Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
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Evette Radisky y Alexandra Hockla en la Clínica Mayo en Jacksonville, Florida, por proporcionar el plásmido pET-3a-pro-MMP-3cd como la plantilla para clonar el gen Hisx6pro-MMP-3cd, y sus comentarios, junto con el Dr. Paul Hartley del Centro de Genómica de Nevada en la Universidad de Nevada, Reno, para la secuenciación del ADN. Los autores también desean agradecer a Cassandra Hergenrader por ayudar con parte de la expresión de proteínas. M.R.-S. desea agradecer la subvención NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience y el PREMIO UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

1. Expresión MMP
<ol><li>Clonación y transformación de pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd en células R2DP<ol>
<li>Digerir el plásmido pET-3a (ver la Tabla de Materiales) con enzimas de restricción NdeI y BamHI en Digest Buffer (ver la Tabla de Materiales). En un volumen total de reacción de 40 μL, agregue 4 μL de Digest Buffer, 33 μL de plásmido de 100 ng / μL y 1.5 μL de cada enzima de restricción y permita que la reacción continúe durante ~ 2 h hasta su finaliz...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

La producción a gran escala de MMP solubles, humanos y recombinantes sigue siendo una tarea desafiante. Las células de mamíferos pueden expresar MMP funcionales a altos costos y largos tiempos de espera, mientras que E. coli produce rápidamente altas cantidades de cuerpos de inclusión MMP que deben ser purificados y replegados11,16. Las células R2DP aumentan significativamente el rendimiento de los cuerpos de inclusión MMP, lo que permite un proce...

La mayoría de las proteínas eucariotas complejas sufren elaboradas modificaciones posttraduccionales después de la expresión, requiriendo un plegamiento de proteínas altamente asistido y cofactores para ser funcionales1. La producción de grandes cantidades de proteína humana soluble en un huésped bacteriano sigue siendo un desafío importante debido a los altos costos y la falta de métodos robustos de expresión y purificación, incluso para experimentos de laboratorio a menor escala2,3. Las MMP, endopeptidasas humanas con gran peso molecular, generalmente se expresan como cuerpos de inclusión insolubles cuando se expresan en E. coli. La extracción de MMP humanas solubles a menudo conduce a un laborioso y lento proceso de solubilización y repliega4.
Las MMP tienen funciones críticas tanto en procesos fisiológicos como patógenos. Las MMP humanas son una familia de 23 endopeptidasas de zinc, categorizadas por estructura y especificidad de sustrato, y expresadas diferencialmente a pesar de un dominio catalítico altamente conservado5,6. Las MMP se secretan como zimogenas inactivas, reguladas a través de la activación posttraduccional y sus inhibidores endógenos, inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP)7,8,9,10. Aunque inicialmente se reconocieron por su papel en el recambio de ECM, las MMP también se han implicado en el desarrollo, la morfogénesis, la reparación de tejidos y la remodelación8. La desregulación de las MMP se ha relacionado notablemente con el cáncer junto con las enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y fibróticas, entre otras enfermedades5,7.
El desarrollo de métodos robustos de producción de MMP a gran escala es fundamental para garantizar el éxito de futuros estudios de mecanismos de MMP a través de ensayos bioquímicos y basados en células. Varias MMP se han expresado previamente en bacterias11, incluidas las MMP marcadas con Hisx6, sin alterar la actividad de MMP12,13,14,15. Sin embargo, estos métodos incluyen pasos tediosos y largos que pueden ser difíciles de replicar.
Las células de mamíferos también se pueden utilizar para expresar muchas proteínas humanas diferentes al tiempo que garantizan las modificaciones posttraduccionales adecuadas16. Aunque el sistema de expresión de mamíferos es una opción ideal para producir proteínas humanas recombinantes con modificaciones post-traduccionales adecuadas, las principales desventajas de este método son los bajos rendimientos iniciales, los costosos medios de crecimiento y reactivos, los largos plazos para alcanzar líneas de expresión estables y el riesgo de contaminación con otras especies como hongos o bacterias2,11 . Además, la producción de MMP en líneas celulares de mamíferos produce impurezas a partir de proteínas celulares asociadas como TIMPs o fibronectinas11. A diferencia del lento crecimiento celular observado en las células de mamíferos, el sistema de expresión bacteriana ofrece una producción de proteínas a gran escala en un corto período de tiempo junto con medios y requisitos de crecimiento más simples. Sin embargo, debido a la falta de otras proteínas celulares asociadas (es decir, TIMP) en los sistemas de expresión bacteriana, las MMP activas a concentraciones más altas están sujetas a degradación a través de la autoproteólisis, lo que resulta en un rendimiento deficiente de MMP17.
Este artículo describe un método detallado para la expresión bacteriana, purificación y activación de Hisx6-pro-MMP-3cd recombinante utilizando E. coli como huésped de expresión debido a su asequibilidad, simplicidad y éxito en la producción de mayores rendimientos de MMPs2,3,18. Dado que E. coli carece de la maquinaria de plegamiento de proteínas y el procesamiento posttraduccional requerido para las MMP recombinantes y otras proteínas complejas, muchas cepas de E. coli han sido diseñadas para superar estas limitaciones, haciendo de E. coli un huésped más adecuado para la expresión de MMP-3cd humano recombinante,19,20 . Por ejemplo, la cepa R2DP utilizada en este estudio mejora la expresión eucariota al suministrar un plásmido resistente al cloranfenicol que contiene codones raramente utilizados en E. coli.
Como se describe en este protocolo, después de la sobreexpresión de cuerpos de inclusión relativamente puros del vector pET-3a (Figura 1) en células R2DP, se extraen y desnaturalizan las proteínas del dominio catalítico Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd)4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 se purificó mediante cromatografía de etiqueta de afinidad. Tras el repliegue y la diálisis, el pro-MMP-3cd (zymogen) fue activado por acetato de 4-aminofenilmercúrico (APMA), y el análisis SDS-PAGE se utiliza para evaluar los rendimientos y la necesidad de una mayor purificación5,21. Este protocolo describe la expresión, purificación y activación de MMP-3cd soluble como ejemplo. Sin embargo, también se puede utilizar como guía para la expresión de otras MMP y proteasas humanas con expresión similar, y mecanismos de activación (Figura 2). Para otras proteínas distintas de MMP-3cd, se recomienda al lector que determine las composiciones tampón óptimas y los métodos para su proteína objetivo antes de intentar este protocolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Figura 1: Mapa plásmido del plásmido pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. El vector pET-3a incluye un gen de resistencia a la ampicilina. Una secuencia de etiquetas Hisx6 N-terminal se clona en el vector basado en pET-3a, incluyendo pro-MMP-3cd, para producir la construcción pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd bajo control del promotor T7 entre los sitios de restricción BamHI y NdeI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Figura 2: Expresión bacteriana del plásmido pro-MMP-3cd, purificación, repliegue y activación. 1.1: El plásmido pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd se transformó en células BL21(DE3) o R2DP. 1.2: La expresión de la proteína Pro-MMP-3cd se indujo mediante IPTG. 1.3: La lisis química y la sonicación se utilizan para extraer proteínas Hisx6-pro-MMP-3cd que son principalmente insolubles y se encuentran en los cuerpos de inclusión. La urea se utilizó para desnaturalizar y solubilizar proteínas de los cuerpos de inclusión. 2.1. La proteína Hisx6-pro-MMP-3cd desnaturalizada se purificó mediante cromatografía por afinidad. 3. El Hisx6-pro-MMP-3cd eluido se replegó lentamente durante la diálisis a través de la eliminación gradual de la urea del tampón. 4. Finalmente, la proteína MMP-3cd replegada se activó utilizando APMA mediante la eliminación del dominio propéptido N-terminal. APMA se elimina más tarde de la solución a través de la desalinización. Los números corresponden a las secciones del protocolo que describen estos pasos. Abreviaturas: MMP-3cd = Dominio catalítico de la metaloproteinasa-3 de la matriz; APMA = acetato de 4-aminofenilmercúrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

Las metaloproteinasas de matriz (MMP) pertenecen a la familia de las proteasas de metzincina con funciones centrales en la degradación y remodelación de la matriz extracelular (ECM), así como interacciones con varios factores de crecimiento y citoquinas. La sobreexpresión de MMP específicos es responsable en varias enfermedades como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades cardiovasculares. Los MMP han sido el centro de atención recientemente como objetivos para desarrollar terapias que puedan tratar enfermedades correlacionadas con la sobreexpresión de MMP.
Para estudiar el mecanismo MMP en solución, se necesitan métodos de expresión y purificación de proteínas recombinantes más fáciles y robustos para la producción de MMP activos y solubles. Sin embargo, el dominio catalítico de la mayoría de las MMP no se puede expresar en Escherichia coli (E. coli) en forma soluble debido a la falta de maquinaria posttraduccional, mientras que los sistemas de expresión de mamíferos suelen ser costosos y tienen rendimientos más bajos. Los cuerpos de inclusión MMP deben someterse al tedioso y laborioso proceso de purificación y repliega extensos, reduciendo significativamente el rendimiento de las MMP en la conformación nativa. Este artículo presenta un protocolo que utiliza células Rosetta2(DE3)pLysS (en adelante, R2DP) para producir el dominio catalítico de la metaloproteinasa-3 de la matriz (MMP-3cd), que contiene una etiqueta His-terminal N seguida de pro-dominio (Hisx6-pro-MMP-3cd) para su uso en la purificación de afinidad. Las células R2DP mejoran la expresión de proteínas eucariotas a través de un plásmido resistente al cloranfenicol que contiene codones normalmente raros en los sistemas de expresión bacteriana. En comparación con la línea celular tradicional de elección para la expresión de proteínas recombinantes, BL21 (DE3), la purificación con esta nueva cepa mejoró el rendimiento de Hisx6-pro-MMP-3cd purificado. Tras la activación y desalinización, el dominio pro se divide junto con la etiqueta His-tag N-terminal, proporcionando MMP-3cd activo para uso inmediato en innumerables aplicaciones in vitro . Este método no requiere equipos costosos o proteínas de fusión complejas y describe la producción rápida de MMP humanos recombinantes en bacterias.

Al ejecutar muestras en SDS-PAGE, debido a que la proteína se expresa en forma de cuerpos de inclusión insolubles, las fracciones lisadas y sonicadas deben contener poco o ningún extracto de Hisx6-pro-MMP-3cd, ya que la proteína aún no se ha resuelto en urea. La Figura 3 compara las fracciones de elución de purificación his-tag de Hisx6-pro-MMP-3cd de células BL21(DE3) y células R2DP. Las fracciones de elución se agruparon por separado para las células BL21(DE3) y R2DP antes de la...

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Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

La purificación, diálisis y activación de His-tag se emplean para aumentar los rendimientos de la expresión de proteínas del dominio catalítico soluble y activo metaloproteinasa-3 en bacterias. Las fracciones de proteínas se analizan a través de geles SDS-PAGE.

Expresión bacteriana y purificación de la metaloproteinasa-3 de matriz humana mediante cromatografía de afinidad

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Este protocolo detallado describe un método altamente eficiente y rentable de expresión bacteriana para el dominio catalítico recombinante MMP-3 en E.Coli, que se puede aplicar a otras dianas terapéuticas MMP. E.coli carece de un complejo sistema de plegamiento de proteínas y procesamiento post-traduccional. Este método utiliza la cepa celular R2DP para mejorar la expresión de proteínas eucariotas en E. coli.La sobreproducción de MMP específicos conduce a varias enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Los MMP solubles activos son necesarios para el desarrollo de terapias inhibidoras de MMP. Inocular una sola colonia aislada de pET His-tag pro MMP-3 transformante de dominio catalítico de una placa lb resistente al cloranfenicol de ampicilina en cinco mililitros de medios resistentes al cloranfenicol de ampicilina LB a 37 grados Celsius.Ahorre alícuotas de cada cultivo y prepare existencias de glicerol al 40%. Inocular un matraz de un litro que contenga 500 mililitros de lb de medio resistente al cloranfenicol de ampicilina LB a una densidad óptica de 0,05 a 0,1 a 600 nanómetros con el cultivo nocturno. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros en varios puntos de tiempo, generalmente durante tres o cuatro horas hasta que caiga entre 0.4 y 0.6.Inducir los cultivos con un stock molar de IPTG a una concentración final de un milimolar. Incubar en el agitador de 37 grados durante tres o cuatro horas adicionales. Centrifugar las células en frascos cónicos de 250 mililitros a 13.000 G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, repitiendo hasta que los cultivos estén completamente peletizados.Agregue tres mililitros de tampón de lisis por gramo de pellet y resuspenda el pellet mediante vórtice o pipeteo. Añadir 1,25 mililitros de desoxicolato de sodio al 10% en peso por volumen por un litro de cultivo. Añadir 10 microlitros de DNasa I por un litro de cultivo.Agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos a 150 RPM. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.Resuspend el pellet en 100 mililitros por litro de cultivo de tampón del cuerpo de inclusión mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Mantenga las muestras en hielo durante la sonicación para evitar el sobrecalentamiento. Sonicar cada muestra durante seis ciclos de 15 segundos, una salida de cinco y un pulso del 50%.Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados. Revisa el pellet. Si el pellet es compacto, deseche el sobrenadante.Resuspenda cada pellet de un cultivo de un litro y cinco mililitros de tampón de solubilización. Incubar durante al menos 30 minutos en hielo para permitir que las proteínas se solubilicen. Centrifugar las células durante 10 minutos a 13.000 veces G en cuatro grados centígrados.Si el pellet se forma después de la centrifugación, vierta el sobrenadante en un tubo cónico separado de 50 mililitros. Resuspend el pellet en otros cinco mililitros de tampón de solubilización por un litro de cultivo canalizando hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados.A continuación, tira de los sobrenadantes. Deseche el pellet o guárdelo a menos 80 grados celsius para una sonicación adicional. En blanco contra el tampón de lavado HT y registre el A280 de la primera fracción de lavado.Repita con otras fracciones hasta que A280 se acerque a la línea de base. Eluya inmediatamente las proteínas marcadas con His agregando cinco mililitros de tampón de elución HT. Recoja el flujo a través de fracciones de 0,5 a un mililitro en tubos de microfugios etiquetados como elución HT.Mida el A280 de la fracción de elución. Si el A280 es mayor de 0,3 miligramos por mililitro, diluya la fracción con tampón de equilibrio HT. Sumerja las fracciones de MMP eluidas en tubos de diálisis en un litro de tampón de diálisis uno y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados.Transfiera a un litro de tampón de diálisis dos y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera a un litro de tampón de diálisis tres y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante no menos de ocho horas a cuatro grados centígrados. Transfiera la muestra a un contenedor apropiado y etiquétela como MMP marcada.Examine el tubo en busca de precipitado. Por una alícuota de mililitro de un miligramo por mililitro MMP, agregue 50 microlitros de APMA de 20 milimolares para alcanzar una concentración final de APMA de un milimolar. Si se forma un precipitado, centrímelo a velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Guarde el sobrenadante en un tubo de microfuge de 1,5 mililitros etiquetado como MMP activado. Deseche el precipitado en un recipiente marcado para los residuos de APMA. SDS-PAGE se ejecutó para comparar las fracciones de elución de purificación his-tag del dominio catalítico His-tag pro MMP-3 de células BL21 DE3 en células R2DP.Las primeras ocho fracciones de elución del dominio catalítico MMP marcado con His y las células BL21 DE3 mostraron menos proteína que las del dominio catalítico MMP marcado con His en células R2DP. Se muestran las fracciones inducidas, replegadas, concentradas, activadas y desaladas de las células MMP3 CD y R2DP. Tras la activación, el peso molecular de la banda de CD MMP-3 activada es de aproximadamente 20 kilodaltons, a diferencia del zymogen marcado con His, que permanece en alrededor de 30 kilodaltons.Cuando se lisan las células centrífugas, los gránulos pueden no ser compactos. Cuando eso ocurra, sonicar más y centrifugar por más tiempo. Al reconcentrar la proteína, puede ocurrir precipitación.Disolverlo en tampón de solubilización y repetir el proceso. El procedimiento descrito aquí proporciona un método detallado para la expresión soluble de MMP humanos activos que eventualmente se puede utilizar para comprender el mecanismo molecular de la actividad enzimática MMP. Se pueden realizar métodos alternativos de purificación de proteínas como FPLC a proteínas MMP purificadas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Investigación

Bioquímica

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Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

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A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

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Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

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The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...