Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Författarna vill erkänna Dr. Evette Radisky och Alexandra Hockla vid Mayo Clinic i Jacksonville, Florida, för att tillhandahålla pET-3a-pro-MMP-3cd plasmid som mallen för kloning av Hisx6pro-MMP-3cd genen, och deras kommentarer, tillsammans med Dr. Paul Hartley från Nevada Genomics Center vid University of Nevada, Reno, för DNA-sekvensering. Författarna vill också tacka Cassandra Hergenrader för att hon hjälpte till med en del av proteinuttrycket. M.R.-S. Vill tacka NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience-stipendiet och UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

1. MMP-uttryck
<ol><li>Kloning och omvandling av pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd till R2DP-celler<ol>
<li>Smält pET-3a-plasmiden (se tabellen över material) med NdeI- och BamHI-restriktionsenzymer i Digest Buffer (se Materialtabellen). Tillsätt 4 μL digestbuffert, 33 μL 100 ng/μL plasmid och 1,5 μL av varje restriktionsenzym i en total reaktionsvolym, 33 μL 100 ng/μL plasmid och 1,5 μL av varje restriktionsenzym och låt reaktionen fortsätta i ~2 timmar tills den ?...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method.">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).</li><li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography.">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).</li><li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

Den storskaliga produktionen av lösliga, mänskliga, rekombinanta MMPs är fortfarande en utmanande uppgift. Däggdjursceller kan uttrycka funktionella MMPs till höga kostnader och långa väntetider, medan E. coli snabbt producerar stora mängder MMP-inneslutningsorgan som måste renas och omveckas11,16. R2DP-celler ökar avsevärt utbytet av MMP-inklusionsorgan, vilket möjliggör en mer kostnadseffektiv och produktiv MMP-omveckningsprocess. E. c...

De flesta komplexa eukaryota proteiner genomgår utarbetade posttranslational modifieringar efter uttryck, vilket kräver mycket assisterad proteinveckning och co-faktorer för att vara funktionella1. Att producera stora mängder lösligt humant protein i en bakterievärd är fortfarande en betydande utmaning på grund av höga kostnader och bristen på robusta uttrycks- och reningsmetoder, även för småskaliga laboratorieexperiment2,3. MMPs, mänskliga endopeptidaser med stor molekylvikt, uttrycks vanligtvis som olösliga inklusionsorgan när de uttrycks i E. coli. Extraktion av lösliga mänskliga MMPs leder ofta till en mödosam, tidskrävande solubilisering och omveckningsprocess4.
MMPs har kritiska roller i både fysiologiska och patogena processer. Mänskliga MMPs är en familj av 23 zink endopeptidaser, kategoriserade efter struktur och substrat specificitet, och differentiellt uttryckt trots en mycket bevarad katalytisk domän5,6. MMPs utsöndras som inaktiva zymogener, regleras via posttranslational aktivering och deras endogena hämmare, vävnadshämmare av metalloproteinaser (TIMPs)7,8,9,10. Även om de ursprungligen erkändes för sin roll i ECM omsättning, har MMPs också varit inblandade i utveckling, morfogogenes, vävnad reparation och ombyggnad8. Dysregulation av MMPs har särskilt kopplats till cancer tillsammans med neurodegenerativa, kardiovaskulära och fibrotiska sjukdomar, bland andra sjukdomar5,7.
Utvecklingen av robusta storskaliga MMP-produktionsmetoder är avgörande för att säkerställa framgången för framtida studier av MMP-mekanismer genom biokemiska och cellbaserade analyser. Olika mmps har tidigare uttryckts i bakterier11, inklusive Hisx6-märkta MMPs, utan att ändra MMP-aktivitet12,13,14,15. Dessa metoder innehåller dock tråkiga, långa steg som kan vara svåra att replikera.
Däggdjursceller kan också användas för att uttrycka många olika mänskliga proteiner samtidigt som rätt posttranslational modifieringar säkerställs16. Även om däggdjursuttrycksystemet är ett idealiskt val för att producera rekombinanta humanproteiner med korrekta post-translationella modifieringar, är de största nackdelarna med denna metod initiala låga utbyten, kostsamma tillväxtmedier och reagenser, långa tidslinjer för att nå stabila uttryckslinjer och risk för kontaminering med andra arter som svampar eller bakterier2,11 . Dessutom ger MMP-produktion i däggdjurs cellinjer föroreningar från associerade cellulära proteiner som TIMPs eller fibronectins11. Till skillnad från den långsamma celltillväxt som observerats i däggdjursceller erbjuder bakterieuttryckssystemet storskalig proteinproduktion på kort tid tillsammans med enklare medie- och tillväxtkrav. På grund av bristen på andra associerade cellulära proteiner (dvs. TIMPs) i bakteriella uttryckssystem, utsätts dock aktiva MMPs vid högre koncentrationer för nedbrytning genom autoproteolys, vilket resulterar i dålig MMP-avkastning17.
Detta dokument beskriver en detaljerad metod för bakteriell uttryck, rening och aktivering av rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd med E. coli som uttryck värd på grund av dess överkomliga, enkelhet och framgång i att producera högre avkastning av MMPs2,3,18. Eftersom E. coli saknar de proteinvikningsmaskiner och posttranslational bearbetning som krävs för rekombinanta MMPs och andra komplexa proteiner, har många E. coli-stammar konstruerats för att övervinna dessa begränsningar, vilket gör E. coli till en mer lämplig värd för uttryck av rekombinant mänsklig MMP-3cd,19,20 . Till exempel förbättrar den R2DP-stam som används i denna studie eukaryota uttryck genom att leverera en kloramfenicolresistent plasmid som innehåller kodoner som sällan används i E. coli.
Som beskrivs i detta protokoll, efter överuttryck av relativt rena inklusion organ från pET-3a vektorn (figur 1) i R2DP celler, Hisx6-pro-MMP-3 katalytiska domän (MMP-3cd) proteiner extraheras och denatureras4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 renades med hjälp av affinitet tagg kromatografi. Vid refolding och dialys aktiverades pro-MMP-3cd (zymogen) av 4-aminofenylmercuric acetat (APMA), och SDS-PAGE analys används för att utvärdera avkastningar och behovet av ytterligare rening5,21. Detta protokoll beskriver uttryck, rening och aktivering av lösliga MMP-3cd som ett exempel. Det kan dock också användas som vägledning för uttryck av andra penningmarknadsfonder och mänskliga proteaser med liknande uttryck och aktiveringsmekanismer (figur 2). För andra proteiner än MMP-3cd rekommenderas läsaren att bestämma optimala buffertkompositioner och metoder för deras målprotein innan man försöker detta protokoll.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Bild 1: Plasmid karta över pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. PET-3a vektorn innehåller en ampicillin resistensgen. En N-terminal Hisx6-taggsekvens klonas till den pET-3a-baserade vektorn, inklusive pro-MMP-3cd, för att ge pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-konstruktionen under kontroll av T7-promotorn mellan BamHI och NdeI-begränsningsplatser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Figur 2: Bakteriell uttryck av pro-MMP-3cd, rening, omveckning och aktivering. 1,2: Pro-MMP-3cd protein uttryck inducerades med hjälp av IPTG. 1.3: Kemisk lys och ultraljudsbehandling används för att extrahera Hisx6-pro-MMP-3cd proteiner som huvudsakligen är olösliga och finns i inklusionskropparna. Urea användes för att denaturera och solubilisera protein från inklusionskroppar. 2.1. Denatured Hisx6-pro-MMP-3cd protein renades via affinitet kromatografi rening. 3. Den eluted Hisx6-pro-MMP-3cd var långsamt refolded under dialys genom gradvis avlägsnande av urea från bufferten. 4. Slutligen aktiverades omveckat MMP-3cd protein med APMA genom att ta bort N-terminal pro-peptid domänen. APMA avlägsnas senare från lösningen genom avsaltning. Siffrorna motsvarar protokollavsnitt som beskriver dessa steg. Förkortningar: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domän; APMA = 4-aminofenylmercuric acetat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

Matris metalloproteinases (MMPs) tillhör familjen av metzincin proteaser med centrala roller i extracellulär matris (ECM) nedbrytning och ombyggnad, liksom interaktioner med flera tillväxtfaktorer och cytokiner. Överuttryck av specifika MMPs är ansvarig i flera sjukdomar som cancer, neurodegenerativa sjukdomar och hjärt-kärlsjukdom. MMPs har varit centrum för uppmärksamhet nyligen som mål för att utveckla terapier som kan behandla sjukdomar korrelerade till MMP överuttryck.
För att studera MMP-mekanismen i lösning behövs mer enkla och robusta rekombinanta proteinuttryck och reningsmetoder för produktion av aktiva, lösliga MMPs. Det katalytiska området för de flesta penningmarknadsfonder kan dock inte uttryckas i Escherichia coli (E. coli) i löslig form på grund av brist på posttranslational maskiner, medan däggdjursuttrycksystem vanligtvis är kostsamma och har lägre avkastning. MMP-inklusionsorgan måste genomgå den tråkiga och mödosamma processen med omfattande rening och omveckning, vilket avsevärt minskar avkastningen av MMPs i inhemsk konformation. Detta dokument presenterar ett protokoll som använder Rosetta2(DE3)pLysS (nedan kallad R2DP) celler för att producera matris metalloproteinase-3 katalytisk domän (MMP-3cd), som innehåller en N-terminal His-tag följt av pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) för användning i affinitet rening. R2DP-celler förbättrar uttrycket av eukaryota proteiner genom en kloramfenicolresistent plasmid som innehåller kodoner som normalt är sällsynta i bakteriella uttryckssystem. Jämfört med den traditionella cellinjen för rekombinant proteinuttryck, BL21 (DE3), förbättrade rening med denna nya stam utbytet av renad Hisx6-pro-MMP-3cd. Vid aktivering och avsaltning klyvs pro-domänen tillsammans med N-terminalen His-tag, vilket ger aktiv MMP-3cd för omedelbar användning i otaliga in vitro-applikationer . Denna metod kräver inte dyr utrustning eller komplexa fusionsproteiner och beskriver snabb produktion av rekombinanta mänskliga MMPs i bakterier.

När prover körs på SDS-PAGE, eftersom proteinet uttrycks i form av olösliga inklusionskroppar, bör de lyserade och sonicated fraktionerna innehålla lite eller ingen Hisx6-pro-MMP-3cd extrakt, eftersom proteinet ännu inte har resolubilized i urea. Figur 3 jämför his-tag reningsaljonerna av Hisx6-pro-MMP-3cd från BL21(DE3) celler och R2DP-celler. Elution fraktioner poolades separat för både BL21(DE3) och R2DP celler före dialys. Fraktioner från varje steg kördes efter att protei...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

His-tag rening, dialys och aktivering används för att öka avkastningen av lösliga, aktiva matris metalloproteinase-3 katalytiska domänprotein uttryck i bakterier. Proteinfraktioner analyseras via SDS-PAGE geler.

Bakteriellt uttryck och rening av human matrix metalloproteinase-3 med hjälp av affinitetskromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Detta detaljerade protokoll beskriver en mycket effektiv och kostnadseffektiv metod för bakteriell uttryck för rekombinant MMP-3 katalytisk domän i E.Coli, som kan tillämpas på andra MMP terapeutiska mål. E.coli saknar ett komplext proteinveckningssystem och post-translationellt bearbetningssystem. Denna metod använder R2DP cell stam för att förbättra eukaryota protein uttryck i E.coli.Överproduktion av specifika mmps leder till flera sjukdomar som cancer, hjärt-kärlsjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar. Aktiva lösliga MMPs behövs för utveckling av MMP hämmar terapeutiska. Inokulera en enda isolerad koloni av pET His-tag pro MMP-3 katalytisk domäntransformator från en LB ampicillin kloramfenicol resistent platta i fem milliliter LB ampicillin klorfenicol resistenta medier vid 37 grader Celsius.Spara alikvoter från varje kultur och förbered 40% glycerol lager. Inokulera en enliterskolv som innehåller 500 milliliter LB ampicillinklorfenalolresistent medium till en optisk densitet på 0,05 till 0,1 vid 600 nanometer med nattkulturen. Mät den optiska densiteten till 600 nanometer vid flera tidpunkter, vanligtvis i tre till fyra timmar tills den faller mellan 0,4 och 0,6.Inducera kulturerna med ett molärt IPTG-bestånd till en slutlig koncentration av en millimolar. Inkubera i 37 graders skakapparat i ytterligare tre till fyra timmar. Centrifugera cellerna i 250 milliliter koniska flaskor vid 13 000 G och fyra grader Celsius i 10 minuter, upprepa tills kulturerna är helt pelleterade.Tillsätt tre milliliter lysbuffert per gram pellet och återanvänd pelleten genom virvel eller pipettering. Tillsätt 1,25 milliliter med 10% vikt i volym natriumdeoxikolat per en liter kultur. Tillsätt 10 mikroliter DNase I per en liter kultur.Skaka i rumstemperatur i 30 minuter vid 150 VARV/min. Centrifugera i 10 minuter vid 13 000 G och fyra grader Celsius. Kasta supernatanten.Återanvänd pelleten i 100 milliliter per liter odling av inklusionskroppsbuffert genom pipettering upp och ner. Förvara proverna på is under ultraljudsbehandlingen för att förhindra överhettning. Sonikera varje prov i sex cykler på 15 sekunder, en utgång på fem och en 50%-puls.Centrifugera proverna i 10 minuter vid 13 000 G och fyra grader Celsius. Kolla pelleten. Om pelleten är kompakt, kassera supernatanten.Återanvänd varje pellet från en enliterkultur och fem milliliter solubiliseringsbuffert. Inkubera i minst 30 minuter på is så att proteinerna kan solubilisera. Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 13 000 gånger G i fyra grader Celsius.Om pelleten bildas efter centrifugering, häll supernatanten i ett separat koniskt rör på 50 milliliter. Återanvänd pelleten i ytterligare fem milliliter solubiliseringsbuffert per en liter kultur genom att pipettera upp och ner. Centrifugera i 10 minuter vid 13 000 G och fyra grader Celsius.Dra sedan supernatanterna. Kassera pelleten eller förvara den på minus 80 grader Celsius för ytterligare ultraljudsbehandling. Tomt mot HT tvättbuffert och registrera A280 för den första tvättfraktionen.Upprepa med andra bråktal tills A280 närmar sig baslinjen. Ele omedelbart his-märkta proteiner genom att tillsätta fem milliliter HT elution buffert. Samla upp genomströmningen vid 0,5 till en milliliter fraktioner i mikrofugerör märkta HT elution.Mät A280 för elutionsfraktionen. Om A280 är större än 0,3 milligram per milliliter, späd fraktionen med HT-jämviktsbuffert. Sänk ner de eluterade MMP-fraktionerna i dialysrör i en liter dialysbuffert ett och rör om slangen och dess innehåll på en magnetisk omrörning i minst åtta timmar vid fyra grader Celsius.Överför till en liter dialysbuffert två och rör om slangen och dess innehåll på en magnetisk omrörning i minst åtta timmar vid fyra grader Celsius. Överför sedan till en liter dialysbuffert tre och rör om slangen och dess innehåll på en magnetisk omrörning i inte mindre än åtta timmar vid fyra grader Celsius. Överför exemplet till en lämplig behållare och etikettera dem som uppringd MMP.Undersök röret för eventuell fällning. Tillsätt 50 mikroliter på 20 millimolar APMA per milliliter på 1 milliliter på 1 milliliter på ett milligram per milliliter. Om en fällning bildas, centrifugera den med maximal hastighet i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Förvara supernatanten i ett 1,5 milliliter mikrofugerör märkt aktiverat MMP. Kassera fällningen i en behållare märkt för APMA-avfall. SDS-PAGE kördes för att jämföra His-tag renings elueringsfraktioner av His-tag pro MMP-3 katalytisk domän från BL21 DE3 celler i R2DP celler.De första åtta elution fraktion fraktionerna av his-taggade MMP katalytiska domänen och BL21 DE3 celler visade mindre protein än de i his-taggade MMP katalytiska domänen i R2DP celler. De inducerade, omveckade, koncentrerade, aktiverade och avsaltade fraktionerna av MMP3 CD- och R2DP-celler visas. Vid aktivering är molekylvikten för det aktiverade MMP-3 CD-bandet cirka 20 kilodalton, i motsats till den his-märkta zymogenen som förblir på cirka 30 kilodalton.Vid centrifugering av celllyktaser kanske pellets inte är kompakta. När det inträffar, sonikera mer och centrifugera längre. Vid rekognosering av proteinet kan nederbörd uppstå.Lös upp den i solubiliseringsbuffert och upprepa processen. Förfarandet som beskrivs här ger en detaljerad metod för lösliga uttryck av aktiva mänskliga MMPs som så småningom kan användas för att förstå den molekylära mekanismen för MMP enzymatisk aktivitet. Alternativa proteinreningsmetoder som FPLC kan utföras till renade MMP-proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet metoden för rening av enzymatiskt aktiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rening av kloroplast Translocon proteinkomplex med taggen TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...