Name: light-controlled fermentations for microbial chemical and protein production
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, dall'Office of Science, dall'Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, dal NSF CAREER Award CBET-1751840, dal Pew Charitable Trusts e dal Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

1. Produzione chimica controllata dalla luce utilizzando il circuito S. cerevisiae OptoINVRT7
<ol><li>Costruzione della deformazione<ol>
<li>Ottenere un ceppo con l'auxotrofia his3 , poiché questo marcatore è necessario per la maggior parte dei plasmidi OptoINVRT esistenti5. Se cerchi la regolazione optogenetica di un gene nativo di S. cerevisiae, costruisci un ceppo in cui qualsiasi copia endogena del gene viene eliminata.</li>
		<li>Linearizzare i...

<ol>
	<li>Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+shine+of+yeast+optogenetics.">The rise and shine of yeast optogenetics.</a> Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).</li><li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction:+Dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments.">The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).</li><li>Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. 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Il controllo dinamico è stato a lungo applicato per migliorare le rese per l'ingegneria metabolica e la produzione di proteine ricombinanti4. I cambiamenti nell'espressione enzimatica sono più tipicamente implementati utilizzando induttori chimici come IPTG21, galattosio22 e tetraciclina23, ma sono stati anche mediati utilizzando condizioni di processo come temperatura e pH. Il controllo optogenetico dell'espressione genica ...

L'optogenetica, il controllo dei processi biologici con proteine sensibili alla luce, offre una nuova strategia per controllare dinamicamente le fermentazioni microbiche per la produzione chimica e proteica1,2. L'onere delle vie metaboliche ingegnerizzate e la tossicità di alcuni intermedi e prodotti spesso compromettono la crescita cellulare3. Tali sollecitazioni possono portare a uno scarso accumulo di biomassa e a una ridotta produttività3. Questa sfida può essere affrontata dividendo temporalmente le fermentazioni in una fase di crescita e produzione, che dedicano risorse metaboliche rispettivamente all'accumulo di biomassa o alla sintesi del prodotto4. Recentemente abbiamo dimostrato che il passaggio dalla crescita alla produzione in questa fermentazione bifase può essere indotto con cambiamenti nelle condizioni di illuminazione5,6,7. L'elevata sintonizzazione, reversibilità e ortogonalità degli ingressi luminosi8 offre vantaggi unici alle fermentazioni controllate dalla luce che sono difficili o impossibili da replicare con induttori chimici utilizzati nel controllo dinamico delle fermentazioni bifase convenzionali4,9,10,11.
La proteina EL222 sensibile alla luce blu derivata da Erythrobacter litoralis è stata utilizzata per sviluppare diversi circuiti optogenetici per l'ingegneria metabolica in Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 contiene un dominio LOV (Light-Oxygen-Voltage Sensor) che subisce uno spostamento conformazionale all'attivazione della luce blu (465 nm), che gli consente di legarsi alla sua sequenza di DNA affine (C120)13. La fusione di EL222 con il dominio di attivazione virale VP16 (VP16-EL222) si traduce in un fattore di trascrizione sensibile alla luce blu che può attivare in modo reversibile l'espressione genica in S. cerevisiae7 e altri organismi14 dal promotore sintetico PC120. Diversi circuiti basati su EL222 sono stati sviluppati e utilizzati per la produzione chimica in S. cerevisiae, come il sistema optoEXP di base attivato dalla luce7, in cui il gene di interesse è espresso direttamente da PC120 (Figura 1A). Tuttavia, le preoccupazioni di penetrazione della luce alle alte densità cellulari tipicamente incontrate nella fase di produzione delle fermentazioni ci hanno motivato a sviluppare circuiti invertiti indotti al buio, come i circuiti OptoINVRT e OptoQ-INVRT (Figura 1B)5,7,13. Questi sistemi sfruttano i regolaloni di galattosio (GAL) o acido chinico (Q) di S. cerevisiae e N. crassa, rispettivamente, controllando i loro corrispondenti repressori (GAL80 e QS) con VP16-EL222, per reprimere l'espressione genica alla luce e indurla fortemente al buio. La combinazione dei circuiti OptoEXP e OptoINVRT si traduce in un controllo bidirezionale dell'espressione genica, consentendo fermentazioni bifase in cui la fase di crescita è indotta con luce blu e la fase di produzione con oscurità (Figura 2A)5,7.
L'uso della luce al posto dell'oscurità per indurre l'espressione genica durante la fase di produzione espanderebbe notevolmente le capacità dei controlli optogenetici, ma richiederebbe anche il superamento dei limiti di penetrazione della luce delle alte densità cellulari tipicamente incontrate in questa fase di fermentazione. A tal fine, abbiamo sviluppato circuiti, noti come OptoAMP e OptoQ-AMP, che amplificano la risposta trascrizionale alla stimolazione della luce blu. Questi circuiti utilizzano mutanti wild-type o ipersensibili di VP16-EL222 per controllare la produzione degli attivatori trascrizionali Gal4p o QF2 dei reguloni GAL o Q, rispettivamente, ottenendo una maggiore sensibilità e una maggiore espressione genica con la luce12,13 (Figura 1C). I circuiti OptoAMP possono ottenere un'induzione luminosa completa e omogenea in bioreattori da 5 L a densità ottica (misurata a 600 nm; OD600) valori di almeno 40 con solo ~0,35% di illuminazione (5% di dose di luce solo su ~7% della superficie di massa). Ciò dimostra un grado di sensibilità più elevato rispetto a OptoEXP, che richiede un'illuminazione vicina al 100%12. La capacità di indurre efficacemente l'espressione genica con la luce ad alte densità cellulari apre nuove opportunità per il controllo dinamico delle fermentazioni. Ciò include fermentazioni operative in più di due fasi temporali, come le fermentazioni trifase, in cui le fasi di crescita, induzione e produzione sono stabilite con programmi leggeri unici per ottimizzare la produzione chimica (Figura 2B)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg"> Figura 1: Circuiti optogenetici per il controllo dinamico di S. cerevisiae. I circuiti OptoEXP, OptoINVRT e OptoAMP si basano sul sistema VP16-EL222 sensibile alla luce. (A) Nel circuito OptoEXP, l'esposizione alla luce blu provoca un cambiamento conformazionale e la dimerizzazione di VP16-EL222, che espone un dominio legante il DNA e consente la trascrizione da PC120. La figura è stata modificata da Zhao et al.7. (B) I circuiti OptoINVRT sfruttano i regolagni GAL (mostrati) o Q per indurre l'espressione al buio. Nei circuiti basati su GAL, VP16-EL222 e GAL4 sono espressi costitutivamente, mentre PC120 guida l'espressione del repressore GAL80 (nei circuiti basati su Q, GAL4 e GAL80 sono sostituiti rispettivamente da QF2 e QS e viene utilizzato un promotore sintetico contenente QUAS al posto di un promotore GAL). Alla luce, Gal80p impedisce l'attivazione del gene di interesse da PGAL1. Al buio, GAL80 non è espresso e rapidamente degradato fondendolo in un dominio costitutivo di degron (piccolo dominio marrone), che consente l'attivazione di PGAL1 da parte di Gal4p. La figura è stata modificata da Zhao et al.5. (C) I circuiti OptoAMP utilizzano anche VP16-EL222 per controllare i reguloni GAL (mostrato) o Q. In questi circuiti, il repressore GAL80 (o QS) è costitutivamente espresso e fuso in un degron fotosensibile (piccolo dominio blu) che garantisce una stretta repressione al buio. PC120 e un'espressione di controllo mutante ipersensibile VP16-EL222 di GAL4 (o QF2) con la luce, che attiva fortemente PGAL1 (o un promotore contenente QUAS) nella luce. I circuiti derivati da GAL possono utilizzare forme ingegnerizzate di PGAL1, come PGAL1-M o PGAL1-S, che hanno aumentato l'attività, così come promotori wild-type controllati dal regulon GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). La figura è stata modificata da Zhao et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg"> Figura 2: Fermentazioni a due e tre fasi nel tempo. (A) Le fermentazioni bifase operate con circuiti invertiti consistono in una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione scura. Nella fase di crescita, la biomassa si accumula mentre il percorso di produzione rimane represso. Al raggiungimento dell'OD600 desiderato, le cellule vengono spostate al buio per regolarsi metabolicamente prima di essere risospese in mezzi freschi per la fase di produzione. (B) In un processo in tre fasi, le fasi di crescita, incubazione e produzione sono definite da programmi di luce unici, che possono consistere in un periodo di crescita scuro, incubazione pulsata e fase di produzione completamente illuminata. Figura creata con Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Sono stati inoltre sviluppati circuiti optogenetici per il controllo dinamico della produzione chimica e proteica in E. coli. I circuiti OptoLAC controllano il repressore batterico LacI utilizzando il circuito pDawn sensibile alla luce, basato sul sistema bicomponente YF1/FixJ6 (Figura 3). Simile a OptoINVRT5, i circuiti OptoLAC sono progettati per reprimere l'espressione genica nella luce e indurla al buio. I livelli di espressione che utilizzano circuiti OptoLAC possono eguagliare o superare quelli raggiunti con l'induzione standard isopropil β-d-1-tiogalattopoliranoside (IPTG), mantenendo così la forza dell'induzione chimica offrendo al contempo una maggiore sintonizzazione e reversibilità6. Pertanto, i circuiti OptoLAC consentono un efficace controllo optogenetico per l'ingegneria metabolica in E. coli.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg"> Figura 3: Circuiti OptoLAC per il controllo dinamico di E. coli. I circuiti OptoLAC adattano il sistema pDawn e l'operone lac per ottenere l'attivazione al buio e la repressione alla luce. Al buio, YF1 fosforila FixJ, che quindi attiva il promotore PFixK2 per esprimere il repressore cI . Il repressore cI impedisce l'espressione del repressore lacI dal promotore PR , che consente la trascrizione del gene di interesse da un promotore contenente lacO. Al contrario, la luce blu riduce l'attività della chinasi netta YF1, invertendo la fosforilazione di FixJ e quindi l'espressione di cI , che dereprime l'espressione di lacI e impedisce l'espressione dal promotore contenente lacO. La figura è stata modificata da Lalwani et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Descriviamo qui i protocolli di base per le fermentazioni controllate dalla luce di S. cerevisiae ed E. coli per la produzione chimica o proteica. Sia per i lieviti che per i batteri, ci concentriamo innanzitutto sulle fermentazioni con una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione indotta dall'oscurità abilitata dai circuiti OptoINVRT e OptoLAC. Successivamente, descriviamo un protocollo per una fermentazione a tre fasi (crescita, induzione, produzione) controllata dalla luce abilitata dai circuiti OptoAMP. Inoltre, descriviamo come aumentare le fermentazioni optogeneticamente controllate dalle micropiastre ai bioreattori su scala di laboratorio. Con questo protocollo, miriamo a fornire una guida completa e facilmente riproducibile per eseguire fermentazioni controllate dalla luce per la produzione chimica o proteica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light-controlled chemical production using S. cerevisiae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>303991049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>501879892 (G8270-5KG)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica-plating device</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37848-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica-plating pads</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>3005-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC-His powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1303-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC Complete powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile sealing film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>STR-SEAL-PLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100217-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R25005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-controlled protein production using E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Cepham Life Sciences</td>
			<td>10502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide protein gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0341BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>SX0425-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoLAC plasmids</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-phase fermentation using S. cerevisiae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Same materials as &#34;Light-controlled chemical production using S. cerevisiae&#34; protocol plus the following:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Reference 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical production in a light-controlled bioreactor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>B004NG90YO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor with control station</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B120110001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer with &#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89501-620 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED panel</td>
			<td>HQRP</td>
			<td>884667106091218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPT tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>501879892 (G8270-5KG)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Salts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1374401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0503-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Yamato Scientific America</td>
			<td>SOU-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC Complete powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-controlled fermentations for microbial chemical and protein production

Le fabbriche di cellule microbiche offrono un'alternativa sostenibile per la produzione di sostanze chimiche e proteine ricombinanti da materie prime rinnovabili. Tuttavia, sovraccaricare un microrganismo con modificazioni genetiche può ridurre la forma fisica e la produttività dell'ospite. Questo problema può essere superato utilizzando il controllo dinamico: espressione inducibile di enzimi e percorsi, in genere utilizzando additivi chimici o nutrizionali, per bilanciare la crescita e la produzione cellulare. L'optogenetica offre un metodo non invasivo, altamente sintonizzabile e reversibile per regolare dinamicamente l'espressione genica. Qui, descriviamo come impostare fermentazioni controllate dalla luce di Escherichia coli ingegnerizzato e Saccharomyces cerevisiae per la produzione di sostanze chimiche o proteine ricombinanti. Discutiamo di come applicare la luce in momenti e dosaggi selezionati per disaccoppiare la crescita e la produzione microbica per migliorare il controllo e la produttività della fermentazione, nonché le considerazioni chiave di ottimizzazione per i migliori risultati. Inoltre, descriviamo come implementare i controlli della luce per esperimenti di bioreattori su scala di laboratorio. Questi protocolli facilitano l'adozione di controlli optogenetici in microrganismi ingegnerizzati per migliorare le prestazioni di fermentazione.

La regolazione optogenetica del metabolismo microbico è stata implementata con successo per produrre una varietà di prodotti, tra cui biocarburanti, sostanze chimiche sfuse, proteine e prodotti naturali5,6,7,12,13. La maggior parte di questi processi sono progettati per la crescita cellulare che avviene alla luce (quando la bassa densità cellulare pone sfid...

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Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

L'optogenetica è stata utilizzata per ottenere titoli più elevati di diverse sostanze chimiche e proteine rispetto agli induttori tipici. Utilizzando questo protocollo, altri possono migliorare i propri processi con il controllo basato sulla luce. Il controllo optogenetico è non invasivo, altamente sintonizzabile e reversibile.Queste qualità consentono un'ottimizzazione semplificata dei processi microbici e aprono anche opportunità uniche, come le fermentazioni trifase e il controllo multicromatico. Per qualsiasi nuova sostanza chimica, le condizioni di luce ottimali saranno diverse. Quindi, se si osserva una bassa produzione utilizzando i parametri di questo protocollo, è necessario testare diverse condizioni di luce.Inizia ottenendo un ceppo di Saccharomyces cerevisiae con l'ossitrofia HIS3, un marcatore necessario per i plasmidi OptoINVRT. Se si cerca di controllare un gene nativo di Saccharomyces cerevisiae, assicurarsi che la copia endogena del gene venga eliminata prima di procedere. Per iniziare la costruzione della deformazione, linearizzare il plasmide contenente il circuito OptoINVRT7, come EZL439.Se si utilizza EZL439, che contiene i componenti per reprimere il PIGA un promotore alla luce e attivarlo al buio, linearizzare nel sito di restrizione Pme1. Utilizzando metodi standard di trasformazione dell'acetato di litio, integrare il plasmide in un ceppo auxotrofico HIS3. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule a 150 G per un minuto.Risospenare delicatamente le cellule in 200 microlitri di mezzo SC-HIS fresco. Placcare l'intero volume cellulare su una piastra di agar SC-HIS e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni fino alla comparsa delle colonie. Preparare celle competenti utilizzando protocolli standard di trasformazione dell'acetato di litio.Trasforma le cellule con il plasmide contenente i geni che desideri controllare optogeneticamente a valle dei promotori PIGA1M o PIGA1S. Dopo la trasformazione, centrifugare la coltura a 150 G per un minuto e risospescere delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo drop-out SC fresco. Placcare l'intero volume cellulare su una piastra di agar peptone destrosio estratto di lievito, se integrata in siti Delta o una piastra drop-out SC se trasformata con un plasmide contenente un marcatore di selezione.Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 16 ore sotto luce blu costante per mantenere il gene optogeneticamente controllato represso. Utilizzare qualsiasi sorgente luminosa della lunghezza d'onda di 465 nanometri e posizionare un pannello LED a circa 40 centimetri sopra la piastra in modo tale che l'intensità della luce sia di circa 80-110 micromoli per metro quadrato al secondo. Misurare l'intensità utilizzando un misuratore quantistico.Se si integra nei siti Delta, replicare la piastra su piastre di destrosio peptone estratto di lievito contenenti un intervallo di concentrazioni di Zeocin tra 400 microgrammi per millilitro e 1.200 microgrammi per millilitro per selezionare una varietà di numeri di copia di integrazione. Incubare le piastre replica a 30 gradi Celsius sotto luce blu costante o pulsata per due o tre giorni fino a quando non compaiono le colonie. Per eseguire lo screening preliminare, selezionare otto colonie da ciascuna piastra e utilizzarle per inoculare un millilitro di mezzo SC-HIS integrato con glucosio al 2% in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.Far crescere le cellule durante la notte a 30 gradi Celsius scuotendo a 200 giri al minuto sotto un'illuminazione costante a luce blu. Il giorno successivo, diluire ogni coltura in un mezzo SC-HIS fresco con glucosio al 2% per ottenere i valori di densità ottica che vanno da 0,01 a 0,3 a 600 nanometri e far crescere le colture in condizioni di agitazione 200 giri al minuto sotto luce costante o pulsata a 30 gradi Celsius fino a quando la densità ottica raggiunge tra due e nove. Quindi, avvolgere le piastre con un foglio di alluminio, spegnere il pannello luminoso e incubare le piastre al buio per quattro ore a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto.Centrifugare le colture nella piastra a 24 pozzetti a 234 G per cinque minuti e risospese le cellule in un millilitro di mezzo di drop-out completo sintetico fresco con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante sterile a micropiastre. Fermentare le piastre sigillate al buio per 48 ore a 30 gradi Celsius scuotendo a 200 giri al minuto.Per raccogliere le fermentazioni, centrifugare le piastre per cinque minuti a 234 G e trasferire 800 microlitri del surnatante in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. A seconda della sostanza chimica di interesse, analizzare utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni, spettrometria di massa per gascromatografia o un altro metodo analitico utilizzando la tecnica di preparazione del campione più adatta allo strumento utilizzato. Selezionare otto colonie da ogni piastra e usarle per inoculare un millilitro di mezzo SC-HIS con il 2% di glucosio nei singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.Far crescere le cellule durante la notte al buio a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto scuotendo. La mattina successiva, diluire ogni coltura in un mezzo SC-HIS fresco con una densità ottica dal 2% di glucosio a 0,1. Avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce e far crescere la coltura al buio a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto scuotendo fino a raggiungere una densità ottica di tre.Quindi, incubare le piastre sotto luce pulsata per 12 ore a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto scuotendo. Centrifugare le colture a 234 G per cinque minuti e risospenderle in mezzo fresco SC-HIS con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante sterile a micropiastre.Fermentare le piastre sigillate alla luce per 48 ore a 30 gradi Celsius scuotendo a 200 giri al minuto. Dopo aver eseguito fermentazioni optogenetiche, la produzione chimica è stata testata in una gamma di densità cellulari al momento dell'induzione con due circuiti. Il circuito OptoINVRT7 ha dimostrato alti titoli di acido lattico e isobutanolo con una densità cellulare ottimale del valore di induzione di 7,0 e 8,75 rispetto ai circuiti OptoINVRT1 e 2.Le fermentazioni utilizzando i circuiti OptoAMP sono state studiate in tre fasi definite da diversi cicli di lavoro leggeri. La produzione di acido lattico può essere ottimizzata utilizzando una fase di crescita pulsata e fasi di induzione e produzione completamente illuminate. La produzione di isobutanolo è stata ottimizzata utilizzando una fase di crescita pulsata, una fase di induzione completamente illuminata e una fase di produzione pulsata.Mentre la biosintesi della naringenina è stata ottimizzata al meglio utilizzando un'induzione a crescita pulsata completamente illuminata e una fase di produzione scura. Il sistema OptoLAC è stato utilizzato in E.Coli per produrre il fattore di trascrizione FDER a titoli paragonabili o superiori a quelli ottenuti utilizzando l'induzione chimica con IPDG. I circuiti OptoLAC sono stati applicati per produrre mevalonato e la produzione supera i titoli ottenuti utilizzando l'induzione IPDG.La produzione di mevalonato a livello di bioreattore dimostra la scalabilità e la sintonizzazione della regolazione optogenetica per la produzione chimica e proteica nei batteri oltre i livelli di micropiastre. È importante assicurarsi che l'intensità della luce sia nell'intervallo corretto per i gradini illuminati e che la contaminazione della luce sia evitata per i passaggi che richiedono l'oscurità. Questa tecnica ha spianato la strada per ottenere titoli record di isobutanolo nel lievito, stabilizzare le popolazioni di consorzi con la luce e persino controllare il flusso metabolico usando organelli controllati dalla luce sintetica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Ricerca

Bioingegneria

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

La lignina down-regulation dei<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason lignina analisi

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

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Un bioreattore Novel per l&#39;alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Produzione di Nanoparticelle proteiche auto-assemblanti E. coliper vaccini che richiedono la presentazione dell'epitoscopio trimerico

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...