Name: light-controlled fermentations for microbial chemical and protein production
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par le département de l’Énergie des États-Unis, l’Office of Science, le numéro de prix DE-SC0019363 du bureau de la recherche biologique et environnementale, le prix NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts et le prix Camille Dreyfus Teacher-Scholar.

1. Production chimique contrôlée par la lumière à l’aide du circuit S. cerevisiae OptoINVRT7
<ol><li>Construction de la souche<ol>
<li>Obtenir une souche avec l’auxotrophie his3 , car ce marqueur est nécessaire pour la plupart des plasmides OptoINVRT existants5. Si vous cherchez une régulation optogénétique d’un gène natif de S. cerevisiae, construisez une souche dans laquelle toute copie endogène du gène est supprimée.</li>
		<li>Li...

<ol>
	<li>Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+shine+of+yeast+optogenetics.">The rise and shine of yeast optogenetics.</a> Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).</li><li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction:+Dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments.">The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).</li><li>Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+metabolism+through+dynamic+control.">Engineering metabolism through dynamic control.</a> Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).</li><li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+modalities+of+dynamic+control+in+metabolic+engineering.">Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+rapid+optogenetic+circuits+for+dynamic+control+in+yeast+metabolic+engineering.">Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).</li><li>Lalwani, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+the+lac+operon+for+bacterial+chemical+and+protein+production.">Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production.</a> Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+engineered+cellular+metabolism+for+microbial+chemical+production.">Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production.</a> Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).</li><li>Baumschlager, A., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biological+approaches+for+optogenetics+and+tools+for+transcriptional+light-control+in+bacteria.">Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria.</a> Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).</li><li>Dvorak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+substrate+toxicity+by+IPTG+in+Escherichia+coli+BL21(DE3)+carrying+a+synthetic+metabolic+pathway.">Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway.</a> Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).</li><li>Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+in+metabolic+engineering:+Theories,+tools,+and+applications.">Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications.</a> Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).</li><li>Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+metabolism.">Dynamic control of metabolism.</a> Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+amplification+circuits+for+light-induced+metabolic+control.">Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).</li><li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurospora+crassa+Inducible+Q+System+Enables+Simultaneous+Optogenetic+Amplification+and+Inversion+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+Bidirectional+Control+of+Gene+Expression.">The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Marx, H., Mecklenbr&#228;uker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+gene+copy+number+amplification+in+Pichia+pastoris+by+vector+integration+into+the+ribosomal+DNA+locus.">Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus.</a> FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).</li><li>Nord&#233;n, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+dosage+greatly+enhances+recombinant+expression+of+aquaporins+in+Pichia+pastoris.">Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris.</a> BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).</li><li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-based+control+of+metabolic+flux+through+assembly+of+synthetic+organelles.">Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles.</a> Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).</li><li>Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microbes+to+synthesize+plant+isoprenoids.">Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids.</a> Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).</li><li>Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+tac+promoter+and+lacI(q)+for+the+controlled+expression+of+Zymomonas+mobilis+fermentative+genes+in+Escherichia+coli+and+Zymomonas+mobilis.">Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis.</a> Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).</li><li>Steen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+the+production+of+n-butanol.">Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.</a> Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).</li><li>Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+central+carbon+metabolism+for+improved+pathway+yields+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).</li><li>Jayaraman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-mediated+transcriptional+activation+and+repression+of+gene+expression+in+bacteria.">Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria.</a> Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).</li><li>Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RGB+color+vision+into+Escherichia+coli.">Engineering RGB color vision into Escherichia coli.</a> Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-powered+Escherichia+coli+cell+division+for+chemical+production.">Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).</li><li>Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-inducible+flux+control+of+triosephosphate+isomerase+on+glycolysis+in+Escherichia+coli.">Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).</li><li>Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+synechocystis+PCC6803+UirS-UirR+as+a+UV-violet/green+photoreversible+transcriptional+regulatory+tool+in+E.+Coli.">Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).</li><li>Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichromatic+control+of+gene+expression+in+escherichia+coli.">Multichromatic control of gene expression in escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).</li><li>Stewart, C. J., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+an+automated+illuminating,+culturing,+and+sampling+system+for+microbial+optogenetic+applications.">Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).</li><li>Gr&#248;dem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments.">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+characterisation+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio.">In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLoS Biology. 18 (7), (2020).</li><li>Carrasco-L&#243;pez, C., Garc&#237;a-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+and+biosensors+set+the+stage+for+metabolic+cybergenetics.">Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).</li><li>Melendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures.">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li><li>Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+Bacillus+subtilis+gene+expression.">Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Xia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modification+of+pseudomonas+aeruginosa+enables+controllable+twitching+motility+and+host+infection.">Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).</li><li>Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+manipulation+enables+prevention+of+biofilm+formation+of+engineered+pseudomonas+aeruginosa+on+surfaces.">Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).</li></ol>

Le contrôle dynamique est appliqué depuis longtemps pour améliorer les rendements pour l’ingénierie métabolique et la production de protéines recombinantes4. Les changements dans l’expression enzymatique sont le plus souvent mis en œuvre à l’aide d’inducteurs chimiques tels que IPTG21, galactose22 et tétracycline23, mais ont également été médiés en utilisant des conditions de processus telles que la temp?...

L’optogénétique, le contrôle des processus biologiques avec des protéines sensibles à la lumière, offre une nouvelle stratégie pour contrôler dynamiquement les fermentations microbiennes pour la production chimique et protéique1,2. Le fardeau des voies métaboliques modifiées et la toxicité de certains intermédiaires et produits nuisent souvent à la croissance cellulaire3. De tels stress peuvent entraîner une mauvaise accumulation de biomasse et une productivité réduite3. Ce défi peut être relevé en divisant temporellement les fermentations en une phase de croissance et de production, qui consacrent des ressources métaboliques à l’accumulation de biomasse ou à la synthèse de produits respectivement4. Nous avons récemment montré que la transition de la croissance à la production dans cette fermentation en deux phases peut être induite par des changements dans les conditions d’éclairage5,6,7. La haute accordabilité, la réversibilité et l’orthogonalité des apports lumineux8 offrent des avantages uniques aux fermentations contrôlées par la lumière qui sont difficiles ou impossibles à reproduire avec des inducteurs chimiques utilisés dans le contrôle dynamique des fermentations biphasées conventionnelles4,9,10,11.
La protéine EL222 sensible à la lumière bleue dérivée d’Erythrobacter litoralis a été utilisée pour développer plusieurs circuits optogénétiques pour l’ingénierie métabolique chez Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 contient un domaine de capteur lumière-oxygène-tension (LOV) qui subit un décalage conformationnel lors de l’activation de la lumière bleue (465 nm), ce qui lui permet de se lier à sa séquence d’ADN apparenté (C120)13. La fusion d’EL222 au domaine d’activation viral VP16 (VP16-EL222) donne un facteur de transcription sensible à la lumière bleue qui peut activer de manière réversible l’expression génique chez S. cerevisiae7 et d’autres organismes14 à partir du promoteur synthétique PC120. Plusieurs circuits basés sur EL222 ont été développés et utilisés pour la production chimique chez S. cerevisiae, tels que le système OptoEXP de base activé par la lumière7, dans lequel le gène d’intérêt est directement exprimé à partir de PC120 (Figure 1A). Cependant, les préoccupations de pénétration de la lumière aux densités cellulaires élevées généralement rencontrées dans la phase de production des fermentations nous ont motivés à développer des circuits inversés induits dans l’obscurité, tels que les circuits OptoINVRT et OptoQ-INVRT (Figure 1B)5,7,13. Ces systèmes exploitent les régulons de galactose (GAL) ou d’acide quinique (Q) de S. cerevisiae et N. crassa, respectivement, contrôlant leurs répresseurs correspondants (GAL80 et QS) avec VP16-EL222, pour réprimer l’expression des gènes dans la lumière et l’induire fortement dans l’obscurité. La combinaison des circuits OptoEXP et OptoINVRT permet un contrôle bidirectionnel de l’expression des gènes, permettant des fermentations en deux phases dans lesquelles la phase de croissance est induite par la lumière bleue et la phase de production par l’obscurité (Figure 2A)5,7.
L’utilisation de la lumière au lieu de l’obscurité pour induire l’expression des gènes pendant la phase de production élargirait considérablement les capacités des contrôles optogénétiques, mais nécessiterait également de surmonter les limites de pénétration de la lumière des densités cellulaires élevées généralement rencontrées dans cette phase de fermentation. À cette fin, nous avons développé des circuits, connus sous le nom d’OptoAMP et OptoQ-AMP, qui amplifient la réponse transcriptionnelle à la stimulation par la lumière bleue. Ces circuits utilisent des mutants de type sauvage ou hypersensibles de VP16-EL222 pour contrôler la production des activateurs transcriptionnels Gal4p ou QF2 des régulons GAL ou Q, respectivement, obtenant une sensibilité accrue et une expression génique plus forte avec la lumière12,13 (Figure 1C). Les circuits OptoAMP peuvent obtenir une induction lumineuse complète et homogène dans des bioréacteurs de 5 L à une densité optique (mesurée à 600 nm; OD600) valeurs d’au moins 40 avec seulement ~ 0,35% d’éclairage (dose de lumière de 5% sur seulement ~ 7% de la surface en vrac). Cela démontre un degré de sensibilité plus élevé par rapport à OptoEXP, qui nécessite un éclairage proche de 100 %12. La capacité d’induire efficacement l’expression des gènes avec de la lumière à des densités cellulaires élevées ouvre de nouvelles possibilités de contrôle dynamique des fermentations. Cela inclut l’exploitation de fermentations dans plus de deux phases temporelles, telles que les fermentations triphasées, dans lesquelles les phases de croissance, d’induction et de production sont établies avec des calendriers d’éclairage uniques pour optimiser la production chimique (Figure 2B)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg"> Figure 1 : Circuits optogénétiques pour le contrôle dynamique de S. cerevisiae. Les circuits OptoEXP, OptoINVRT et OptoAMP sont basés sur le système sensible à la lumière VP16-EL222. (A) Dans le circuit OptoEXP, l’exposition à la lumière bleue provoque un changement conformationnel et une dimérisation de VP16-EL222, ce qui expose un domaine de liaison à l’ADN et permet la transcription à partir de PC120. La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.7. (B) Les circuits OptoINVRT exploitent les régulons GAL (illustrés) ou Q pour induire une expression dans l’obscurité. Dans les circuits à base de GAL, VP16-EL222 et GAL4 sont exprimés de manière constitutive, tandis que le PC120 entraîne l’expression du répresseur GAL80 (dans les circuits à base de Q, GAL4 et GAL80 sont remplacés par QF2 et QS, respectivement, et un promoteur synthétique contenant DU QUAS est utilisé à la place d’un promoteur GAL). À la lumière, Gal80p empêche l’activation du gène d’intérêt de PGAL1. Dans l’obscurité, GAL80 n’est pas exprimé et se dégrade rapidement en le fusionnant en un domaine degron constitutif (petit domaine brun), ce qui permet l’activation de PGAL1 par Gal4p. La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.5. (C) Les circuits OptoAMP utilisent également VP16-EL222 pour contrôler les régulons GAL (illustrés) ou Q. Dans ces circuits, le répresseur GAL80 (ou QS) est exprimé de manière constitutive et fusionné à un degron photosensible (petit domaine bleu) assurant une répression stricte dans l’obscurité. PC120 et un mutant hypersensible VP16-EL222 contrôlent l’expression de GAL4 (ou QF2) avec la lumière, ce qui active fortement PGAL1 (ou un promoteur contenant QUAS) dans la lumière. Les circuits dérivés de GAL peuvent utiliser des formes techniques de PGAL1, telles que PGAL1-M ou PGAL1-S, qui ont une activité accrue, ainsi que des promoteurs de type sauvage contrôlés par le régulateur GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg"> Figure 2: Fermentations biphasées et triphasées dans le temps. (A) Les fermentations biphasées opérées avec des circuits inversés se composent d’une phase de croissance entraînée par la lumière et d’une phase de production sombre. Dans la phase de croissance, la biomasse s’accumule à mesure que la voie de production reste réprimée. Lorsqu’elles atteignent l’OD600 souhaitée, les cellules sont déplacées vers l’obscurité pour s’ajuster métaboliquement avant d’être remises en suspension dans des milieux frais pour la phase de production. (B) Dans un processus en trois phases, les phases de croissance, d’incubation et de production sont définies par des horaires lumineux uniques, qui peuvent consister en une période de croissance sombre, une incubation pulsée et une phase de production entièrement éclairée. Figure créée avec Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Des circuits optogénétiques ont également été développés pour le contrôle dynamique de la production chimique et protéique chez E. coli. Les circuits OptoLAC contrôlent le répresseur LacI bactérien à l’aide du circuit pDawn sensible à la lumière, basé sur le système à deux composants YF1/FixJ6 (Figure 3). Semblables à OptoINVRT5, les circuits OptoLAC sont conçus pour réprimer l’expression des gènes dans la lumière et l’induire dans l’obscurité. Les niveaux d’expression utilisant les circuits OptoLAC peuvent égaler ou dépasser ceux atteints avec l’induction standard de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), maintenant ainsi la force de l’induction chimique tout en offrant une accordabilité et une réversibilité améliorées6. Par conséquent, les circuits OptoLAC permettent un contrôle optogénétique efficace pour l’ingénierie métabolique chez E. coli.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg"> Figure 3 : Circuits OptoLAC pour le contrôle dynamique d’E. coli. Les circuits OptoLAC adaptent le système pDawn et l’opéron lac pour réaliser l’activation dans l’obscurité et la répression dans la lumière. Dans l’obscurité, YF1 phosphoryle FixJ, qui active ensuite le promoteur PFixK2 pour exprimer le répresseur cI. Le répresseur cI empêche l’expression du répresseur lacI à partir du promoteur PR, ce qui permet la transcription du gène d’intérêt à partir d’un promoteur contenant du lacO. Inversement, la lumière bleue réduit l’activité de la kinase nette YF1, inversant la phosphorylation fixJ et donc l’expression cI, ce qui déprime l’expression de lacI et empêche l’expression du promoteur contenant du lacO. La figure a été modifiée à partir de Lalwani et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Nous décrivons ici les protocoles de base pour les fermentations contrôlées par la lumière de S. cerevisiae et E. coli pour la production chimique ou protéique. Pour les levures et les bactéries, nous nous concentrons d’abord sur les fermentations avec une phase de croissance entraînée par la lumière et une phase de production induite par l’obscurité rendue possible par les circuits OptoINVRT et OptoLAC. Par la suite, nous décrivons un protocole pour une fermentation triphasée (croissance, induction, production) contrôlée par la lumière rendue possible par les circuits OptoAMP. En outre, nous décrivons comment étendre les fermentations contrôlées optogénétiquement des microplaques aux bioréacteurs à l’échelle du laboratoire. Avec ce protocole, nous visons à fournir un guide complet et facilement reproductible pour effectuer des fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques ou de protéines.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light-controlled chemical production using S. cerevisiae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>303991049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>501879892 (G8270-5KG)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica-plating device</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37848-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica-plating pads</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>3005-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC-His powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1303-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC Complete powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile sealing film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>STR-SEAL-PLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100217-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-controlled protein production using E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Cepham Life Sciences</td>
			<td>10502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide protein gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0341BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>SX0425-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoLAC plasmids</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-phase fermentation using S. cerevisiae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Same materials as &#34;Light-controlled chemical production using S. cerevisiae&#34; protocol plus the following:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical production in a light-controlled bioreactor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor with control station</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B120110001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89501-620 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPT tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>501879892 (G8270-5KG)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1374401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0503-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC Complete powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-controlled fermentations for microbial chemical and protein production

Les usines de cellules microbiennes offrent une alternative durable pour la production de produits chimiques et de protéines recombinantes à partir de matières premières renouvelables. Cependant, surcharger un micro-organisme avec des modifications génétiques peut réduire la condition physique et la productivité de l’hôte. Ce problème peut être surmonté en utilisant un contrôle dynamique: expression inductible des enzymes et des voies, généralement à l’aide d’additifs chimiques ou nutritifs, pour équilibrer la croissance et la production cellulaires. L’optogénétique offre une méthode non invasive, hautement accordable et réversible de régulation dynamique de l’expression des gènes. Ici, nous décrivons comment mettre en place des fermentations contrôlées par la lumière d’Escherichia coli et de Saccharomyces cerevisiae pour la production de produits chimiques ou de protéines recombinantes. Nous discutons de la façon d’appliquer la lumière à des moments et des dosages sélectionnés pour découpler la croissance et la production microbiennes afin d’améliorer le contrôle de la fermentation et la productivité, ainsi que des principales considérations d’optimisation pour de meilleurs résultats. De plus, nous décrivons comment mettre en œuvre des contrôles de lumière pour des expériences de bioréacteur à l’échelle du laboratoire. Ces protocoles facilitent l’adoption de contrôles optogénétiques dans les micro-organismes modifiés pour améliorer les performances de fermentation.

La régulation optogénétique du métabolisme microbien a été mise en œuvre avec succès pour produire une variété de produits, y compris des biocarburants, des produits chimiques en vrac, des protéines et des produits naturels5,6,7,12,13. La plupart de ces processus sont conçus pour que la croissance cellulaire se produise dans la lumière (lorsque la...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production at JoVE.com

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Le contrôle optogénétique du métabolisme microbien offre un contrôle dynamique flexible des processus de fermentation. Le protocole montre ici comment mettre en place des fermentations régulées par la lumière bleue pour la production de produits chimiques et de protéines à différentes échelles volumétriques.

Fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques microbiens et de protéines

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

L’optogénétique a été utilisée pour obtenir des titres plus élevés de plusieurs produits chimiques et protéines par rapport aux inducteurs typiques. En utilisant ce protocole, d’autres peuvent améliorer leurs propres processus avec un contrôle basé sur la lumière. Le contrôle optogénétique est non invasif, hautement réglable et réversible.Ces qualités permettent une optimisation rationalisée des processus microbiens et ouvrent même des opportunités uniques, comme les fermentations triphasées et le contrôle multichromatique. Pour tout nouveau produit chimique, les conditions d’éclairage optimales seront différentes. Donc, si une faible production est observée en utilisant les paramètres de ce protocole, différentes conditions d’éclairage doivent être testées.Commencez par obtenir une souche de Saccharomyces cerevisiae avec l’oxytrophie HIS3, un marqueur nécessaire aux plasmides OptoINVRT. Si vous cherchez à contrôler un gène natif de Saccharomyces cerevisiae, assurez-vous que la copie endogène du gène est supprimée avant de continuer. Pour commencer la construction de la souche, linéariser le plasmide contenant le circuit OptoINVRT7, tel que EZL439.Si vous utilisez EZL439, qui contient les composants pour réprimer le PIGA un promoteur à la lumière et l’activer dans l’obscurité, linéariser sur le site de restriction Pme1. En utilisant des méthodes standard de transformation de l’acétate de lithium, intégrez le plasmide dans une souche auxotrophique HIS3. Après la transformation, centrifugez les cellules à 150 G pendant une minute.Ressuspendez doucement les cellules dans 200 microlitres de milieu SC-HIS frais. Plaquez tout le volume cellulaire sur une plaque de gélose SC-HIS et incubez à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours jusqu’à l’apparition de colonies. Préparer des cellules compétentes à l’aide de protocoles standard de transformation de l’acétate de lithium.Transformez les cellules avec le plasmide contenant les gènes que vous souhaitez contrôler optogénétiquement en aval des promoteurs PIGA1M ou PIGA1S. Après la transformation, centrifuger la culture à 150 G pendant une minute et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de milieu de chute SC frais. Plaquer tout le volume cellulaire sur une plaque de gélose peptone dextrose extraite de levure, si elle s’intègre dans des sites Delta ou une plaque de décrochage SC si elle se transforme avec un plasmide contenant un marqueur de sélection.Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant 16 heures sous une lumière bleue constante pour maintenir le gène contrôlé optogénétiquement réprimé. Utilisez n’importe quelle source lumineuse de longueur d’onde de 465 nanomètres et placez un panneau LED à environ 40 centimètres au-dessus de la plaque de sorte que l’intensité lumineuse soit d’environ 80 à 110 micromoles par mètre carré et par seconde. Mesurez l’intensité à l’aide d’un compteur quantique.En cas d’intégration dans des sites Delta, répliquez la plaque sur des plaques d’extrait de peptone dextrose contenant une plage de concentrations de Zeocin comprise entre 400 microgrammes par millilitre et 1 200 microgrammes par millilitre pour sélectionner une variété de numéros de copie d’intégration. Incuber les plaques de réplique à 30 degrés Celsius sous une lumière bleue constante ou pulsée pendant deux à trois jours jusqu’à l’apparition des colonies. Pour effectuer le dépistage préliminaire, sélectionnez huit colonies de chaque plaque et utilisez-les pour inoculer un millilitre de milieu SC-HIS complété par 2% de glucose dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits.Cultivez les cellules pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tours par minute sous un éclairage constant de lumière bleue. Le lendemain, diluer chaque culture dans un milieu SC-HIS frais avec 2% de glucose pour obtenir les valeurs de densité optique allant de 0,01 à 0,3 à 600 nanomètres et faire croître les cultures à l’état d’agitation de 200 tours par minute sous une lumière constante ou pulsée à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique atteigne entre deux et neuf. Ensuite, enveloppez les plaques avec du papier d’aluminium, éteignez le panneau lumineux et incubez les plaques dans l’obscurité pendant quatre heures à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute.Centrifuger les cultures dans la plaque de 24 puits à 234 G pendant cinq minutes et remettre en suspension les cellules dans un millilitre de milieu de chute complet synthétique frais avec 2% de glucose. Scellez les plaques pour éviter l’évaporation du produit souhaité à l’aide d’un ruban d’étanchéité stérile à microplaques. Fermenter les plaques scellées dans l’obscurité pendant 48 heures à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tours par minute.Pour récolter les fermentations, centrifugez les plaques pendant cinq minutes à 234 G et transférez 800 microlitres du surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Selon le produit chimique d’intérêt, analysez en utilisant la chromatographie liquide à haute performance, la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse ou une autre méthode analytique utilisant la technique de préparation de l’échantillon la mieux adaptée à l’instrument utilisé. Sélectionnez huit colonies dans chaque plaque et utilisez-les pour inoculer un millilitre de milieu SC-HIS avec 2% de glucose dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits.Cultivez les cellules pendant la nuit dans l’obscurité à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute de secousse. Le lendemain matin, diluer chaque culture dans un milieu SC-HIS frais avec 2% de glucose à 0,1 densité optique. Enveloppez les plaques dans du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière et cultivez la culture dans l’obscurité à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute d’agitation jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de trois.Ensuite, incubez les plaques sous une lumière pulsée pendant 12 heures à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute en secouant. Centrifuger les cultures à 234 G pendant cinq minutes et remettre en suspension dans un milieu SC-HIS frais avec 2% de glucose. Scellez les plaques pour éviter l’évaporation du produit souhaité à l’aide d’un ruban d’étanchéité stérile à microplaques.Fermenter les plaques scellées à la lumière pendant 48 heures à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tours par minute. Après avoir effectué des fermentations optogénétiques, la production chimique a été testée à une gamme de densités cellulaires au moment de l’induction avec deux circuits. Le circuit OptoINVRT7 a démontré des titres élevés d’acide lactique et d’isobutanol avec une densité cellulaire optimale de valeur d’induction de 7,0 et 8,75 par rapport aux circuits OptoINVRT1 et 2.Les fermentations utilisant les circuits OptoAMP ont été étudiées en trois phases définies par différents cycles de légèreté. La production d’acide lactique peut être optimisée à l’aide d’une phase de croissance pulsée et de phases d’induction et de production entièrement éclairées. La production d’isobutanol a été optimisée en utilisant une phase de croissance pulsée, une phase d’induction entièrement éclairée et une phase de production pulsée.Alors que la biosynthèse de la naringénine a été mieux optimisée en utilisant une induction de croissance pulsée entièrement éclairée et une phase de production sombre. Le système OptoLAC a été utilisé chez E.Coli pour produire un facteur de transcription FDER à des titres comparables ou supérieurs à ceux obtenus en utilisant l’induction chimique avec IPDG. Des circuits OptoLAC ont été appliqués pour produire du mévalonate et la production dépasse les titres obtenus par induction IPDG.La production de mévalonate au niveau du bioréacteur démontre l’évolutivité et l’accordabilité de la régulation optogénétique pour la production de produits chimiques et de protéines dans les bactéries au-delà des niveaux de microplaques. Il est important de s’assurer que l’intensité lumineuse est dans la plage appropriée pour les marches éclairées et que la contamination lumineuse est évitée pour les étapes qui nécessitent de l’obscurité. Cette technique a ouvert la voie à l’obtention de titres records d’isobutanol dans la levure, stabilisé les populations de consortiums avec la lumière et même contrôler le flux métabolique à l’aide d’organites synthétiques contrôlés par la lumière.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Recherche

Bio-ingénierie

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthèse d&#39;une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignine régulation à la baisse de<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi et Klason lignine analyse

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

La production et le ciblage des monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Production de protéine élastine Hydrogels pour Encapsulation et immunomarquage des cellules en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...