Name: light-controlled fermentations for microbial chemical and protein production
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts og Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

1. Lysstyret kemisk produktion ved hjælp af S. cerevisiae OptoINVRT7-kredsløbet
<ol><li>Stamme konstruktion<ol>
<li>Opnå en stamme med his3 auxotrofi, da denne markør er nødvendig for de fleste eksisterende OptoINVRT plasmider5. Hvis du søger optogenetisk regulering af et gen, der er hjemmehørende i S. cerevisiae, skal du konstruere en stamme, hvor enhver endogen kopi af genet slettes.</li>
		<li>Lineariser plasmidet, der indeholder OptoINVRT7-...

<ol>
	<li>Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+shine+of+yeast+optogenetics.">The rise and shine of yeast optogenetics.</a> Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).</li><li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction:+Dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments.">The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).</li><li>Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+metabolism+through+dynamic+control.">Engineering metabolism through dynamic control.</a> Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).</li><li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+modalities+of+dynamic+control+in+metabolic+engineering.">Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+rapid+optogenetic+circuits+for+dynamic+control+in+yeast+metabolic+engineering.">Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).</li><li>Lalwani, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+the+lac+operon+for+bacterial+chemical+and+protein+production.">Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production.</a> Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+engineered+cellular+metabolism+for+microbial+chemical+production.">Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production.</a> Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).</li><li>Baumschlager, A., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biological+approaches+for+optogenetics+and+tools+for+transcriptional+light-control+in+bacteria.">Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria.</a> Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).</li><li>Dvorak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+substrate+toxicity+by+IPTG+in+Escherichia+coli+BL21(DE3)+carrying+a+synthetic+metabolic+pathway.">Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway.</a> Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).</li><li>Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+in+metabolic+engineering:+Theories,+tools,+and+applications.">Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications.</a> Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).</li><li>Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+metabolism.">Dynamic control of metabolism.</a> Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+amplification+circuits+for+light-induced+metabolic+control.">Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).</li><li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurospora+crassa+Inducible+Q+System+Enables+Simultaneous+Optogenetic+Amplification+and+Inversion+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+Bidirectional+Control+of+Gene+Expression.">The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Marx, H., Mecklenbr&#228;uker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+gene+copy+number+amplification+in+Pichia+pastoris+by+vector+integration+into+the+ribosomal+DNA+locus.">Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus.</a> FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).</li><li>Nord&#233;n, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+dosage+greatly+enhances+recombinant+expression+of+aquaporins+in+Pichia+pastoris.">Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris.</a> BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-based+control+of+metabolic+flux+through+assembly+of+synthetic+organelles.">Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles.</a> Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).</li><li>Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microbes+to+synthesize+plant+isoprenoids.">Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids.</a> Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).</li><li>Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+tac+promoter+and+lacI(q)+for+the+controlled+expression+of+Zymomonas+mobilis+fermentative+genes+in+Escherichia+coli+and+Zymomonas+mobilis.">Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis.</a> Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).</li><li>Steen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+the+production+of+n-butanol.">Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.</a> Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).</li><li>Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+central+carbon+metabolism+for+improved+pathway+yields+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).</li><li>Jayaraman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-mediated+transcriptional+activation+and+repression+of+gene+expression+in+bacteria.">Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria.</a> Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).</li><li>Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RGB+color+vision+into+Escherichia+coli.">Engineering RGB color vision into Escherichia coli.</a> Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-powered+Escherichia+coli+cell+division+for+chemical+production.">Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).</li><li>Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-inducible+flux+control+of+triosephosphate+isomerase+on+glycolysis+in+Escherichia+coli.">Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).</li><li>Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+synechocystis+PCC6803+UirS-UirR+as+a+UV-violet/green+photoreversible+transcriptional+regulatory+tool+in+E.+Coli.">Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).</li><li>Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichromatic+control+of+gene+expression+in+escherichia+coli.">Multichromatic control of gene expression in escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).</li><li>Stewart, C. J., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+an+automated+illuminating,+culturing,+and+sampling+system+for+microbial+optogenetic+applications.">Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).</li><li>Gr&#248;dem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments.">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+characterisation+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio.">In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLoS Biology. 18 (7), (2020).</li><li>Carrasco-L&#243;pez, C., Garc&#237;a-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+and+biosensors+set+the+stage+for+metabolic+cybergenetics.">Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).</li><li>Melendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures.">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li><li>Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+Bacillus+subtilis+gene+expression.">Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Xia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modification+of+pseudomonas+aeruginosa+enables+controllable+twitching+motility+and+host+infection.">Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).</li><li>Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+manipulation+enables+prevention+of+biofilm+formation+of+engineered+pseudomonas+aeruginosa+on+surfaces.">Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).</li></ol>

Dynamisk kontrol har længe været anvendt til at forbedre udbyttet for metabolisk teknik og rekombinant proteinproduktion4. Forskydninger i enzymatisk ekspression implementeres typisk ved hjælp af kemiske induktorer såsom IPTG21, galactose22 og tetracyclin23, men er også blevet medieret ved hjælp af procesbetingelser som temperatur og pH. Optogenetisk kontrol af genekspression eliminerer behovet for ændringer i fermenter...

Optogenetik, kontrol af biologiske processer med lysresponsive proteiner, tilbyder en ny strategi til dynamisk kontrol af mikrobielle fermentementer til kemisk og proteinproduktion1,2. Byrden ved konstruerede metaboliske veje og toksiciteten af visse mellemprodukter og produkter forringer ofte cellevæksten3. Sådanne belastninger kan føre til dårlig ophobning af biomasse og nedsat produktivitet3. Denne udfordring kan løses ved tidsmæssigt at opdele fermenteringen i en vækst- og produktionsfase, som afsætter metaboliske ressourcer til henholdsvis biomasseakkumulering eller produktsyntese4. Vi viste for nylig, at overgangen fra vækst til produktion i denne tofasede gæring kan induceres med ændringer i belysningsforholdene5,6,7. Lysindgangens høje tunbarhed, reversibilitet og ortogonalitet8 giver unikke fordele ved lysstyrede fermenteringener, der er vanskelige eller umulige at replikere med kemiske induktorer, der anvendes til dynamisk kontrol af konventionelle tofasede fermenteringener4,9,10,11.
Det blå lys responsive EL222 protein afledt af Erythrobacter litoralis er blevet brugt til at udvikle flere optogenetiske kredsløb til metabolisk teknik i Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 indeholder et lys-ilt-spændingssensor (LOV) domæne, der gennemgår et konformationsskift ved aktivering af blåt lys (465 nm), som gør det muligt at binde sig til sin beslægtede DNA-sekvens (C120)13. Sammensmeltning af EL222 til det virale VP16-aktiveringsdomæne (VP16-EL222) resulterer i en blålysresponsiv transkriptionsfaktor, der reversibelt kan aktivere genekspression i S. cerevisiae7 og andre organismer14 fra den syntetiske promotor PC120. Flere kredsløb baseret på EL222 er blevet udviklet og anvendt til kemisk produktion i S. cerevisiae, såsom det grundlæggende lysaktiverede OptoEXP-system7, hvor genet af interesse udtrykkes direkte fra PC120 (figur 1A). Bekymringer om lysindtrængning ved de høje celletætheder, der typisk opstår i produktionsfasen af fermenteringer, motiverede os imidlertid til at udvikle omvendte kredsløb, der induceres i mørket, såsom OptoINVRT- og OptoQ-INVRT-kredsløbene (figur 1B) 5,7,13. Disse systemer udnytter galactose (GAL) eller dikinsyre (Q) reguloner fra henholdsvis S. cerevisiae og N. crassa, der styrer deres tilsvarende repressorer (GAL80 og QS) med VP16-EL222, for at undertrykke genekspression i lyset og stærkt inducere det i mørket. Kombination af OptoEXP- og OptoINVRT-kredsløb resulterer i tovejskontrol af genekspression, hvilket muliggør tofasede fermenteringer, hvor vækstfasen induceres med blåt lys, og produktionsfasen med mørke (figur 2A)5,7.
Brug af lys i stedet for mørke til at fremkalde genekspression i produktionsfasen ville i høj grad udvide mulighederne for optogenetiske kontroller, men ville også kræve at overvinde lysindtrængningsbegrænsningerne for de høje celletætheder, der typisk opstår i denne fase af gæringen. Til dette formål har vi udviklet kredsløb, kendt som OptoAMP og OptoQ-AMP, der forstærker transkriptionsresponsen på stimulering af blåt lys. Disse kredsløb bruger vildtype eller overfølsomme mutanter af VP16-EL222 til at kontrollere produktionen af transkriptionsaktivatorerne Gal4p eller QF2 af henholdsvis GAL- eller Q-regulonerne, hvilket opnår øget følsomhed og stærkere genekspression med lys12,13 (figur 1C). OptoAMP-kredsløb kan opnå fuldstændig og homogen lysinduktion i 5 L bioreaktorer ved en optisk densitet (målt ved 600 nm; OD600) værdier på mindst 40 med kun ~0,35% af belysningen (5% lysdosis på kun ~7% af bulkoverfladen). Dette viser en højere grad af følsomhed sammenlignet med OptoEXP, som kræver tæt på 100 % belysning12. Evnen til effektivt at inducere genekspression med lys ved høje celletætheder åbner nye muligheder for dynamisk kontrol af fermenteringer. Dette omfatter driftsgæringer i mere end to tidsmæssige faser, såsom trefasede fermentementer, hvor vækst-, induktions- og produktionsfaser etableres med unikke lysplaner for at optimere kemisk produktion (figur 2B)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg"> Figur 1: Optogenetiske kredsløb til dynamisk styring af S. cerevisiae. OptoEXP-, OptoINVRT- og OptoAMP-kredsløbene er baseret på det lysfølsomme VP16-EL222-system. (A) I OptoEXP-kredsløbet forårsager eksponering for blåt lys en konformationsændring og dimerisering af VP16-EL222, som udsætter et DNA-bindende domæne og muliggør transkription fra PC120. Figuren er blevet modificeret fra Zhao et al.7. (B) OptoINVRT-kredsløb udnytter GAL-regulonerne (vist) eller Q-regulonerne til at fremkalde udtryk i mørket. I GAL-baserede kredsløb udtrykkes VP16-EL222 og GAL4 konstitutivt, mens PC120-drevudtryk for GAL80-repressoren (i Q-baserede kredsløb erstattes GAL4 og GAL80 af henholdsvis QF2 og QS, og en syntetisk QUAS-holdig promotor anvendes i stedet for en GAL-promotor). I lyset forhindrer Gal80p aktivering af genet af interesse fra PGAL1. I mørket udtrykkes GAL80 ikke og nedbrydes hurtigt ved at smelte det sammen til et konstitutivt degrondomæne (lille brunt domæne), hvilket gør det muligt at aktivere PGAL1 af Gal4p. Figuren er blevet modificeret fra Zhao et al.5. (C) OptoAMP-kredsløb bruger også VP16-EL222 til at styre GAL(vist) eller Q-regulonerne. I disse kredsløb udtrykkes GAL80-repressoren (eller QS) konstitutivt og smeltes sammen til en fotofølsom degron (lille blåt domæne), der sikrer tæt undertrykkelse i mørket. PC120 og en overfølsom VP16-EL222 mutant kontrolekspression af GAL4 (eller QF2) med lys, som stærkt aktiverer PGAL1 (eller en QUAS-holdig promotor) i lyset. GAL-afledte kredsløb kan bruge konstruerede former for PGAL1, såsom PGAL1-M eller PGAL1-S, som har øget aktivitet, samt vildtypepromotorer kontrolleret af GAL-regulon (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Figuren er ændret fra Zhao et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg"> Figur 2: To- og trefasede fermentementer gennem tiden. (A) Tofasede fermentementer, der drives med inverterede kredsløb, består af en lysdrevet vækstfase og en mørk produktionsfase. I vækstfasen akkumuleres biomasse, da produktionsvejen forbliver undertrykt. Efter at have nået den ønskede OD600, skiftes cellerne til mørket for metabolisk justering, inden de resuspendes i friske medier til produktionsfasen. (B) I en trefaset proces defineres vækst-, inkubations- og produktionsfaserne af unikke lysskemaer, som kan bestå af en mørk vækstperiode, pulserende inkubation og fuldt belyst produktionsfase. Figur oprettet med Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Optogenetiske kredsløb er også udviklet til dynamisk styring af kemisk og proteinproduktion i E. coli. OptoLAC-kredsløb styrer den bakterielle LacI-repressor ved hjælp af det lysresponsive pDawn-kredsløb, som er baseret på YF1/FixJ-tokomponentsystemet6 (figur 3). I lighed med OptoINVRT5 er OptoLAC-kredsløb designet til at undertrykke genekspression i lyset og inducere det i mørket. Ekspressionsniveauer ved hjælp af OptoLAC-kredsløb kan matche eller overstige dem, der opnås med standard isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induktion, hvilket opretholder styrken af kemisk induktion, samtidig med at den giver forbedret tunbarhed og reversibilitet6. Derfor muliggør OptoLAC-kredsløb effektiv optogenetisk kontrol til metabolisk teknik i E. coli.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg"> Figur 3: OptoLAC-kredsløb til dynamisk styring af E. coli. OptoLAC-kredsløbene tilpasser pDawn-systemet og lac operon for at opnå aktivering i mørket og undertrykkelse i lyset. I mørket fosforylerer YF1 FixJ, som derefter aktiverer PFixK2-promotoren for at udtrykke cI-repressoren. CI-repressoren forhindrer ekspression af lacI-repressoren fra PR-promotoren, hvilket tillader transkription af genet af interesse fra en lacO-holdige promotor. Omvendt reducerer blåt lys YF1-netkinaseaktiviteten, vender FixJ-fosforylering og dermed cI-ekspression, hvilket aflaster ekspression af lacI og forhindrer ekspression fra den lacO-holdige promotor. Figuren er modificeret fra Lalwani et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Vi beskriver her de grundlæggende protokoller for lyskontrollerede fermenteringen af S. cerevisiae og E. coli til kemisk eller proteinproduktion. For både gær og bakterier fokuserer vi først på fermentementer med en lysdrevet vækstfase og en mørkeinduceret produktionsfase muliggjort af OptoINVRT- og OptoLAC-kredsløb. Derefter beskriver vi en protokol for en trefaset (vækst, induktion, produktion) lysstyret gæring aktiveret af OptoAMP-kredsløb. Desuden beskriver vi, hvordan man opskalerer optogenetisk kontrollerede fermentementer fra mikroplader til laboratorieskala bioreaktorer. Med denne protokol sigter vi mod at levere en komplet og let reproducerbar vejledning til udførelse af lyskontrollerede fermenteringener til kemisk eller proteinproduktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light-controlled chemical production using S. cerevisiae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>303991049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>501879892 (G8270-5KG)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica-plating device</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37848-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica-plating pads</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>3005-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC-His powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1303-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC Complete powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile sealing film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>STR-SEAL-PLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100217-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-controlled protein production using E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Cepham Life Sciences</td>
			<td>10502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide protein gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0341BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>SX0425-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoLAC plasmids</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-phase fermentation using S. cerevisiae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Same materials as &#34;Light-controlled chemical production using S. cerevisiae&#34; protocol plus the following:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical production in a light-controlled bioreactor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor with control station</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B120110001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89501-620 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPT tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>501879892 (G8270-5KG)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1374401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0503-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC Complete powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-controlled fermentations for microbial chemical and protein production

Mikrobielle cellefabrikker tilbyder et bæredygtigt alternativ til fremstilling af kemikalier og rekombinante proteiner fra vedvarende råmaterialer. Imidlertid kan overbelastning af en mikroorganisme med genetiske modifikationer reducere værtsfitness og produktivitet. Dette problem kan overvindes ved hjælp af dynamisk kontrol: inducerbar ekspression af enzymer og veje, typisk ved hjælp af kemiske eller næringsbaserede tilsætningsstoffer, for at afbalancere cellulær vækst og produktion. Optogenetik tilbyder en ikke-invasiv, meget indstillelig og reversibel metode til dynamisk regulering af genekspression. Her beskriver vi, hvordan man opsætter lysstyrede fermenteringener af konstruerede Escherichia coli og Saccharomyces cerevisiae til fremstilling af kemikalier eller rekombinante proteiner. Vi diskuterer, hvordan man anvender lys på udvalgte tidspunkter og doser for at afkoble mikrobiel vækst og produktion for forbedret gæringskontrol og produktivitet samt de vigtigste optimeringsovervejelser for de bedste resultater. Derudover beskriver vi, hvordan man implementerer lysstyring til laboratorieskala bioreaktorforsøg. Disse protokoller letter vedtagelsen af optogenetiske kontroller i konstruerede mikroorganismer for forbedret gæringsydelse.

Optogenetisk regulering af mikrobiel metabolisme er blevet implementeret med succes for at producere en række produkter, herunder biobrændstoffer, bulkkemikalier, proteiner og naturlige produkter5,6,7,12,13. De fleste af disse processer er designet til, at cellevækst kan forekomme i lyset (når lav celletæthed udgør minimale udfordringer med lysindtrængn...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production at JoVE.com

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Optogenetisk kontrol af mikrobiel metabolisme giver fleksibel dynamisk kontrol over fermenteringsprocesser. Protokollen her viser, hvordan man opretter blålysregulerede fermenteringener til kemisk og proteinproduktion på forskellige volumetriske skalaer.

Lysstyrede fermentementer til mikrobiel kemisk og proteinproduktion

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Optogenetik er blevet brugt til at opnå højere titre af flere kemikalier og proteiner sammenlignet med typiske induktorer. Ved hjælp af denne protokol kan andre forbedre deres egne processer med lysbaseret kontrol. Optogenetikkontrol er ikke-invasiv, meget justerbar og reversibel.Disse kvaliteter giver mulighed for en strømlinet optimering af mikrobielle processer og åbner endda unikke muligheder, som trefasede fermentementer og multikromatisk kontrol. For ethvert nyt kemikalie vil de optimale lysforhold afvige. Så hvis der observeres lav produktion ved hjælp af parametrene i denne protokol, skal forskellige lysforhold testes.Begynd med at opnå en Saccharomyces cerevisiae stamme med HIS3 oxytrofi, en markør, der er nødvendig for OptoINVRT plasmider. Hvis du søger at kontrollere et gen, der er hjemmehørende i Saccharomyces cerevisiae, skal du sikre dig, at den endogene kopi af genet slettes, før du fortsætter. For at starte belastningskonstruktionen skal du linearisere plasmidet, der indeholder OptoINVRT7-kredsløbet, såsom EZL439.Hvis du bruger EZL439, som indeholder komponenterne til at undertrykke PIGA one promotor i lyset og aktivere det i mørket, skal du linearisere på Pme1-begrænsningsstedet. Ved hjælp af standard lithiumacetattransformationsmetoder integreres plasmidet i en HIS3 auxotrofisk stamme. Efter transformationen centrifugeres cellerne ved 150 G'er i et minut.Forsigtigt resuspend cellerne i 200 mikroliter frisk SC-HIS medium. Plade hele cellevolumenet på en SC-HIS agarplade og inkuber ved 30 grader Celsius i to til tre dage, indtil kolonier vises. Forbered kompetente celler ved hjælp af standard lithiumacetattransformationsprotokoller.Transformer cellerne med plasmidet, der indeholder de gener, som du ønsker at optogenetisk kontrollere nedstrøms for enten PIGA1M- eller PIGA1S-promotorerne. Efter transformation centrifugeres kulturen ved 150 G i et minut og suspenderes forsigtigt cellepillen i 200 mikroliter frisk SC-drop-out medium. Plade hele cellevolumenet på en gærekstrakt peptone dextrose agar plade, hvis den integreres i Delta steder eller en SC drop-out plade, hvis den omdannes med et plasmid indeholdende en markeringsmarkør.Inkuber cellerne ved 30 grader Celsius i 16 timer under konstant blåt lys for at holde det optogenetisk kontrollerede gen undertrykt. Brug en hvilken som helst lyskilde med en bølgelængde på 465 nanometer, og placer et LED-panel cirka 40 centimeter over pladen, således at lysintensiteten er ca. 80 til 110 mikromol pr. Kvadratmeter pr. Sekund. Mål intensiteten ved hjælp af en kvantemåler.Hvis du integrerer i Delta-steder, replikeres pladen på gærekstrakt peptone dextroseplader, der indeholder en række Zeocin-koncentrationer mellem 400 mikrogram pr. Milliliter og 1.200 mikrogram pr. Milliliter for at vælge en række integrationskopinumre. Inkuber replikapladerne ved 30 grader Celsius under konstant eller pulserende blåt lys i to til tre dage, indtil kolonierne vises. For at udføre den indledende screening skal du vælge otte kolonier fra hver plade og bruge dem til at inokulere en milliliter SC-HIS-medium suppleret med 2% glucose i individuelle brønde i en 24 brøndplade.Dyrk cellerne natten over ved 30 grader Celsius ryster ved 200 omdrejninger i minuttet under konstant blåt lys belysning. Den næste dag fortyndes hver kultur i et nyt SC-HIS-medium med 2% glucose for at opnå de optiske densitetsværdier fra 0,01 til 0,3 ved 600 nanometer og dyrke kulturerne i rystende tilstand 200 omdrejninger i minuttet under konstant eller pulserende lys ved 30 grader Celsius, indtil den optiske densitet når mellem to og ni. Pak derefter pladerne med aluminiumsfolie, sluk for lyspanelet og inkuber pladerne i mørke i fire timer ved 30 grader Celsius med 200 omdrejninger pr. Minut.Centrifugering af kulturerne i 24 brøndpladen ved 234 G'er i fem minutter og resuspender celler i en milliliter frisk syntetisk komplet drop-out medium med 2% glucose. Forsegl pladerne for at forhindre fordampning af det ønskede produkt ved hjælp af sterilt mikropladeforseglingstape. Gær de forseglede plader i mørke i 48 timer ved 30 grader Celsius ryster ved 200 omdrejninger pr. Minut.For at høste gæringerne centrifugeres pladerne i fem minutter ved 234 G'er og overføres 800 mikroliter supernatanten til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Afhængigt af det kemikalie, der er af interesse, analyseres ved hjælp af højtydende væskekromatografi, gaskromatografi massespektrometri eller en anden analysemetode ved hjælp af prøveforberedelsesteknikken, der er bedst egnet til det anvendte instrument. Vælg otte kolonier fra hver plade, og brug dem til at inokulere en milliliter SC-HIS-medium med 2% glucose i individuelle brønde i en 24 brøndplade.Dyrk cellerne natten over i mørket ved 30 grader Celsius med 200 omdrejninger i minuttet rystelser. Næste morgen fortyndes hver kultur i et frisk SC-HIS medium med 2% glucose til 0,1 optisk densitet. Pak pladerne ind i aluminiumsfolie for at forhindre udsættelse for lys og dyrk kulturen i mørket ved 30 grader Celsius med 200 omdrejninger i minuttet, der rystes, indtil de når en optisk densitet på tre.Derefter inkuberes pladerne under pulserende lys i 12 timer ved 30 grader Celsius med 200 omdrejninger pr. Minut rystelse. Centrifugering af kulturerne ved 234 G'er i fem minutter og resustation i frisk SC-HIS medium med 2% glucose. Forsegl pladerne for at forhindre fordampning af det ønskede produkt ved hjælp af sterilt mikropladeforseglingstape.Gær de forseglede plader i lys i 48 timer ved 30 grader Celsius og ryst ved 200 omdrejninger pr. Minut. Efter at have udført optogenetiske fermenteringer blev kemisk produktion testet ved en række celletætheder på induktionstidspunktet med to kredsløb. OptoINVRT7-kredsløbet demonstrerede høje titre af mælkesyre og isobutanol med en optimal celletæthed af induktionsværdi på 7,0 og 8,75 sammenlignet med OptoINVRT1- og 2-kredsløbene.Fermenteringene ved hjælp af OptoAMP-kredsløbene blev undersøgt i tre faser defineret af forskellige lette driftscyklusser. Mælkesyreproduktionen kan optimeres ved hjælp af en pulserende vækstfase og fuldt belyste induktions- og produktionsfaser. Isobutanolproduktionen blev optimeret ved hjælp af en pulserende vækstfase, fuldt belyst induktionsfase og pulserende produktionsfase.Mens naringeninbiosyntese bedst blev optimeret ved hjælp af en pulserende vækst fuldt belyst induktions- og mørk produktionsfase. OptoLAC-systemet er blevet anvendt i E.Coli til fremstilling af transkriptionsfaktor FDER ved titre, der er sammenlignelige med eller højere end dem, der opnås ved anvendelse af kemisk induktion med IPDG. OptoLAC-kredsløb er blevet anvendt til fremstilling af mevalonat, og produktionen overstiger titre opnået ved hjælp af IPDG-induktion.Mevalonatproduktion på bioreaktorniveau demonstrerer skalerbarheden og tunbarheden af optogenetisk regulering til kemisk og proteinproduktion i bakterier ud over mikropladeniveauer. Det er vigtigt at sikre, at lysintensiteten er i det rette område for de oplyste trin, og at lysforurening undgås for trin, der kræver mørke. Denne teknik banede vejen for at opnå rekordtitre af isobutanol i gær, stabiliserede konsortiepopulationer med lys og endda kontrollere metabolisk flux ved hjælp af syntetiske lysstyrede organeller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescenspåvisning metoder for mikrofluide dråbe platforme

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorisk syntese af og Højkapacitetsforskning Protein Udgivelse fra Polymer Film og nanopartikel Biblioteker

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese af en Intein-medieret Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedregulering af<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion og Målretning af Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

En hurtig og kvantitativ Fluorimetrisk Metode til Protein-Targeting småmolekyle Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrkning af Diverse mikrobielle samfund

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produktionen af Elastin-lignende Protein Hydrogels til indkapsling og immunfarvning af celler i 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Produktion af E. coli-udtrykte selvsamlende protein nanopartikler til vacciner, der kræver Trikemeje Epitope præsentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...