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रोसेसिंग सिस्टम का अभाव है। यह विधि ई.कोलाई में यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए R2DP सेल तनाव का उपयोग करती है।विशिष्ट एमएमपी के अधिक उत्पादन से कैंसर, हृदय और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों जैसी कई बीमारियां होती हैं। सक्रिय घुलनशील एमएमपी एमएमपी बाधा therapeutics के विकास के लिए आवश्यक हैं. पीईटी के एक एकल पृथक कॉलोनी को टीका लगाना उनके टैग समर्थक एमएमपी -3 उत्प्रेरक डोमेन ट्रांसफॉर्मेंट एक एलबी एम्पिसिलिन क्लोरैम्फेनिकोल प्रतिरोधी प्लेट से एलबी एम्पिसिलिन क्लोरैम्फेनिकोल प्रतिरोधी प्लेट में 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी एम्पिसिलिन क्लोराम्फेनिकोल प्रतिरोधी मीडिया के पांच मिलीलीटर में।प्रत्येक संस्कृति से ऐलीकोट सहेजें और 40% ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करें। एलबी एम्पीसिलिन क्लोराम्फेनिकोल प्रतिरोधी माध्यम के 500 मिलीलीटर युक्त एक लीटर फ्लास्क को रात भर की संस्कृति के साथ 600 नैनोमीटर पर 0.05 से 0.1 के ऑप्टिकल घनत्व के लिए टीका लगाएं। कई समय बिंदुओं पर 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें, आमतौर पर तीन से चार घंटे के लिए जब तक कि यह 0.4 और 0.6 के बीच नहीं गिरता।एक मोलर आईपीटीजी स्टॉक के साथ संस्कृतियों को एक मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रेरित करें। एक अतिरिक्त तीन से चार घंटे के लिए 37 डिग्री शेकर में इनक्यूबेट करें। 13, 000 जी और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 250 मिलीलीटर शंक्वाकार बोतलों में कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, जब तक कि संस्कृतियों को पूरी तरह से गोली नहीं मार दी जाती है।गोली के प्रति ग्राम lysis बफर के तीन milliter जोड़ें और vortexing या pipetting द्वारा गोली resuspend. 1.25 मिलीलीटर 10% वजन के 1.25 मिलीलीटर को एक लीटर प्रति लीटर संस्कृति की मात्रा सोडियम डीऑक्सीकोलेट द्वारा जोड़ें। संस्कृति के प्रति एक लीटर DNase मैं के 10 microliters जोड़ें.150 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं। 13, 000 जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। supernatant को छोड़ दें।ऊपर और नीचे pipetting द्वारा शामिल शरीर बफर के प्रति लीटर संस्कृति 100 milliters में गोली resuspend. overheating को रोकने के लिए sonication के दौरान बर्फ पर नमूने रखें। 15 सेकंड के छह चक्रों के लिए प्रत्येक नमूने को Sonicate, पांच का एक आउटपुट और एक 50% पल्स।13, 000 जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें। गोली की जाँच करें। यदि गोली कॉम्पैक्ट है, तो supernatant को छोड़ दें।एक लीटर संस्कृति और घुलनशीलता बफर के पांच milliliters से प्रत्येक गोली resuspend. प्रोटीन को घुलनशील बनाने की अनुमति देने के लिए बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 13, 000 बार G पर चार डिग्री सेल्सियस में सेंट्रीफ्यूज करें।यदि छर्रे centrifugation के बाद रूपों, supernatant एक अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डालना. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा संस्कृति के प्रति एक लीटर घुलनशीलता बफर के एक और पांच milliliters में गोली resuspend. 13, 000 जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।इसके बाद, supernatants खींचें। गोली को छोड़ दें या अतिरिक्त sonication के लिए इसे माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एचटी वॉश बफर के खिलाफ रिक्त और पहले धोने के अंश के A280 रिकॉर्ड।अन्य अंशों के साथ दोहराएँ जब तक A280 आधार रेखा तक पहुँचता है। एचटी क्षालन बफर के पांच मिलीलीटर जोड़कर तुरंत अपने-टैग किए गए प्रोटीन को हटा दें। 0.5 से एक मिलीलीटर अंशों पर प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में एचटी क्षालन लेबल.क्षालन अंश के A280 को मापें। यदि A280 0.3 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर से अधिक है, तो HT संतुलन बफर के साथ अंश को पतला करें। डायलिसिस बफर एक के एक लीटर में डायलिसिस टयूबिंग में eluted एमएमपी अंशों को डुबोएं और चार डिग्री सेल्सियस पर कम से कम आठ घंटे के लिए चुंबकीय हलचल पर टयूबिंग और इसकी सामग्री को हिलाएं।डायलिसिस बफर दो के एक लीटर के लिए स्थानांतरण और चार डिग्री सेल्सियस पर कम से कम आठ घंटे के लिए एक चुंबकीय हलचल पर टयूबिंग और इसकी सामग्री हलचल हलचल। इसके बाद, डायलिसिस बफर तीन के एक लीटर में स्थानांतरित करें और चार डिग्री सेल्सियस पर आठ घंटे से कम समय के लिए चुंबकीय हलचल पर टयूबिंग और इसकी सामग्री को हिलाएं। नमूना को एक उपयुक्त कंटेनर में स्थानांतरित करें और उन्हें डायल किए गए एमएमपी के रूप में लेबल करें।किसी भी अवक्षेप के लिए ट्यूब की जांच करें। प्रति मिलीलीटर एमएमपी प्रति मिलीग्राम के एक मिलीलीटर ऐलीकोट, एक मिलीमोलर की अंतिम एपीएमए एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 20 मिलीमोलर एपीएमए के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। यदि एक अवक्षेप बनता है, तो इसे चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज करें।एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब सक्रिय एमएमपी लेबल में supernatant स्टोर. APMA अपशिष्ट के लिए चिह्नित कंटेनर में अवक्षेप को छोड़ दें। SDS-PAGE R2DP कोशिकाओं में BL21 DE3 कोशिकाओं से अपने-टैग प्रो MMP-3 उत्प्रेरक डोमेन के अपने-टैग शुद्धिकरण क्षालन अंशों की तुलना करने के लिए चलाया गया था।उनके-टैग किए गए एमएमपी उत्प्रेरक डोमेन और BL21 DE3 कोशिकाओं के पहले आठ क्षालन अंशों ने R2DP कोशिकाओं में अपने-टैग किए गए MMP उत्प्रेरक डोमेन की तुलना में कम प्रोटीन दिखाया। प्रेरित, refolded, केंद्रित, सक्रिय, और MMP3 CD और R2DP कोशिकाओं के desalted अंश दिखाए जाते हैं। सक्रियण पर, सक्रिय एमएमपी -3 सीडी बैंड का आणविक वजन लगभग 20 किलोडाल्टन है, जैसा कि उनके टैग किए गए जाइमोजेन के विपरीत है जो लगभग 30 किलोडाल्टन पर रहता है।जब कोशिका lysates centrifuging, छर्रों कॉम्पैक्ट नहीं हो सकता है. जब ऐसा होता है, तो sonicate और अधिक समय तक सेंट्रीफ्यूज। प्रोटीन को फिर से केंद्रित करते समय, वर्षा हो सकती है।इसे घुलनशीलता बफर में भंग करें और प्रक्रिया को दोहराएं। यहां वर्णित प्रक्रिया सक्रिय मानव एमएमपी की घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करती है जिसका उपयोग अंततः एमएमपी एंजाइमेटिक गतिविधि के आणविक तंत्र को समझने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक प्रोटीन शुद्धिकरण विधियों जैसे कि एफपीएलसी को शुद्ध एमएमपी प्रोटीन के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, अभिव्यक्ति, शोधन, और मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के क्रिस्टलीकरण के लिए बाध्य<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

संयंत्र आइस recrystallization निषेध और अलगाव के मूल्यांकन के माध्यम से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन आइस आत्मीयता शोधन का उपयोग करते हुए की पहचान

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzymatically सक्रिय जी -4 Resolvase1 की शुद्धि के लिए एक जी quadruplex डीएनए आत्मीयता दृष्टिकोण

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

एस 100 ए 12 की अभिव्यक्ति, शुद्धि और रोगाणुरोधी गतिविधि

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

स्तनधारी Bestrophin आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और शुद्धि

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

टैग नल का उपयोग कर Chloroplast Translocon प्रोटीन परिसरों का अपनत्व शुद्धिकरण

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

अभिव्यक्ति, घुलनबिलीकरण, और यूकार्योटिक बोरेट ट्रांसपोर्टरों की शुद्धि

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...