Name: visualizing and quantifying pharmaceutical compounds within skin using coherent raman scattering imaging
Uploaded: 2021-11-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging at JoVE.com

著者らは、この原稿の議論と校正に対して、エバンス・グループのフォティス・イリオプロス博士とダニエル・グリーンフィールド博士に感謝したい。さらに、著者らはレオ・ファーマからの支援に感謝したいと思います。 図 2 は、 BioRender.com で作成したものです。

ヌードマウスの耳組織の使用は、マサチューセッツ総合病院施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、ヒト皮膚組織の使用はマサチューセッツ総合病院施設審査委員会(IRB)によって承認された。IACUCプロトコールに従って、新たに安楽死させたマウスを、ヌードマウスコロニーを有する協力者から得た。ヒト組織は、承認されたプロトコルを介してマサチューセッツ総合病院の?...

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	<li>Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J., Benson, H. E., Watkinson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+permeation+methodology.+In+Transdermal+and+topical+drug+delivery:+principles+and+methodology.">In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology.</a> Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. , 85-108 (2012).</li><li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+road+to+development+of+an+in+vitro+permeation+test+(IVPT)+model+to+compare+heat+effects+on+transdermal+delivery+systems:+exploratory+studies+with+nicotine+and+fentanyl.">On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl.</a> Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).</li><li>Hossain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterisation,+and+topical+delivery+of+terbinafine.">Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine.</a> Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).</li><li>Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+local+bioavailability+of+metronidazole+from+topical+formulations+using+dermal+microdialysis:+Preliminary+study+in+a+Yucatan+mini-pig+model.">Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).</li><li>Begley, R., Harvey, A., Byer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.Coherent+anti-Stokes+Raman+spectroscopy.">L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy.</a> Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).</li><li>Evans, C. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+and+AAPS+report+of+the+workshop+on+principles+and+practices+of+in+vitro+percutaneous+penetration+studies:+relevance+to+bioavailability+and+bioequivalence.">FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence.</a> Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+document+for+the+conduct+of+skin+absorption+studies.">Guidance document for the conduct of skin absorption studies.</a> OECD. , (2004).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+no.+428:+Skin+absorption:+In+vitro+method.">Test no. 428: Skin absorption: In vitro method.</a> OECD. , (2004).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+drug+delivery+to+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-windowsparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Herkenne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+methods+for+the+assessment+of+topical+drug+bioavailability.">In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability.</a> Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).</li><li>Alfonso-Garc&#305;a, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matplotlib:+A+2D+graphics+environment.">Matplotlib: A 2D graphics environment.</a> Computing in Science &amp; Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).</li><li>Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+R+packages:'Non-Compart'+and+'ncar'+for+noncompartmental+analysis+(NCA).">Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA).</a> Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).</li></ol>

局所BA/BEの評価は、単一の方法が in vivo cPK を完全に特徴付けることができないため、多面的なアプローチを必要とする研究分野である。このプロトコルは、コヒーレントラマンイメージングに基づく外用医薬品のBA/BEの評価のための方法論を提示する。見落とされがちな最初のポイントの1つは、特に定量透過SRSイメージングの場合、皮膚サンプルがどれほど薄くなければならないかと?...

局所薬物製品適用後のcPKを評価するための方法論は、古典的なインビトロ浸透試験(IVPT)研究1,2,3,4,5およびテープストリッピング6,7,8から、オープンフロー微小灌流または皮膚微小透析9,10,11などの追加の方法論に拡大し、12,13,14。治療作用の潜在的に様々な局所部位が、関心のある疾患に応じて存在する。したがって、API が意図したローカル サイトに到達する速度と程度を評価するための、対応する数の方法論が存在する可能性があります。前述の方法論のそれぞれに利点がありますが、主な欠点は、マイクロスケールのcPK情報の欠如(つまり、APIがどこに行き、どのように浸透するかを視覚化できないこと)です。
局所BAおよびBEを推定するために関心のある非侵襲的方法論の1つはCRIであり、これはCARS顕微鏡とSRS顕微鏡の2つのイメージングモダリティに分解することができる。これらのコヒーレントなラマン法は、非線形ラマン効果を介して分子の化学的に特異的なイメージングを可能にする。CRIでは、2つのレーザーパルス列が集束され、サンプル内でスキャンされます。レーザー周波数間のエネルギーの差は、目的の化学構造に固有の振動モードをターゲットに設定するように設定されます。CRIプロセスは非線形であるため、信号は顕微鏡焦点でのみ生成され、組織の3次元薬物動態断層画像化を可能にする。cPKの文脈において、CASは、脂質に富む皮膚構造15の位置などの組織構造情報を得るために用いられてきた。対照的に、SRSは、そのシグナルが濃度と線形であるため、分子濃度を定量するために利用されてきた。エキソビボ皮膚標本の場合、透過モード17においてエピ方向16およびSRSにおいてCASを実施することが有利である。したがって、薄い組織サンプルはSRSシグナルの検出と定量を可能にします。
モデル組織として、ヌードマウスの耳は、軽微な欠点を有するいくつかの利点を提示する。1つの利点は、組織の厚さがすでに〜200〜300μmであり、さらなるサンプル調製を必要としないことである。さらに、いくつかの皮膚層形成は、1つの視野(例えば、角質層、皮脂腺(SG)、脂肪細胞、および皮下脂肪)を通して軸方向に焦点を合わせることによって見られる16,18。これにより、ヒト皮膚サンプルに移動する前の皮膚透過経路の予備的前臨床推定および局所BA推定が可能になります。しかしながら、ヌードマウスモデルは、皮膚構造の違いによるin vivoシナリオへの外挿の困難さなどの限界を提示する19。ヌードマウスの耳は予備的な結果を得るための優れたモデルですが、人間の皮膚モデルはゴールドスタンダードです。in vivo透過動態を正確に再現するための凍結ヒト皮膚の適合性および適用性に関する様々な解説があるが20、21、22、凍結ヒト皮膚の使用は、in vitro API透過動態の評価のための受け入れられた方法である23、24、25.このプロトコルは、マウスおよびヒトの皮膚のさまざまな皮膚層を視覚化し、脂質が豊富な構造と脂質が乏しい構造内のAPI濃度を定量化します。
CRIは、組織内の化合物を特異的に可視化するために多くの分野で利用されてきたが、局所適用された薬物製品のcPKを調査する努力は限られていた。CRIを用いて外用製品の局所BA/BEを評価するには、まず、正確な比較を行うための標準化されたプロトコルが必要です。皮膚への薬物送達にCRIを使用した以前の努力は、データ内の変動性を実証している。これはCRIの比較的新しいアプリケーションであるため、プロトコルを確立することは、信頼性の高い結果を得るために重要です18,26,27。このアプローチは、ラマンスペクトルの生物学的サイレント領域内の1つの特定の波数のみを標的とする。しかし、ほとんどのAPIと不活性成分には、指紋領域内にラマンシフトがあります。これは、指紋領域の組織から生じる固有のシグナルのために、以前は課題を提起していた。最近のレーザーおよび計算の進歩により、この障壁が取り除かれており、これは、ここで提示されたアプローチと組み合わせて利用することもできる28。ここで紹介するこのアプローチは、サイレント領域(2,000-2,300 cm-1)にラマンシフトを持つAPIの定量化を可能にします。これは、薬物の生理化学的特性に限定されず、これは、先に述べたいくつかのcPKモニタリング方法論29について当てはまるかもしれない。
このプロトコルは、厚いヒト皮膚サンプルが厚いサンプルによる光散乱による薬物製品適用後に最小限のシグナルを生成するため、さまざまな調製物の皮膚厚さのサンプル間の変動を低減する必要があります。この原稿の目標は、再現性のある画像化基準を保証する組織調製方法論を提示することです。さらに、CRIシステムは、潜在的な誤差源を低減し、信号対ノイズを最小限に抑えるために、説明どおりにセットアップされています。しかし、本稿では、CRI顕微鏡の指導原理や技術的メリットについては、これまで取り上げてきた30では触れない。最後に、実験の成功または失敗を判断するための結果の解釈を可能にするために、広範なデータ分析手順が検討されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bags</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>22-044562</td>
			<td>As refered to in text: biohazard bags 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&#38;searchTerm= 22044562&#38;searchType=RAPID&#38; matchedCatNo=22044562</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Buffers: Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21030CV</td>
			<td>As refered to in text: PBS 
			https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&#38;searchTerm= 21-030-cv&#38;searchType= RAPID&#38;matchedCatNo=21-030-cv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td>As refered to in text: scalpel 
			https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision 45&#176; Angle Broad Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-132</td>
			<td>As refered to in text: forceps 
			https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science</td>
			<td>06-666</td>
			<td>As refered to in text: task wiper 
			https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>As refered to in text: parafilm 
			https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (35 mm x 10 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>As refered to in text: small petri dish 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>As refered to in text: large petri dish 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>NC9411473</td>
			<td>As refered to in text: scissors 
			https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&#38;searchTerm= RS-5915SC&#38;searchType=RAPID&#38; matchedCatNo=RS-5915SC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser/microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control box IX2-UCB</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Control Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D700/30m</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: CARS filter - deuterated band 
			https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepSee Insight</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Laser 
			https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>As refered to in text: power meter 
			https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Microscope Control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: microscope slides 
			https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>GM-800</td>
			<td>As refered to in text: incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S142C</td>
			<td>As refered to in text: photodiode 
			https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply FV31-PSU</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Power Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator</td>
			<td>BK Precision</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: function generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan &#8211; Precision Microscope Automation</td>
			<td>Prior Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: stage controller 
			https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal Imaging Spacers</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>654004</td>
			<td>As refered to in text: spacer 
			https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRS Detection Kit</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: SRS detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLSAPO 20X NA:0.75</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: 20X Objective 
			https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid/Drug Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>NC9711297</td>
			<td>As refered to in text: Glass bottom dish 
			https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Cotton-tipped applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distriman Postive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Postive Displacement Pipette 
			https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distriman Postive Displacement Pipette Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Tips for pipette 
			https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: FIJI/ImageJ 
			https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter-Lab</td>
			<td>open-source</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: JupyterLab 
			https://jupyter.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>As refered to in text: Rstudio 
			https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and quantifying pharmaceutical compounds within skin using coherent raman scattering imaging

局所製剤適用後の皮膚薬物動態(cPK)は、局所バイオアベイラビリティ(BA)を機構的に理解するために、規制および医薬品開発科学者にとって特に関心のある研究分野となっている。テープストリッピング、真皮微量透析、または真皮開放流微小灌流などの半侵襲的技術はすべて、マクロスケールcPKを定量化する。これらの技術は膨大なcPKの知識を提供してきましたが、コミュニティは細胞レベルでの医薬品有効成分(API)の浸透と浸透に関する機械的な理解を欠いています。 
マイクロスケールcPKに対処するための非侵襲的アプローチの1つは、コヒーレントラマン散乱イメージング(CRI)であり、外因性標識または化学修飾を必要とせずに、内因性分子振動を選択的に標的とする。CRIには、コヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)と刺激ラマン散乱(SRS)の2つの主要な方法があり、APIまたは不活性成分の高感度かつ選択的な定量を可能にします。CARSは通常、構造皮膚情報を導き出したり、化学的コントラストを視覚化したりするために利用されます。対照的に、分子濃度と直線的なSRSシグナルは、皮膚層別化中のAPIまたは不活性成分を定量するために使用される。 
マウス組織はCRIによるcPKに一般的に利用されてきたが、局所BAおよび生物学的同等性(BE)は、規制当局の承認前にヒト組織において最終的に評価されなければならない。この論文は、局所 BAおよびBE の評価における定量的薬物動態学的CRI研究に使用されるex vivo皮膚を調製および画像化するための方法論を提示する。この方法論は、時間の経過とともにヒトおよびマウスの皮膚内で信頼性が高く再現可能なAPI定量を可能にします。脂質が豊富なコンパートメントおよび脂質が乏しいコンパートメント内の濃度、ならびに経時的な総API濃度が定量化される。これらは、ミクロおよびマクロスケールのBAおよび潜在的にBEの推定に利用される。

イメージングは、実験終了時に組織が軸方向(<10μm)または横方向に有意に移動しなかった場合に成功したと見なされます(図4)。これは、対象のAPIのSRS測定が、定量化が層特異的である初期深さを代表していない場合の即時の指標です。これは、関心のある各XY位置のzスタックをイメージングすることによって軽減され、トレードオフは時間分解能です。凍結皮膚がこれ?...

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Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging

皮膚内の医薬品化合物を視覚化および定量化するためのコヒーレントなラマン散乱イメージング方法論が記載されている。この論文では、皮膚組織調製物(ヒトおよびマウス)および局所製剤の適用、時空間濃度プロファイルを定量化するための画像取得、および局所薬物送達を評価するための予備薬物動態解析について説明する。

コヒーレントラマン散乱イメージングを用いた皮膚内の医薬品化合物の可視化と定量

Cutaneous pharmacokinetics (cPK) after topical formulation application has been a research area of particular interest for regulatory and drug development ...

この方法論は、コヒーレントラマンイメージングを使用して局所適用された薬物製品を定量するための再現性のある正確な方法を可能にするという点で重要です。他の方法論は、かさばる皮膚薬物動態情報を提供し、一方、この方法論は、薬物の透過経路などのバルクおよびマイクロスケールの皮膚薬物動態情報の両方を提供することができる。可視化・定量化・浸透経路により、特定の経路を念頭に置いた医薬品の開発が目的部位に到達することが可能になります。組織調製は、この方法論の最も困難な部分であることが証明されます。組織は、皮膚を通して読むことができるように十分に薄くなければならない。ヌードマウスの耳皮膚組織の調製を開始するには、安楽死させたヌードマウスを取得し、鉗子および顕微手術ハサミを使用してマウスの耳を除去する。次に、60ミリメートル×15ミリメートルの大きさの大きなペトリ皿に片方の耳を置きます。次に、マウスの耳をPBSで2回すすぎ、毎回タスクワイパーで耳を乾かします。24時間以内に使用する場合は、PBSの耳を2〜8°Cの35ミリメートル×10ミリメートルの小さなペトリ皿に入れます。収穫の24時間後に使用するには、PBSのないペトリ皿に耳を入れ、パラフィルムで皿を覆ってマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。生物学的フードの下で作業している間、皮下脂肪がアクセスできるように、角質層側が下を向いた大きなペトリ皿に人間の皮膚組織を置きます。その後、鉗子と顕微手術はさみを使用して皮下脂肪を除去します。皮下脂肪がハサミで除去できなくなったら、10枚の刃の使い捨てメスを皮膚に対して45度の角度で使用し、鉗子で皮膚を静止させながら残りの皮下脂肪を除去します。脂肪が取り除かれたら、人間の皮膚を1センチ×1センチに切断する。脂質イメージングのために、マウス耳の前部を35ミリメートルの番号ゼロの皿のガラス底に向かって向けて配置する。ヒトの皮膚の場合、角質層を伏せて皮膚を配置し、表面層から深層への薬物定量を可能にする。組織がガラス底に集中したら、綿の先端アプリケーターを使用して、皮膚が平らで、ガラス底皿のカバースリップ面と完全に接触していることを確認します。イメージング中の動きを防ぐには、ワッシャーを皮膚の上に置き、刺激ラマン散乱またはSRS透過検出のためにワッシャーの中央穴から組織が見えるようにします。予め決定された用量の製剤を皮膚上にピペットし、次いで手袋をはめた指を用いて製剤を時計回りに30秒間擦る。製剤が透過するまでに割り当てられた時間が経過した後、製剤側がガラス底皿に向かって向くように皮膚を配置する前に、余分な製剤を除去する。次に、顕微鏡制御またはMCソフトウェアをオンにして実験セットアップに進みます。接眼レンズを通して、調整ノブで軸方向の焦点を調整して、組織の焦点が合っていることを確認します。完了したら、ポンプビームとストークスビームの両方のブロックを解除し、ALG1 および ALG2 チャネルが有効になっていることを確認します。SRSフォトダイオードがコンデンサーの上にあることを確認し、MCソフトウェアの[フォーカスx2]をクリックして、CARSおよびSRSチャンネルのスキンを視覚化します。マルチエリアタイムラプスまたはMATLモジュールで、[表示]タブに移動し、[登録済みポイントリスト]をクリックしてイメージングリストを表示します。角質層が特定されたら、軸方向の焦点またはZ焦点をスクロールして、特定の組織層別化を同定する。特定の深さは、角質層、皮脂腺、脂肪細胞、または皮下脂肪などの皮膚内に、脂質同調コントラストを有するライブイメージング中に決定されるように、追加することができる。ただし、深度スタック全体を取得する場合は、XY 位置を追加でき、相対的な Z 位置は無視できます。各スキン層別化に固有の深度をイメージングする場合は、レジスタポイントを選択してMATLキューに追加します。完全な深さスタックの場合は、「集録パラメータ」ウィンドウで「深さ選択機能を持つ各 XY 位置の登録点」をクリックします。次に、MATLモジュールで繰り返し回数を1に設定し、[準備完了]をクリックします。Play 矢印がグレーから黒に変わったら、Play を押して予備脂質スタックのイメージングを開始します。イメージングサイクルが完了したら、ポンプビームとストークスビームの両方をブロックし、レーザーグラフィカルユーザーインターフェイスの波長を、ターゲット波数またはラマン振動に基づいて目的の波長に変更します。手動の時間遅延ステージを調整しながら、先験的に確立された脂質および医薬品有効成分またはAPIを画像化するために同じ電力が使用されるようにします。サイクルの繰り返しの合計数を選択したら、ポンプビームのブロックを解除し、フォトダイオードを使用して電力が目的の電力と一致するかどうかを確認する前に、再生を押してセットポイントの自動イメージングを開始します。次に、皮脂腺脂質画像をフィジーにインポートし、[チャネルの分割]というラベルの付いたボックスにチェックを入れて、ファイルをCARSチャネルとSRSチャネルに分割することで、各皮膚層別化のデータ分析を実行します。関心領域またはROIマネージャを開くには、[分析]、[ツール]、[ROIマネージャ]をクリックします。C が 1 に等しくなるように SRS チャネルを使用して、画像内の皮脂腺をデマーキーし、ROI マネージャーの [T の追加] をクリックしてマーキングを ROI マネージャーに追加します。画像内の各皮脂腺についてこのプロセスを繰り返します。脂質が豊富な領域をマスクするには、各ROIを選択し、[その他]、[または結合]、[追加]タブの順にクリックします。脂質不足の領域をマスクするには、フィジーメニューの長方形ツールを使用して、画像全体の周りに正方形を描画します。ROI マネージャーに地域を追加します。ROIマネージャですべての脂質リッチ領域を選択するROIに加えて、新しく追加された正方形ROIをクリックします。[その他] で [XOR] を選択して脂質不良領域のマスクを生成し、ROI マネージャーに追加します。画像、スタック、ツール、および連結タブの順に移動して、画像を番号順に連結します。または、画像をフィジーにロードし、セットアップページで同様の名前のファイルをグループ化するというオプションを選択して、画像をインポートします。連結された画像をアクティブにしたまま、ROI マネージャに移動して脂質が豊富な領域を選択し、[その他] タブをクリックしてから [マルチメジャー] を選択し、[結果] ウィンドウが表示されるのを待ちます。「結果」ウィンドウから、データをスプレッドシートにエクスポートし、「領域」というタイトルの列を追加して、脂質が豊富な領域をデータの各行に追加します。脂質の外側にあった領域に脂質不良を加える。データを視覚化するには、スプレッドシートを保存してRパッケージggplot2にインポートします。次に、画像を画像数対平均強度の関数としてプロットし、濃度-時間データを推定します。スプレッドシートからインポートされた強度時間データに対して、RStudio で非コンパートメント解析または NCA を 1 つのレイヤーの呼び出しで実行します。完了したら、Jmax メトリックと AUCflux すべてのメトリックをプロットして視覚的に比較します。さらに、実験条件間で統計的比較を行う。代表的な分析は、角質層、皮脂腺、脂肪細胞、ヌードマウス耳皮膚からの皮下脂肪、および角質層、真皮乳頭、およびヒト皮膚からの皮脂腺を描写する。ヌードマウス耳皮膚において、皮脂腺の限られた組織移動は、製剤適用時および適用後120分で腺の同じ組織深さで観察された。皮膚における実質的な組織運動は、薬物適用の120分後にかろうじて見える皮脂腺を示し、元のプロトコルの非効率性を実証した。いくつかの研究では、強度対時間プロファイルは高い初期濃度を示し、続いて濃度が低下し、組織への薬物のさらなる吸収がないことを示した。一方、いくつかの研究は、後に実験期間にわたって減少した強度の上昇を示し、組織へのフラックスが画像化前に最大に達していなかったことを実証した。同じAPIに対する2つの製剤の濃度時間プロファイルのNCA分析は、エトキシエトキシエタノールが、皮膚層に関係なくゲル製剤のそれと比較して拡張されたAPI透過を提供することを示した。同じ製剤間の全暴露分析では、皮膚のより深い層で同様の観察結果が示された。薬物塗布後のヒト皮膚の調製およびガラス底皿への適切な皮膚配置は、実験の成功にとって極めて重要である。ここでの明確な解決策は、この方法論の適合性を実証しました。さらなる研究には、製剤がAPIの浸透と浸透にどのように影響するかを理解するために、クリームなどの市販の製剤が含まれます。

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

全血刺激のためのアッセイを用いて炎症性サイトカインIL -1βの正確かつ簡単に測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

定量的な可視化と動的な熱画像を用いた皮膚癌の発見

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

間褐色脂肪組織のチェレンコフ発光イメージング

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

前立腺針生検の時のポビドンヨード直腸準備手続き感染のリスクを軽減するためにシンプルで再現性のある手段であります

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

多フッ素化された胆汁酸を用いて<em&gt;インビボ</em胆汁酸輸送を測定するために&gt;磁気共鳴イメージング

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

免疫応答の生体内多光子イメージングのためのマウスの耳の皮膚に虚血再灌流傷害を誘導します

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...