Name: visualizing and quantifying pharmaceutical compounds within skin using coherent raman scattering imaging
Uploaded: 2021-11-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Fotis Iliopoulos und Daniel Greenfield von der Evans' Group für ihre Diskussion und das Korrekturlesen dieses Manuskripts. Darüber hinaus möchten sich die Autoren für die Unterstützung von LEO Pharma bedanken. Abbildung 2 wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Verwendung von nacktem Mausohrgewebe wurde vom Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, während die Verwendung von menschlichem Hautgewebe vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB) genehmigt wurde. Gemäß den IACUC-Protokollen wurden frisch eingeschläferte Mäuse von Kollaborateuren mit nackten Mäusekolonien erhalten. Menschliches Gewebe wurde aus elektiven Abdominoplastik-Verfahren am Massachusetts General Hospital über ein genehmigt...

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+drug+delivery+to+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-windowsparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Herkenne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+methods+for+the+assessment+of+topical+drug+bioavailability.">In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability.</a> Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).</li><li>Alfonso-Garc&#305;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matplotlib:+A+2D+graphics+environment.">Matplotlib: A 2D graphics environment.</a> Computing in Science &amp; Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).</li><li>Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+R+packages:'Non-Compart'+and+'ncar'+for+noncompartmental+analysis+(NCA).">Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA).</a> Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).</li></ol>

Die Evaluation von topischem BA/BE ist ein Forschungsgebiet, das einen facettenreichen Ansatz erfordert, da keine einzelne Methode in vivo cPK vollständig charakterisieren kann. Dieses Protokoll stellt eine Methodik für die Bewertung des BA/BE eines topischen Arzneimittels auf der Grundlage einer kohärenten Raman-Bildgebung vor. Einer der ersten Punkte, die übersehen werden könnten, ist, wie dünn die Hautproben sein müssen, insbesondere für die quantitative Transmissions-SRS-Bildgebung. Wenn die Haut zu ...

Die Methoden zur Bewertung der cPK nach der Anwendung des topischen Arzneimittels haben sich von klassischen In-vitro-Permeationstests (IVPT) Studien 1,2,3,4,5 und Tape-Stripping 6,7,8 auf zusätzliche Methoden wie Open-Flow-Mikroperfusion oder dermale Mikrodialyse 9,10,11 ausgeweitet. 12,13,14. Es gibt potenziell verschiedene lokale Orte therapeutischer Wirkung, abhängig von der interessierenden Krankheit. Daher kann es eine entsprechende Anzahl von Methoden geben, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß zu bewerten, mit der eine API an den beabsichtigten lokalen Ort der Aktion gelangt. Während jede der oben genannten Methoden ihre Vorteile hat, ist der Hauptnachteil der Mangel an cPK-Informationen im Mikromaßstab (dh die Unfähigkeit zu visualisieren, wohin die API geht und wie sie durchdringt).
Eine nichtinvasive Methodik von Interesse zur Schätzung von topischem BA und BE ist CRI, die in zwei Bildgebungsmodalitäten unterteilt werden kann: CARS und SRS-Mikroskopie. Diese kohärenten Raman-Methoden ermöglichen eine chemisch spezifische Bildgebung von Molekülen über nichtlineare Raman-Effekte. In CRI werden zwei Laserpulszüge fokussiert und innerhalb einer Probe gescannt; Der Energieunterschied zwischen den Laserfrequenzen wird so eingestellt, dass er auf Schwingungsmoden abzielt, die für die interessierenden chemischen Strukturen spezifisch sind. Da CRI-Prozesse nichtlinear sind, wird ein Signal nur am Mikroskopfokus erzeugt, was eine dreidimensionale pharmakokinetische tomographische Abbildung des Gewebes ermöglicht. Im Rahmen von cPK wurde CARS verwendet, um gewebestrukturelle Informationen zu erhalten, wie z.B. die Lage lipidreicher Hautstrukturen15. Im Gegensatz dazu wurde SRS verwendet, um die molekulare Konzentration zu quantifizieren, da sein Signal linear mit der Konzentration ist. Für Ex-vivo-Hautproben ist es vorteilhaft, CARS in der epi-Richtung16 und SRS im Getriebemodus17 durchzuführen. Daher ermöglichen dünne Gewebeproben die Erkennung und Quantifizierung von SRS-Signalen.
Als Modellgewebe bietet das nackte Mausohr mehrere Vorteile mit kleineren Nachteilen. Ein Vorteil ist, dass das Gewebe bereits ~200-300 μm dick ist und keine weitere Probenvorbereitung erfordert. Darüber hinaus werden mehrere Hautschichtungen durch axiale Fokussierung durch ein Sichtfeld (z. B. Stratum corneum, Talgdrüsen (SGs), Adipozyten und subkutanes Fett) beobachtet16,18. Dies ermöglicht eine vorläufige präklinische Abschätzung der kutanen Permeationswege und topische BA-Schätzungen, bevor zu menschlichen Hautproben übergegangen wird. Das Nacktmausmodell weist jedoch Einschränkungen auf, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Extrapolation auf In-vivo-Szenarien aufgrund von Unterschieden in der Hautstruktur19. Während das nackte Mausohr ein ausgezeichnetes Modell ist, um vorläufige Ergebnisse zu erhalten, ist das Modell der menschlichen Haut der Goldstandard. Obwohl es verschiedene Kommentare zur Eignung und Anwendbarkeit gefrorener menschlicher Haut zur genauen Rekapitulation der In-vivo-Permeationskinetik gegeben hat 20,21,22, ist die Verwendung von gefrorener menschlicher Haut eine anerkannte Methode zur Bewertung der In-vitro-API-Permeationskinetik 23,24,25 . Dieses Protokoll visualisiert verschiedene Hautschichten in der Haut von Mäusen und Menschen und quantifiziert die API-Konzentrationen in lipidreichen und lipidarmen Strukturen.
Während CRI in zahlreichen Bereichen eingesetzt wurde, um Verbindungen in Geweben spezifisch sichtbar zu machen, gab es begrenzte Bemühungen, die cPK von topisch applizierten Arzneimitteln zu untersuchen. Um den topischen BA/BE von topischen Produkten mit CRI zu bewerten, ist es notwendig, zunächst ein standardisiertes Protokoll zu haben, um genaue Vergleiche anzustellen. Frühere Bemühungen mit CRI für die Arzneimittelabgabe an die Haut haben eine Variabilität innerhalb der Daten gezeigt. Da es sich um eine relativ neue Anwendung von CRI handelt, ist die Erstellung eines Protokolls von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten 18,26,27. Dieser Ansatz zielt nur auf eine bestimmte Wellenzahl im biologisch stillen Bereich des Raman-Spektrums ab. Die meisten APIs und inaktiven Inhaltsstoffe weisen jedoch Raman-Verschiebungen innerhalb des Fingerabdruckbereichs auf. Dies stellte bisher aufgrund des inhärenten Signals, das vom Gewebe im Fingerabdruckbereich ausgeht, vor Herausforderungen. Jüngste Fortschritte in den Bereichen Laser und Berechnung haben diese Barriere beseitigt, die auch in Kombination mit dem hier vorgestellten Ansatz genutzt werden kann28. Dieser hier vorgestellte Ansatz ermöglicht die Quantifizierung einer API, die eine Raman-Verschiebung in der stillen Region (2.000-2.300 cm-1) aufweist. Dies ist nicht auf die physiochemischen Eigenschaften des Arzneimittels beschränkt, was bei einigen zuvor erwähnten cPK-Überwachungsmethoden der Fall sein könnte29.
Das Protokoll muss die Variabilität der Hautdicke von Probe zu Probe für verschiedene Präparate reduzieren, da dicke menschliche Hautproben nach der Anwendung des Arzneimittels aufgrund der Lichtstreuung durch die dicke Probe ein minimales Signal erzeugen. Ein Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methodik der Gewebepräparation vorzustellen, die reproduzierbare Bildgebungsstandards gewährleistet. Darüber hinaus ist das CRI-System wie beschrieben eingerichtet, um potenzielle Fehlerquellen zu reduzieren und Signal-Rauschen zu minimieren. Dieses Papier wird jedoch nicht die Leitprinzipien und technischen Vorteile des CRI-Mikroskops diskutieren, da dies zuvorbehandelt wurde 30. Schließlich wird das umfangreiche Datenanalyseverfahren untersucht, um eine Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen, um den Erfolg oder Misserfolg eines Experiments zu bestimmen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bags</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>22-044562</td>
			<td>As refered to in text: biohazard bags 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&#38;searchTerm= 22044562&#38;searchType=RAPID&#38; matchedCatNo=22044562</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Buffers: Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21030CV</td>
			<td>As refered to in text: PBS 
			https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&#38;searchTerm= 21-030-cv&#38;searchType= RAPID&#38;matchedCatNo=21-030-cv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td>As refered to in text: scalpel 
			https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision 45&#176; Angle Broad Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-132</td>
			<td>As refered to in text: forceps 
			https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science</td>
			<td>06-666</td>
			<td>As refered to in text: task wiper 
			https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>As refered to in text: parafilm 
			https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (35 mm x 10 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>As refered to in text: small petri dish 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>As refered to in text: large petri dish 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>NC9411473</td>
			<td>As refered to in text: scissors 
			https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&#38;searchTerm= RS-5915SC&#38;searchType=RAPID&#38; matchedCatNo=RS-5915SC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser/microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control box IX2-UCB</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Control Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D700/30m</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: CARS filter - deuterated band 
			https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepSee Insight</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Laser 
			https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>As refered to in text: power meter 
			https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Microscope Control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: microscope slides 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>GM-800</td>
			<td>As refered to in text: incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S142C</td>
			<td>As refered to in text: photodiode 
			https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply FV31-PSU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Power Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator</td>
			<td>BK Precision</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan &#8211; Precision Microscope Automation</td>
			<td>Prior Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: stage controller 
			https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal Imaging Spacers</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>654004</td>
			<td>As refered to in text: spacer 
			https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRS Detection Kit</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: SRS detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLSAPO 20X NA:0.75</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: 20X Objective 
			https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid/Drug Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>NC9711297</td>
			<td>As refered to in text: Glass bottom dish 
			https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Cotton-tipped applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distriman Postive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Postive Displacement Pipette 
			https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distriman Postive Displacement Pipette Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Tips for pipette 
			https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: FIJI/ImageJ 
			https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter-Lab</td>
			<td>open-source</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: JupyterLab 
			https://jupyter.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Rstudio 
			https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and quantifying pharmaceutical compounds within skin using coherent raman scattering imaging

Die kutane Pharmakokinetik (cPK) nach topischer Formulierungsanwendung war ein Forschungsgebiet von besonderem Interesse für Regulierungs- und Arzneimittelentwicklungswissenschaftler, um die topische Bioverfügbarkeit (BA) mechanistisch zu verstehen. Semi-invasive Techniken wie Tape-Stripping, dermale Mikrodialyse oder dermale Open-Flow-Mikroperfusion quantifizieren alle die cPK auf der Makroskala. Während diese Techniken ein umfangreiches cPK-Wissen geliefert haben, fehlt der Gemeinschaft ein mechanistisches Verständnis der Penetration und Permeation von Wirkstoffen (API) auf zellulärer Ebene. 
Ein nichtinvasiver Ansatz zur Behandlung von cPK im Mikromaßstab ist die kohärente Raman-Streubildgebung (CRI), die selektiv auf intrinsische molekulare Schwingungen abzielt, ohne dass extrinsische Markierungen oder chemische Modifikationen erforderlich sind. CRI verfügt über zwei Hauptmethoden - kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuung (SRS), die eine empfindliche und selektive Quantifizierung von APIs oder inaktiven Inhaltsstoffen ermöglichen. CARS wird typischerweise verwendet, um strukturelle Hautinformationen abzuleiten oder chemische Kontraste zu visualisieren. Im Gegensatz dazu wird das SRS-Signal, das linear mit der molekularen Konzentration ist, verwendet, um APIs oder inaktive Inhaltsstoffe innerhalb von Hautschichtungen zu quantifizieren. 
Obwohl Mausgewebe üblicherweise für cPK mit CRI verwendet wurde, müssen topische BA und Bioäquivalenz (BE) letztendlich in menschlichem Gewebe vor der behördlichen Zulassung beurteilt werden. Dieses Papier stellt eine Methodik zur Vorbereitung und Abbildung von Ex-vivo-Haut vor, die in quantitativen pharmakokinetischen CRI-Studien bei der Bewertung von topischem BA und BE verwendet werden soll. Diese Methodik ermöglicht eine zuverlässige und reproduzierbare API-Quantifizierung in der Haut von Mensch und Maus im Laufe der Zeit. Die Konzentrationen in lipidreichen und lipidarmen Kompartimenten sowie die Gesamt-API-Konzentration im Laufe der Zeit werden quantifiziert; Diese werden für Schätzungen von mikro- und makroskaligen BA und möglicherweise BE verwendet.

Die Bildgebung gilt als erfolgreich, wenn sich das Gewebe nach Abschluss des Experiments weder axial (<10 μm) noch in lateraler Richtung signifikant bewegt hat (Abbildung 4). Dies ist ein unmittelbarer Hinweis darauf, ob die SRS-Messung für den API of Interest nicht repräsentativ für die Anfangstiefe ist, für die die Quantifizierung schichtspezifisch ist. Dies wird durch die Abbildung von Z-Stacks für jede XY-Position von Interesse gemildert, wobei der Kompromiss die zeitliche Auflösu...

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Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging

Eine kohärente Raman-Streubildgebungsmethodik zur Visualisierung und Quantifizierung pharmazeutischer Verbindungen in der Haut wird beschrieben. Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung von Hautgewebe (Mensch und Maus) und die topische Formulierungsanwendung, die Bildaufnahme zur Quantifizierung der räumlich-zeitlichen Konzentrationsprofile und die vorläufige pharmakokinetische Analyse zur Beurteilung der topischen Arzneimittelabgabe.

Visualisierung und Quantifizierung pharmazeutischer Verbindungen in der Haut mittels kohärenter Raman-Streubildgebung

Cutaneous pharmacokinetics (cPK) after topical formulation application has been a research area of particular interest for regulatory and drug development ...

Diese Methodik ist insofern von Bedeutung, als sie eine reproduzierbare und genaue Methode zur Quantifizierung topisch angewendeter Arzneimittel unter Verwendung einer kohärenten Raman-Bildgebung ermöglicht. Andere Methoden liefern sperrige kutane pharmakokinetische Informationen, während diese Methodik sowohl groß- als auch mikroskalige kutane pharmakokinetische Informationen wie den Permeationsweg eines Arzneimittels liefern kann. Die Visualisierungs-, Quantifizierungs- und Permeationswege ermöglichen die Entwicklung von Arzneimitteln mit einem bestimmten Weg, um den Zielort zu erreichen.Die Gewebepräparation wird sich als der schwierigste Teil dieser Methodik erweisen. Das Gewebe sollte ausreichend dünn sein, damit man die Haut durchlesen kann. Um mit der Vorbereitung eines nackten Mausohrhautgewebes zu beginnen, erwerben Sie eingeschläferte Nacktmäuse und entfernen Sie die Ohren der Maus mit einer Pinzette und einer mikrochirurgischen Schere.Legen Sie dann ein Ohr in eine große Petrischale der Größe 60 Millimeter mal 15 Millimeter. Als nächstes spülen Sie das Mausohr zweimal mit PBS aus und tupfen Sie das Ohr jedes Mal mit dem Aufgabenwischer trocken. Wenn es innerhalb von 24 Stunden verwendet wird, legen Sie das Ohr in PBS in eine kleine, 35 Millimeter mal 10 Millimeter große Petrischale bei zwei bis acht Grad Celsius.Um nach 24 Stunden Ernte zu verwenden, legen Sie das Ohr in eine Petrischale ohne PBS und bedecken Sie die Schale dann mit Parafilm, um sie in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Während Sie unter der biologischen Haube arbeiten, legen Sie das menschliche Hautgewebe in eine große Petrischale mit der Stratum corneum-Seite nach unten, so dass das subkutane Fett zugänglich ist. Verwenden Sie dann eine Pinzette und eine mikrochirurgische Schere, um das subkutane Fett zu entfernen.Sobald das Unterhautfett nicht mehr mit der Schere entfernt werden kann, verwenden Sie ein Einwegskalpell mit 10 Klingen in einem Winkel von 45 Grad zur Haut, um das verbleibende subkutane Fett zu entfernen, während Sie die Haut mit einer Pinzette ruhig halten. Wenn das Fett entfernt ist, schneiden Sie die menschliche Haut in einen Zentimeter mal einen Zentimeter Stücke. Für die Lipidbildgebung platzieren Sie den vorderen Teil des Mausohrs in Richtung des Glasbodens einer 35-Millimeter-Schale mit der Nummer Null.Für die menschliche Haut legen Sie die Haut mit dem Stratum corneum nach unten, um eine Arzneimittelquantifizierung von den oberflächlichen bis zu den tieferen Schichten zu ermöglichen. Sobald das Gewebe auf dem Glasboden zentriert wurde, verwenden Sie einen Baumwollspitzenapplikator, um sicherzustellen, dass die Haut flach ist und vollständigen Kontakt mit der Deckrutschfläche der Glasbodenschale hat. Um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern, legen Sie eine Unterlegscheibe auf die Haut und stellen Sie sicher, dass das Gewebe durch das mittlere Loch der Unterlegscheibe sichtbar ist, um eine stimulierte Raman-Streuung oder SRS-Transmissionserkennung zu ermöglichen.Die vorbestimmte Dosis der Formulierung auf die Haut pipettieren und dann mit einem behandschuhten Finger im Uhrzeigersinn 30 Sekunden lang reiben. Nachdem die vorgegebene Zeit für die Durchdringung der Formulierung abgelaufen ist, entfernen Sie die überschüssige Formulierung, bevor Sie die Haut mit der Formulierungsseite in Richtung der Glasbodenschale legen. Fahren Sie als Nächstes mit dem Versuchsaufbau fort, indem Sie die Microscope Control- oder MC-Software einschalten.Wenn Sie durch das Okular schauen, stellen Sie den axialen Fokus mit dem Einstellknopf ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe im Fokus ist. Wenn Sie fertig sind, entsperren Sie sowohl die Pumpe als auch die Stokes-Strahlen und vergewissern Sie sich, dass die ALG1- und ALG2-Kanäle aktiviert sind. Stellen Sie sicher, dass sich die SRS-Fotodiode über dem Kondensator befindet, und klicken Sie dann in der MC-Software auf Focus x2, um die Haut in den CARS- und SRS-Kanälen zu visualisieren.Gehen Sie im Modul Multi-Area Time Lapse oder MATL zur Registerkarte Ansicht und klicken Sie auf die Liste der registrierten Punkte, damit die Bildliste angezeigt wird. Sobald das Stratum corneum identifiziert ist, scrollen Sie durch den axialen Fokus oder Z-Fokus, um spezifische Gewebeschichtungen zu identifizieren. Spezifische Tiefen können in der Haut hinzugefügt werden, wie Stratum corneum, Talgdrüsen, Adipozyten oder subkutanes Fett, wie während der Live-Bildgebung mit lipidabgestimmtem Kontrast bestimmt.Wenn jedoch ganze Tiefenstapel eingenommen werden sollen, können XY-Positionen hinzugefügt und die relative Z-Position ignoriert werden. Wenn es sich um eine spezifische Bildgebungstiefe für jede Hautschichtung handelt, wählen Sie den Registerpunkt aus, um ihn der MATL-Warteschlange hinzuzufügen. Klicken Sie bei Stapeln mit voller Tiefe im Fenster Erfassungsparameter auf Punkt für jede XY-Position mit Tiefenauswahl registrieren.Stellen Sie als Nächstes die Anzahl der Wiederholungen im MATL-Modul auf eins ein und klicken Sie auf Bereit. Wenn der Wiedergabepfeil von grau zu schwarz wechselt, drücken Sie die Wiedergabetaste, um mit der Abbildung des vorläufigen Lipidstapels zu beginnen. Sobald der Bildgebungszyklus abgeschlossen ist, blockieren Sie sowohl die Pumpe als auch die Stokes-Strahlen und ändern Sie die Wellenlänge auf der grafischen Benutzeroberfläche des Lasers auf die gewünschte Wellenlänge, basierend auf der angestrebten Wellenzahl oder Raman-Vibration.Passen Sie die manuelle Zeitverzögerungsstufe an und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die gleichen Kräfte verwendet werden, um das Lipid und den pharmazeutischen Wirkstoff oder API abzubilden, die a priori festgelegt wurden. Sobald die Gesamtzahl der Zykluswiederholungen ausgewählt wurde, entsperren Sie den Pumpenstrahl und überprüfen Sie, ob die Leistung mit der Fotodiode der gewünschten Leistung entspricht, bevor Sie Play drücken, um mit der automatisierten Abbildung der Sollwerte zu beginnen. Führen Sie als Nächstes eine Datenanalyse für jede Hautschichtung durch, indem Sie ein Talgdrüsenlipidbild nach Fidschi importieren und das Kontrollkästchen Split-Kanäle aktivieren, um die Datei in die CARS- und SRS-Kanäle aufzuteilen.Um die Region of Interest oder den ROI Manager zu öffnen, klicken Sie auf Analyse, Tools und ROI Manager. Wenn Sie den SRS-Kanal so verwenden, dass C gleich eins ist, entfernen Sie die Talgdrüse im Bild und fügen Sie die Markierungen dem ROI-Manager hinzu, indem Sie im ROI-Manager auf T hinzufügen klicken. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Talgdrüse im Bild.Um die lipidreichen Regionen auszublenden, wählen Sie jeden ROI aus und klicken Sie dann auf die Registerkarten Mehr, ODER Kombinieren und Hinzufügen. Um die lipidarmen Regionen auszublenden, verwenden Sie das Rechteckwerkzeug im Fidschi-Menü und zeichnen Sie ein Quadrat um das gesamte Bild. Fügen Sie die Region dem ROI-Manager hinzu.Klicken Sie auf den neu hinzugefügten quadratischen ROI zusätzlich zum ROI, der alle lipidreichen Regionen im ROI-Manager auswählt. Wählen Sie unter Mehr die Option XOR aus, um eine Maske der lipidarmen Regionen zu generieren und sie dem ROI-Manager hinzuzufügen. Verketten Sie die Bilder in numerischer Reihenfolge, indem Sie zu Bild, Stapel, Tools und verketten Sie die Registerkarten in der richtigen Reihenfolge aufrufen.Alternativ können Sie die Bilder importieren, indem Sie eines in Fidschi laden und dann auf der Setup-Seite eine Option namens Gruppendateien mit ähnlichen Namen auswählen. Während das verkettete Bild aktiv ist, gehen Sie zum ROI-Manager, um die lipidreichen Regionen auszuwählen, und klicken Sie auf die Registerkarte Mehr, bevor Sie Multi Measure auswählen, und warten Sie, bis das Ergebnisfenster angezeigt wird. Exportieren Sie die Daten im Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle und fügen Sie eine Spalte mit dem Titel Region hinzu, um jeder Datenzeile lipidreiche Bereiche hinzuzufügen.Fügen Sie lipidarm zu Regionen hinzu, die außerhalb der Lipide lagen. Um die Daten zu visualisieren, speichern und importieren Sie die Tabelle in das R-Paket ggplot2. Zeichnen Sie dann die Daten als Funktion der Bildzahl im Vergleich zur mittleren Intensität, um die Konzentrations-Zeit-Daten zu schätzen.Führen Sie eine nicht-kompartimentelle Analyse oder NCA in RStudio für die aus der Tabelle importierten Intensitätszeitdaten mit dem Aufruf für eine Ebene aus. Wenn Sie fertig sind, zeichnen und vergleichen Sie Jmax und AUCflux - alle Metriken. Führen Sie zusätzlich statistische Vergleiche über experimentelle Bedingungen durch.Die repräsentative Analyse zeigt Stratum corneum, Talgdrüsen, Adipozyten, subkutanes Fett aus der nackten Mausohrhaut und Stratum corneum, papilläre Dermis und eine Talgdrüse aus der menschlichen Haut. In nackter Mausohrhaut wurde die begrenzte Gewebebewegung der Talgdrüsen mit der gleichen Gewebetiefe der Drüsen zum Zeitpunkt der Formulierungsanwendung und 120 Minuten nach der Anwendung beobachtet. Die erhebliche Gewebebewegung in der Haut zeigte nach 120 Minuten Medikamentenanwendung kaum sichtbare Talgdrüsen, was die Ineffizienz des ursprünglichen Protokolls zeigt.In mehreren Studien zeigten die Intensitäts- und Zeitprofile hohe Anfangskonzentrationen, gefolgt von abnehmenden Konzentrationen, was auf keine weitere Absorption des Arzneimittels in das Gewebe hindeutet. Auf der anderen Seite deuteten einige Studien auf einen Anstieg der Intensitäten hin, die später über die experimentelle Dauer abnahmen, was zeigte, dass der Fluss in das Gewebe vor der Bildgebung kein Maximum erreicht hatte. Die NCA-Analyse von Konzentrations-Zeit-Profilen von zwei Formulierungen für denselben Wirkstoff ergab, dass das Ethoxy-Ethoxyethanol unabhängig von der Hautschicht eine verlängerte API-Permeation im Vergleich zu der der Gelformulierung lieferte.Die Gesamtexpositionsanalyse zwischen den gleichen Formulierungen zeigte ähnliche Beobachtungen in den tieferen Hautschichten. Die Vorbereitung der menschlichen Haut und die richtige Platzierung der Haut auf der Glasbodenschale nach der Arzneimittelanwendung sind entscheidend für den Erfolg des Experiments. Die klaren Lösungen hier zeigten die Eignung dieser Methodik.Weitere Forschungen werden vermarktete Formulierungen wie Cremes umfassen, um zu verstehen, wie sich die Formulierung auf die API-Penetration und -Permeation auswirkt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Forschung

Medizin

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Quantitative Visualisierung und Erkennung von Hautkrebs mit Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Lumineszenz-Imaging von interskapulären braunes Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

Povidoniod Rectal Vorbereitung bei der Prostata-Nadelbiopsie ist eine einfache und reproduzierbare Mittel zur Gefahr der Verfahrens Infektion zu verringern

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Mit Multi-fluorierten Bile Acids und<em&gt; In Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging Maßnahme Gallensäure-Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...