Name: bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Yazarlar, Jacksonville, Florida'daki Mayo Clinic'teki Dr. Evette Radisky ve Alexandra Hockla'ya, Hisx6pro-MMP-3cd genini klonlamak için şablon olarak pET-3a-pro-MMP-3cd plazmidini sağladıkları için ve yorumlarına ve DNA dizilimi için Nevada Üniversitesi, Reno'daki Nevada Genomik Merkezi'nden Dr. Paul Hartley ile birlikte teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Cassandra Hergenrader'e protein ekspresyonunun bir kısmına yardımcı olduğu için teşekkür etmek istiyorlar. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE Bütünleştirici Sinirbilim hibesine ve UNR Ar-Ge mICRO SEED Hibe Ödülü'ne teşekkür ederiz.

1. MMP ifadesi
<ol><li>pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd'nin klonlanması ve R2DP hücrelerine dönüştürülmesi<ol>
<li>pET-3a plazmidini (Malzeme Tablosuna bakınız) Digest Buffer'daki NdeI ve BamHI kısıtlama enzimleri ile sindirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Toplam 40 μL'lik bir reaksiyon hacminde, 4 μL Sindirim Tamponu, 33 μL 100 ng / μL plazmid ve her bir kısıtlama enziminin 1.5 μL'sini ekleyin ve reaksiyonun 37 ° C'de tamamlanana kadar ~ 2 saat ilerlemesi...

<ol>
	<li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells:+A+novel+and+accessible+approach.">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).</li><li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension.">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).</li><li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag.">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method.">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).</li><li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography.">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).</li><li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer.">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors:+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics.">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313 (2020).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition.">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li><li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-10+(MMP-10)+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2.">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li><li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+matrix+metalloproteinases+in+Escherichia+coli.">Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli.</a> Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).</li><li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1.">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li><li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1.">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li><li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14.">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag.">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li><li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells.">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).</li><li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble,+active+matrix+metalloproteinase-8+(MMP-8)+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li><li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GST-His+purification:+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins.">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).</li><li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Mont&#243;n Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli.">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).</li><li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins.">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamA&#916;41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).</li></ol>

Çözünür, insan, rekombinant MMP'lerin büyük ölçekli üretimi zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Memeli hücreleri, fonksiyonel MMP'leri yüksek maliyetlerle ve uzun bekleme süreleriyle ifade edebilirken, E. coli hızla saflaştırılması ve yeniden katlanması gereken yüksek miktarda MMP inklüzyon cismi üretir11,16. R2DP hücreleri, MMP inklüzyon gövdelerinin verimini önemli ölçüde artırarak daha uygun maliyetli ve üretken bir...

Çoğu kompleks ökaryotik protein, ekspresyondan sonra ayrıntılı posttranslasyonel modifikasyonlara uğrar ve yüksek oranda yardımcı protein katlanmasını ve ko-faktörlerin işlevsel olmasını gerektirir1. Bir bakteri konağında büyük miktarlarda çözünür insan proteini üretmek, yüksek maliyetler ve daha küçük ölçekli laboratuvar deneyleri için bile sağlam ekspresyon ve saflaştırma yöntemlerinin bulunmaması nedeniyle önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir2,3. MMP'ler, büyük moleküler ağırlığa sahip insan endopeptidazları, genellikle E. coli'de ifade edildiğinde çözünmez inklüzyon cisimleri olarak ifade edilir. Çözünür insan MMP'lerinin ekstraksiyonu genellikle zahmetli, zaman alıcı bir çözünürlük ve yeniden katlama işlemine yol açar4.
MMP'ler hem fizyolojik hem de patojenik süreçlerde kritik rollere sahiptir. İnsan MMP'leri, yapı ve substrat özgüllüğüne göre kategorize edilen ve yüksek oranda korunmuş bir katalitik alana rağmen farklı şekilde eksprese edilen 23 çinko endopeptidaz ailesidir5,6. MMP'ler inaktif zimojenler olarak salgılanır, posttranslasyonel aktivasyon ve endojen inhibitörleri, metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP'ler) 7,8,9,10 ile düzenlenir. Başlangıçta ECM cirosundaki rolleriyle tanınmasına rağmen, MMP'ler gelişim, morfogenez, doku onarımı ve yeniden şekillendirmede de rol oynamıştır8. MMP'lerin düzensizliği, diğer hastalıkların yanı sıra nörodejeneratif, kardiyovasküler ve fibrotik hastalıklarla birlikte kanserle de özellikle ilişkilendirilmiştir5,7.
Sağlam büyük ölçekli MMP üretim yöntemlerinin geliştirilmesi, biyokimyasal ve hücre bazlı testler yoluyla MMP mekanizmalarının gelecekteki çalışmalarının başarısını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli MMP'ler daha önce MMP aktivitesini değiştirmeden Hisx6 etiketli MMP'ler de dahil olmak üzere bakterilerde11 ifade edilmiştir12,13,14,15. Ancak, bu yöntemler çoğaltılması zor olabilecek sıkıcı, uzun adımlar içerir.
Memeli hücreleri, uygun posttranslasyonel modifikasyonları sağlarken birçok farklı insan proteinini eksprese etmek için de kullanılabilir16. Memeli ekspresyon sistemi, uygun post-translasyonel modifikasyonlarla rekombinant insan proteinleri üretmek için ideal bir seçim olmasına rağmen, bu yöntemin başlıca dezavantajları başlangıçtaki düşük verimler, maliyetli büyüme ortamı ve reaktifleri, kararlı ekspresyon hatlarına ulaşmak için uzun zaman çizelgeleri ve mantar veya bakteri gibi diğer türlerle kontaminasyon riskidir2,11 . Ayrıca, memeli hücre hatlarındaki MMP üretimi, TIMP veya fibronektinler gibi ilişkili hücresel proteinlerden safsızlıklar verir11. Memeli hücrelerinde gözlenen yavaş hücre büyümesinin aksine, bakteri ekspresyon sistemi, daha basit ortam ve büyüme gereksinimleri ile birlikte kısa sürede büyük ölçekli protein üretimi sunar. Bununla birlikte, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde diğer ilişkili hücresel proteinlerin (yani TIMP'lerin) eksikliği nedeniyle, daha yüksek konsantrasyonlardaki aktif MMP'ler otoproteoliz yoluyla bozunmaya maruz kalır ve bu da zayıf MMP verimine neden olur17.
Bu yazıda, uygun fiyatlılığı, basitliği ve daha yüksek MMP verimi üretmedeki başarısı nedeniyle E. coli'yi ekspresyon konakçısı olarak kullanan rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd'nin bakteriyel ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivasyonu için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır2,3,18. E. coli, rekombinant MMP'ler ve diğer karmaşık proteinler için gerekli protein katlama makinesinden ve posttranslasyonel işlemden yoksun olduğundan, birçok E. coli suşu bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır ve E. coli'yi rekombinant insan MMP-3cd'nin ekspresyonu için daha uygun bir konakçı haline getirmiştir,19,20 . Örneğin, bu çalışmada kullanılan R2DP suşu, E. coli'de nadiren kullanılan kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid sağlayarak ökaryotik ekspresyonu arttırır.
Bu protokolde açıklandığı gibi, R2DP hücrelerinde pET-3a vektöründen (Şekil 1) nispeten saf inklüzyon cisimlerinin aşırı ekspresyonundan sonra, Hisx6-pro-MMP-3 katalitik alan (MMP-3cd) proteinleri ekstrakte edilir ve denatüre edilir4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19, afinite etiketi kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Yeniden katlanma ve diyaliz üzerine, pro-MMP-3cd (zymogen) 4-aminofenilmerkürik asetat (APMA) ile aktive edildi ve verimi ve daha fazla saflaştırma ihtiyacını değerlendirmek için SDS-PAGE analizi kullanıldı5,21. Bu protokol, örnek olarak çözünür MMP-3cd'nin ekspresyonunu, saflaştırılmasını ve aktivasyonunu açıklar. Bununla birlikte, diğer MMP'lerin ve insan proteazlarının benzer ekspresyonla ekspresyonu ve aktivasyon mekanizmaları için bir rehber olarak da kullanılabilir (Şekil 2). MMP-3cd dışındaki diğer proteinler için, okuyucunun bu protokolü denemeden önce hedef proteinleri için en uygun tampon bileşimlerini ve yöntemlerini belirlemesi önerilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Resim 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plazmidinin plazmid haritası. pET-3a vektörü bir ampisilin direnç geni içerir. Bir N-terminal Hisx6-etiket dizisi, BamHI ve NdeI kısıtlama bölgeleri arasında T7 promotörünün kontrolü altında pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd yapısını üretmek için pro-MMP-3cd dahil olmak üzere pET-3a tabanlı vektöre klonlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Şekil 2: Pro-MMP-3cd'nin bakteriyel ekspresyonu, saflaştırılması, yeniden katlanması ve aktivasyonu. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plazmidi BL21 (DE3) veya R2DP Hücrelerine dönüştürüldü. 1.2: Pro-MMP-3cd protein ekspresyonu IPTG kullanılarak indüklendi. 1.3: Kimyasal lizis ve sonikasyon, esas olarak çözünmeyen ve inklüzyon cisimlerinde bulunan Hisx6-pro-MMP-3cd proteinlerini çıkarmak için kullanılır. Üre, proteini inklüzyon cisimciklerinden denatüre etmek ve çözündürmek için kullanıldı. 2.1. Denatüre Hisx6-pro-MMP-3cd proteini, afinite kromatografisi saflaştırması ile saflaştırıldı. 3. Salınan Hisx6-pro-MMP-3cd, ürenin tampondan kademeli olarak çıkarılmasıyla diyaliz sırasında yavaşça yeniden katlandı. 4. Son olarak, yeniden katlanmış MMP-3cd proteini, N-terminal pro-peptid alanı çıkarılarak APMA kullanılarak aktive edildi. APMA daha sonra tuzdan arındırma yoluyla çözeltiden çıkarılır. Sayılar, bu adımları açıklayan protokol bölümlerine karşılık gelir. Kısaltmalar: MMP-3cd = Matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan; APMA = 4-aminofenilmerkürik asetat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S76106F</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G, 1-in. beveled needle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07S7VBHM2</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL desalting column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>Removes APMA following activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1610422</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottle cushions</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53A</td>
			<td>Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-538-53</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL stirred cell</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9563-5G</td>
			<td>Activates MMP-3 by cleaving the propeptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0829167</td>
			<td>Used in combination with the dialysis casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>Used for storage in many purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL re-concentration tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UFC901024D</td>
			<td>Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>600-30-23</td>
			<td>The calcium ion stabilizes MMP structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spreaders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-189-7544</td>
			<td>Can be used to spread cells across a petri dish after transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-055-125GM</td>
			<td>Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 &#181;g/mL in LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 1</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 4 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &#181;M ZnCl2, 2 M Urea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Buffer 3</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &#181;M ZnCl2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>68011</td>
			<td>Used in combination with snakeskin dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digest buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Buffer used in digesting the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-200-257</td>
			<td>Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D107125G</td>
			<td>Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assembly mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td>Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A995-4</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J15694-AE</td>
			<td>Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel recovery kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Isolates and purifies DNA from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GdnHCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA135430B</td>
			<td>Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-transformation efficiency cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987</td>
			<td>High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Elution Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Equilibration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Regeneration Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Wash Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>Used to pH buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1022122</td>
			<td>Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inclusion Body Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0392</td>
			<td>A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR media</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Amp CamR plates</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 &#176;C, add ampicillin to 100 &#181;g/mL and chloramphenicol to 34 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195303</td>
			<td>Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Restriction enzyme to be used with the pET3a vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI88221</td>
			<td>Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Used for plating transformants on LB agar media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2DP cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>714033</td>
			<td>BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC growth media</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td>Non-selective growth media for rapid growth during transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Used in buffers and helps with protein stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI89905</td>
			<td>Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilization Buffer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M1122980101</td>
			<td>Detergent used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75826A7</td>
			<td>First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAA162810E</td>
			<td>Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial expression and purification of human matrix metalloproteinase-3 using affinity chromatography

Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), hücre dışı matriks (ECM) bozunması ve yeniden şekillenmesinde merkezi rolleri olan metzinsin proteazlar ailesine ve ayrıca çeşitli büyüme faktörleri ve sitokinlerle etkileşimlere aittir. Spesifik MMP'lerin aşırı ekspresyonu, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalık gibi çeşitli hastalıklardan sorumludur. MMP'ler, MMP aşırı ekspresyonu ile ilişkili hastalıkları tedavi edebilen terapötikler geliştirmeyi hedef alan hedefler olarak son zamanlarda ilgi odağı olmuştur.
Çözeltideki MMP mekanizmasını incelemek için, aktif, çözünür MMP'lerin üretimi için daha kolay ve sağlam rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, çoğu MMP'nin katalitik alanı, posttranslasyonel makine eksikliği nedeniyle Escherichia coli'de (E. coli) çözünür formda ifade edilemezken, memeli ekspresyon sistemleri genellikle maliyetlidir ve daha düşük verime sahiptir. MMP inklüzyon organları, doğal konformasyondaki MMP'lerin verimini önemli ölçüde azaltan sıkıcı ve zahmetli kapsamlı saflaştırma ve yeniden katlama sürecinden geçmelidir. Bu yazıda, matris metalloproteinaz-3 katalitik etki alanı (MMP-3cd) üretmek için Rosetta2 (DE3) pLysS (bundan böyle R2DP olarak anılacaktır) hücrelerini kullanan ve afinite saflaştırmasında kullanılmak üzere bir N-terminal His-etiketi ve ardından pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) içeren bir protokol sunulmaktadır. R2DP hücreleri, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde normalde nadir görülen kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid yoluyla ökaryotik proteinlerin ekspresyonunu arttırır. Rekombinant protein ekspresyonu için tercih edilen geleneksel hücre hattı BL21 (DE3) ile karşılaştırıldığında, bu yeni suşu kullanarak saflaştırma, saflaştırılmış Hisx6-pro-MMP-3cd'nin verimini artırdı. Aktivasyon ve tuzdan arındırma üzerine, pro etki alanı N-terminal His-tag ile birlikte bölünür ve sayısız in vitro uygulamada anında kullanım için aktif MMP-3cd sağlar. Bu yöntem pahalı ekipman veya karmaşık füzyon proteinleri gerektirmez ve bakterilerde rekombinant insan MMP'lerinin hızlı üretimini tanımlar.

SDS-PAGE'de numuneler çalıştırılırken, protein çözünmez inklüzyon cisimleri şeklinde ifade edildiğinden, lize ve sonikasyonlu fraksiyonlar, protein henüz üre içinde çözünmediğinden, Hisx6-pro-MMP-3cd ekstraktını çok az içermeli veya hiç içermemelidir. Şekil 3 , BL21 (DE3) hücrelerinden ve R2DP hücrelerinden Hisx6-pro-MMP-3cd'nin His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmaktadır. Elüsyon fraksiyonları, diyalizden önce hem BL21 (DE3) hem d...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography at JoVE.com

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Bu ayrıntılı protokol, E.Coli'deki rekombinant MMP-3 katalitik alan için diğer MMP terapötik hedeflerine uygulanabilen oldukça verimli ve uygun maliyetli bir bakteri ekspresyonu yöntemini açıklamaktadır. E.coli, karmaşık bir protein katlama ve çeviri sonrası işleme sisteminden yoksundur. Bu yöntem, E.coli'de ökaryotik protein ekspresyonunu arttırmak için R2DP hücre suşunu kullanır.Spesifik MMP'lerin aşırı üretimi kanser, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çeşitli hastalıklara yol açar. Aktif çözünür MMP'ler, terapötikleri inhibe eden MMP'lerin geliştirilmesi için gereklidir. LB ampisilin kloramfenikol dirençli bir plakadan LB ampisilin kloramfenikol dirençli plakadan 37 santigrat derecede beş mililitre LB ampisilin kloramfenikol dirençli ortamda, tek bir izole pET His-tag pro MMP-3 katalitik alan dönüştürücü kolonisini aşılayın.Her kültürden alikotları kurtarın ve% 40 gliserol stokları hazırlayın. 500 mililitre LB ampisilin kloramfenikol dirençli ortam içeren bir litrelik şişeyi, gece kültürü ile 600 nanometrede 0.05 ila 0.1 optik yoğunluğa aşılayın. Optik yoğunluğu birkaç zaman noktasında 600 nanometrede, tipik olarak 0,4 ila 0,6 arasına düşene kadar üç ila dört saat boyunca ölçün.Bir molar IPTG stoğu olan kültürleri bir milimolar'ın son konsantrasyonuna indükleyin. 37 derecelik çalkalayıcıda üç ila dört saat daha inkübe edin. Hücreleri 250 mililitrelik konik şişelerde 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve kültürler tamamen peletlenene kadar tekrarlayın.Pelet gramı başına üç mililitre lizis tamponu ekleyin ve vorteks veya pipetleme ile peleti yeniden askıya alın. Bir litre kültür başına hacimce sodyum deoksikolat ağırlıkça% 10 1.25 mililitre ekleyin. Bir litre kültür başına 10 mikrolitre DNaz I ekleyin.Oda sıcaklığında 150 RPM'de 30 dakika çalkalayın. 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj. Süper natantı atın.Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, kaynaştırma gövdesi tamponunun litre kültürü başına 100 mililitre içinde yeniden askıya alın. Aşırı ısınmayı önlemek için sonikasyon sırasında örnekleri buz üzerinde tutun. Her numuneyi 15 saniyelik altı döngü, beş çıkış ve% 50 nabız için sonikleştirin.Numuneleri 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Pelet'i kontrol edin. Pelet kompaktsa, süpernatanı atın.Her peleti bir litrelik kültürden ve beş mililitre çözündürme tamponundan geri alın. Proteinlerin çözünmesini sağlamak için buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de dört santigrat derecede santrifüj yapın.Pelet santrifüjlemeden sonra oluşursa, süpernatantı ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpe dökün. Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, bir litre kültür başına beş mililitre daha çözünürleştirme tamponunda yeniden askıya alın. 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj.Ardından, süpernatanları çekin. Pelet atın veya ek sonikasyon için eksi 80 santigrat derecede saklayın. HT yıkama tamponuna karşı boş bırakın ve ilk yıkama fraksiyonunun A280'ini kaydedin.A280 taban çizgisine yaklaşana kadar diğer kesirlerle tekrarlayın. Beş mililitre HT elüsyon tamponu ekleyerek His etiketli proteinleri derhal süzün. HT elüsyonu etiketli mikrofüj tüplerinde 0,5 ila bir mililitre fraksiyondaki akışı toplayın.Elüsyon fraksiyonunun A280'ini ölçün. A280, mililitre başına 0,3 miligramdan büyükse, fraksiyonu HT denge tamponu ile seyreltin. Salınımlı MMP fraksiyonlarını diyaliz tüpündeki bir litre diyaliz tamponuna batırın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın.Bir litre diyaliz tamponu ikiye aktarın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın. Daha sonra, bir litre diyaliz tamponu üçüne aktarın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın. Numuneyi uygun bir kaba aktarın ve çevrilmiş MMP olarak etiketleyin.Tüpü herhangi bir çökelti için inceleyin. Mililitre MMP başına bir miligramlık bir mililitre aliquot başına, bir milimolar'ın son APMA konsantrasyonuna ulaşmak için 50 mikrolitre 20 milimolar APMA ekleyin. Bir çökelti oluşursa, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın.Süpernatantı aktif MMP etiketli 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünde saklayın. Çökeltiyi APMA atıkları için işaretlenmiş bir kaba atın. SDS-PAGE, R2DP hücrelerindeki BL21 DE3 hücrelerinden His-tag pro MMP-3 katalitik etki alanının His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmak için çalıştırıldı.His-etiketli MMP katalitik etki alanının ve BL21 DE3 hücrelerinin ilk sekiz elüsyon fraksiyonu, R2DP hücrelerinde His etiketli MMP katalitik alanındakilerden daha az protein gösterdi. MMP3 CD ve R2DP hücrelerinin indüklenmiş, yeniden katlanmış, konsantre, aktive edilmiş ve tuzdan arındırılmış fraksiyonları gösterilmiştir. Aktivasyon üzerine, aktive edilen MMP-3 CD bandının moleküler ağırlığı, yaklaşık 30 kilodaltonda kalan His etiketli zimojenin aksine, yaklaşık 20 kilodaltondur.Hücre lizatlarını santrifüj ederken, peletler kompakt olmayabilir. Bu meydana geldiğinde, daha fazla sonikasyon yapın ve daha uzun süre santrifüj yapın. Proteini yeniden yoğunlaştırırken, yağış meydana gelebilir.Çözünürizasyon tamponunda çözün ve işlemi tekrarlayın. Burada açıklanan prosedür, sonunda MMP enzimatik aktivitesinin moleküler mekanizmasını anlamak için kullanılabilecek aktif insan MMP'lerinin çözünür ekspresyonu için ayrıntılı bir yöntem sağlar. Saflaştırılmış MMP proteinlerine FPLC gibi alternatif protein saflaştırma yöntemleri uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...