Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Эветт Радиски и Александру Хокла из клиники Майо в Джексонвилле, штат Флорида, за предоставление плазмиды pET-3a-pro-MMP-3cd в качестве шаблона для клонирования гена Hisx6pro-MMP-3cd, и их комментарии вместе с доктором Полом Хартли из Центра геномики Невады в Университете Невады, Рино, для секвенирования ДНК. Авторы также хотели бы поблагодарить Кассандру Хергенрайдер за помощь с частью экспрессии белка. М.Р.-С. хотели бы поблагодарить грант NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience и грант UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

1. Выражение MMP
<ol><li>Клонирование и преобразование pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd в ячейки R2DP<ol>
<li>Переваривайте плазмиду pET-3a (см. Таблицу материалов) ферментами рестрикции NdeI и BamHI в пищеварительном буфере (см. Таблицу материалов). В общем реакционном объеме 40 мкл добавьте 4 мкл...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method.">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).</li><li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography.">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).</li><li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

Крупномасштабное производство растворимых, человеческих, рекомбинантных MMP остается сложной задачей. Клетки млекопитающих могут экспрессировать функциональные MMP при высоких затратах и длительном времени ожидания, тогда как E. coli быстро производит большое количество тел включен...

Большинство сложных эукариотических белков подвергаются сложным посттрансляционным модификациям после экспрессии, требуя высокоэффективного сворачивания белка и кофакторов, чтобы быть функциональными1. Производство большого количества растворимого человеческого белка в бактериальном хозяине остается серьезной проблемой из-за высоких затрат и отсутствия надежных методов экспрессии и очистки, даже для небольших лабораторных экспериментов2,3. MMP, эндопептидазы человека с большой молекулярной массой, обычно экспрессируются в виде нерастворимых тел включения при экспрессии в E. coli. Экстракция растворимых человеческих MMP часто приводит к трудоемкому, трудоемкому процессу солюбилизации и повторного складывания4.
MMP играют решающую роль как в физиологических, так и в патогенных процессах. Человеческие MMP представляют собой семейство из 23 эндопептидаз цинка, классифицированных по структуре и специфичности субстрата и дифференциально выраженных, несмотря на высокосохраняемый каталитический домен5,6. ММП секретируются в виде неактивных зимогенов, регулируемых посредством посттрансляционной активации и их эндогенных ингибиторов, тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП)7,8,9,10. Хотя первоначально признана их роль в обороте ECM, MMP также были вовлечены в разработку, морфогенез, восстановление тканей и ремоделирование8. Дисрегуляция MMP была особенно связана с раком наряду с нейродегенеративными, сердечно-сосудистыми и фиброзными заболеваниями, среди других заболеваний5,7.
Разработка надежных крупномасштабных методов производства MMP имеет решающее значение для обеспечения успеха будущих исследований механизмов MMP с помощью биохимических и клеточных анализов. Различные MMP ранее экспрессировались в бактериях11, включая MMP с тегами Hisx6, без изменения активности MMP12,13,14,15. Однако эти методы включают утомительные, длительные шаги, которые может быть трудно воспроизвести.
Клетки млекопитающих также могут быть использованы для экспрессии многих различных человеческих белков, обеспечивая при этом надлежащие посттрансляционные модификации16. Хотя система экспрессии млекопитающих является идеальным выбором для получения рекомбинантных человеческих белков с надлежащими посттрансляционными модификациями, основными недостатками этого метода являются начальные низкие выходы, дорогостоящие питательные среды и реагенты, длительные сроки достижения стабильных линий экспрессии и риск заражения другими видами, такими как грибы или бактерии2,11 . Кроме того, производство MMP в клеточных линиях млекопитающих дает примеси из ассоциированных клеточных белков, таких как TIMPs или фибронектины11. В отличие от медленного роста клеток, наблюдаемого в клетках млекопитающих, система экспрессии бактерий предлагает крупномасштабное производство белка за короткий период времени наряду с более простыми средами и потребностями роста. Однако из-за отсутствия других ассоциированных клеточных белков (т.е. ТИМП) в системах экспрессии бактерий активные MMP в более высоких концентрациях подвергаются деградации в результате аутопротеолиза, что приводит к низкому выходу MMP17.
В данной работе описан подробный метод бактериальной экспрессии, очистки и активации рекомбинантного Hisx6-pro-MMP-3cd с использованием E. coli в качестве хозяина экспрессии благодаря его доступности, простоте и успеху в получении более высоких выходов MMP2,3,18. Поскольку E. coli не имеет механизма сворачивания белка и посттрансляционной обработки, необходимых для рекомбинантных MMP и других сложных белков, многие штаммы E. coli были разработаны для преодоления этих ограничений, что делает E. coli более подходящим хозяином для экспрессии рекомбинантного человеческого MMP-3cd,19,20 . Например, штамм R2DP, используемый в этом исследовании, усиливает эукариотическую экспрессию, поставляя резистентную к хлорамфениколу плазмиду, содержащую кодоны, редко используемые в E. coli.
Как описано в этом протоколе, после сверхэкспрессии относительно чистых тел включения из вектора pET-3a (рисунок 1) в клетках R2DP белки каталитического домена Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) экстрагируются и денатурируются4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 очищали с помощью аффинной метки хроматографии. При рефолдинге и диализе про-MMP-3cd (зимоген) активировали 4-аминофенилртумучевым ацетатом (APMA), а анализ SDS-PAGE используется для оценки выходов и необходимости дальнейшей очистки5,21. Этот протокол описывает экспрессию, очистку и активацию растворимого MMP-3cd в качестве примера. Тем не менее, он также может быть использован в качестве руководства для экспрессии других MMP и человеческих протеаз с аналогичной экспрессией и механизмами активации (рисунок 2). Для других белков, отличных от MMP-3cd, читателю рекомендуется определить оптимальные буферные композиции и методы для их целевого белка, прежде чем пытаться использовать этот протокол.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Рисунок 1: Плазмидная карта плазмиды pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. Вектор pET-3a включает ген устойчивости к ампициллину. N-концевая последовательность Hisx6-tag клонируется в вектор на основе pET-3a, включая pro-MMP-3cd, чтобы получить конструкцию pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd под контролем промотора T7 между сайтами ограничения BamHI и NdeI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Рисунок 2: Бактериальная экспрессия про-MMP-3cd, очистка, рефолдация и активация. 1.1: плазмида pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd трансформировалась в клетки BL21(DE3) или R2DP. 1.2: Экспрессия белка Pro-MMP-3cd была индуцирована с использованием IPTG. 1.3: Химический лизис и обработка ультразвуком используются для извлечения белков Hisx6-pro-MMP-3cd, которые в основном нерастворимы и обнаруживаются в телах включения. Мочевина использовалась для денатурации и солюбилизации белка из тел включения. 2.1. Денатурированный белок Hisx6-pro-MMP-3cd очищали с помощью аффинной хроматографической очистки. 3. Элюированный Hisx6-pro-MMP-3cd медленно переворачивался во время диализа путем постепенного удаления мочевины из буфера. 4. Наконец, восстановленный белок MMP-3cd был активирован с использованием APMA путем удаления N-концевого пропептидного домена. APMA позже удаляется из раствора путем обессоливания. Номера соответствуют разделам протокола, описывающим эти шаги. Сокращения: MMP-3cd = Матричный металлопротеиназы-3 каталитический домен; APMA = 4-аминофенилртутный ацетат. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

Матриксные металлопротеиназы (MMP) принадлежат к семейству протеаз метцинцина с центральной ролью в деградации и ремоделировании внеклеточного матрикса (ECM), а также взаимодействиях с несколькими факторами роста и цитокинами. Сверхэкспрессия специфических MMP ответственна за несколько заболеваний, таких как рак, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. В последнее время MMP находятся в центре внимания в качестве мишеней для разработки терапевтических средств, которые могут лечить заболевания, коррелирующие с гиперэкспрессией MMP.
Для изучения механизма MMP в растворе необходимы более легкие и надежные методы экспрессии и очистки рекомбинантного белка для производства активных, растворимых MMP. Однако каталитический домен большинства MMP не может быть выражен в Escherichia coli (E. coli) в растворимой форме из-за отсутствия посттрансляционного механизма, тогда как системы экспрессии млекопитающих обычно являются дорогостоящими и имеют более низкие выходы. Органы включения MMP должны пройти утомительный и трудоемкий процесс обширной очистки и переворачивания, значительно снижая выход MMP в нативной конформации. В данной работе представлен протокол с использованием клеток Rosetta2(DE3)pLysS (далее именуемых R2DP) для получения матричного металлопротеиназы-3 каталитического домена (MMP-3cd), который содержит N-концевую His-метку, за которой следует про-домен (Hisx6-pro-MMP-3cd) для использования в аффинной очистке. Клетки R2DP усиливают экспрессию эукариотических белков через резистентную к хлорамфениколу плазмиду, содержащую кодоны, обычно редкие в системах экспрессии бактерий. По сравнению с традиционной клеточной линией выбора для экспрессии рекомбинантного белка, BL21(DE3), очистка с использованием этого нового штамма улучшила выход очищенного Hisx6-pro-MMP-3cd. После активации и обессоливания домен pro расщепляется вместе с N-терминалом His-tag, обеспечивая активный MMP-3cd для немедленного использования в бесчисленных приложениях in vitro . Этот метод не требует дорогостоящего оборудования или сложного слияния белков и описывает быстрое производство рекомбинантных человеческих MMP в бактериях.

При запуске образцов на SDS-PAGE, поскольку белок экспрессируется в виде нерастворимых тел включения, лизированные и обработанные ультразвуком фракции должны практически не содержать экстракта Hisx6-pro-MMP-3cd, так как белок еще не был повторно растворен в мочевине. На рисунке 3 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Его-меточная очистка, диализ и активация используются для повышения выхода растворимой, активной матриксной металлопротеиназы-3 каталитического домена экспрессии белка у бактерий. Белковые фракции анализируются с помощью гелей SDS-PAGE.

Бактериальная экспрессия и очистка металлопротеиназы-3 матрицы человека с помощью аффинной хроматографии

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Этот подробный протокол описывает высокоэффективный и экономически эффективный метод экспрессии бактерий для рекомбинантного каталитического домена MMP-3 в E.Coli, который может быть применен к другим терапевтическим мишеням MMP. E.coli не имеет сложной системы сворачивания белка и посттрансляционной обработки. Этот метод использует штамм клеток R2DP для усиления экспрессии эукариотического белка в E.coli.Перепроизводство специфических MMP приводит к нескольким заболеваниям, таким как рак, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания. Активные растворимые ММП необходимы для разработки терапевтических средств, ингибирующих ММП. Инокулируют одну изолированную колонию трансформанта каталитического домена pET His-tag pro MMP-3 из пластины, устойчивой к ампициллину хлорамфениколу LB, в пяти миллилитрах устойчивой среды LB ампициллина хлорамфеникола при 37 градусах Цельсия.Сохраните аликвоты из каждой культуры и подготовьте 40% запасов глицерина. Привить однолитровую колбу, содержащую 500 миллилитров lb ампициллина хлорамфеникола, устойчивую к среде, до оптической плотности от 0,05 до 0,1 при 600 нанометрах с ночной культурой. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометров в нескольких временных точках, обычно в течение трех-четырех часов, пока она не упадет между 0,4 и 0,6.Индуцировать культуры с одним молярным запасом IPTG до конечной концентрации одного миллимоляра. Насиживайте в шейкере с температурой 37 градусов в течение дополнительных трех-четырех часов. Центрифугируйте клетки в конических бутылках по 250 миллилитров при 13 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, повторяя до тех пор, пока культуры не будут полностью гранулированы.Добавьте три миллилитра лизисного буфера на грамм гранулы и повторно суспендируйте гранулу путем вихря или пипетирования. Добавьте 1,25 миллилитра массой 10% по объему дезоксихолата натрия на один литр культуры. Добавьте 10 микролитров ДНКазы I на один литр культуры.Встряхните при комнатной температуре в течение 30 минут при 150 об/мин. Центрифуга в течение 10 минут при 13 000 G и четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант.Повторно суспендировать гранулу по 100 миллилитров на литр культуры включения тела буфера путем пипетки вверх и вниз. Храните образцы на льду во время обработки ультразвуком, чтобы предотвратить перегрев. Обрабатывайте каждый образец ультразвуком в течение шести циклов по 15 секунд, выход пять и 50% импульс.Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 13 000 G и четырех градусах Цельсия. Проверьте гранулу. Если гранула компактная, откажитесь от супернатанта.Повторно суспендируйте каждую гранулу из однолитровой культуры и пяти миллилитров солюбилизационного буфера. Инкубируйте в течение не менее 30 минут на льду, чтобы позволить белкам солюбилизироваться. Центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 13 000 G в четыре градуса Цельсия.Если гранула образуется после центрифугирования, перелейте супернатант в отдельную коническую трубку объемом 50 миллилитров. Повторно суспендируйте гранулу еще в пяти миллилитрах буфера солюбилизации на один литр культуры путем пипетирования вверх и вниз. Центрифуга в течение 10 минут при 13 000 G и четырех градусах Цельсия.Далее потяните супернатанты. Выбросьте гранулу или храните ее при минус 80 градусах Цельсия для дополнительной обработки ультразвуком. Заготовьте против буфера промывки HT и запишите A280 первой фракции промывки.Повторяйте с другими фракциями до тех пор, пока A280 не приблизится к исходному уровню. Немедленно элюируют помеченные His белки, добавляя пять миллилитров буфера элюирования HT. Соберите проточную фракцию от 0,5 до одного миллилитра в микрофьюжных пробирках с маркировкой HT elution.Измерьте A280 фракции элюирования. Если A280 больше 0,3 миллиграмма на миллилитр, разбавьте фракцию буфером равновесия HT. Погрузите элюированные фракции MMP в диализную трубку в один литр диализного буфера и перемешайте трубку и ее содержимое на магнитном перемешивании в течение не менее восьми часов при четырех градусах Цельсия.Переложите на один литр диализа буфер два и перемешайте трубку и ее содержимое на магнитном перемешивании в течение не менее восьми часов при четырех градусах Цельсия. Далее перекладывают на один литр диализного буфера три и перемешивают трубку и ее содержимое на магнитном перемешивании в течение не менее восьми часов при четырех градусах Цельсия. Перенесите образец в соответствующий контейнер и пометьте его как набранный MMP.Осмотрите трубку на наличие осадка. На один миллилитр аликвоты одного миллиграмма на миллилитр MMP добавьте 50 микролитров 20 миллимолярных APMA, чтобы достичь конечной концентрации APMA в один миллимоляр. Если образуется осадок, центрифугируйте его с максимальной скоростью в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Храните супернатант в 1,5-миллилитровой микрофьюжной трубке с маркировкой активированный MMP. Выбросьте осадок в контейнер, маркированный для отходов APMA. SDS-PAGE был запущен для сравнения фракций элюирования очистки His-tag каталитического домена His-tag pro MMP-3 из клеток BL21 DE3 в ячейках R2DP.Первые восемь элюционных фракций помеченного His каталитического домена MMP и клеток BL21 DE3 показали меньше белка, чем в каталитическом домене MMP с меткой His в клетках R2DP. Показаны индуцированные, реконвертированные, концентрированные, активированные и обессоленные фракции клеток MMP3 CD и R2DP. При активации молекулярная масса активированного диапазона MMP-3 CD составляет примерно 20 килодалтонов, в отличие от помеченного Гисом зимогена, который остается на уровне около 30 килодалтонов.При центрифугировании клеточных лизатов гранулы могут быть не компактными. Когда это произойдет, больше увлажняйте ультразвуком и дольше центрифугируйте. При реконцентрации белка может произойти осаждение.Растворите его в буфере солюбилизации и повторите процесс. Процедура, описанная здесь, предоставляет подробный метод растворимой экспрессии активных человеческих MMP, который в конечном итоге может быть использован для понимания молекулярного механизма ферментативной активности MMP. Альтернативные методы очистки белка, такие как FPLC, могут быть выполнены для очищенных белков MMP.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...