Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

يشكر المؤلفون Technology Commons ، كلية علوم الحياة ، جامعة تايوان الوطنية على الاستخدام المريح لجهاز الطرد المركزي الفائق. تم إهداء سلالات البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC 6803 و Leptolyngbya sp. JSC-1 من الدكتور تشو ، Hsiu-An في Academia Sinica ، تايوان ، والدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، على التوالي. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (تايوان) (109-2636-B-002-013- و 110-2628-B-002-065-) ووزارة التعليم (تايوان) برنامج يوشان للباحثين الشباب (109V1102 و 110V1102).

تم الحصول على Synechocystis sp. PCC 6803 ، السلالة النموذجية التي تتحمل الجلوكوز ، من الدكتور تشو ، Hsiu-An في Academia Sinica ، تايوان. تم الحصول على Leptolyngbya sp. JSC-1 ، خيطي غير نموذجي ، من الدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
1. زراعة الخلايا وال...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+from+blue-green+and+red+algae:+Isolation+criteria+and+dissociation+characteristics.">Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics.</a> Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).</li><li>Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat.">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li><li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins.">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li><li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka,+Gujarat,+India.">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li><li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).</li><li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits.">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata.">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).</li><li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقياسية لعزل PBS سليم في نوعين من البكتيريا الزرقاء، النموذج أحادي الخلية Syn6803، والخيطي غير النموذجي JSC-1. الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي تجانس الخلايا والطرد المركزي الفائق على تدرج الكثافة المتقطعة للسكروز. بشكل عام ، يكون اضطراب الخلايا الخيطية أكثر تعقيدا ...

Phycobilisome (PBS) هو مركب ضخم من البروتين الصباغي القابل للذوبان في الماء يرتبط بالجانب السيتوبلازمي من الأنظمة الضوئية في أغشية الثايلاكويد من البكتيريا الزرقاء1. يتكون PBS في المقام الأول من البروتينات الفيزيائية الملونة وبروتينات الروابط عديمة اللون1,2. يمكن تقسيم البروتينات الفيكوبيلية إلى أربع مجموعات رئيسية: فيكويريثرين ، فيكويريثروسيانين ، فيكوسيانين ، وألوفيكوسيانين 3. وتمتص المجموعات الأربع الرئيسية أطوال موجية مختلفة من الطاقة الضوئية في حدود 490-650 نانومتر، والتي يمتصها الكلوروفيل بشكل غير فعال3. يمكن أن يكون PBS بمثابة هوائي حصاد الضوء لجمع الطاقة الضوئية وتوصيلها إلى Photosystem II و I4.
يختلف هيكل وتكوين PBS من نوع إلى آخر. بشكل جماعي ، تم تحديد ثلاثة أشكال من الفيكوبيليسوم (hemidiscodial ، على شكل حزمة ، وعلى شكل قضيب) في أنواع مختلفة من البكتيريا الزرقاء5. حتى في نفس النوع ، يتغير تكوين PBS استجابة للبيئة ، مثل جودة الضوء واستنزاف المغذيات6،7،8،9،10،11. لذلك ، كان الإجراء التجريبي لعزل PBS من البكتيريا الزرقاء مفيدا في دراسة PBS12. على مدى عدة عقود ، عزلت العديد من البروتوكولات المختلفة PBS وحللت هيكلها وتكوينها ووظيفتها6،7،8،12،13،14،15،16،17. توفر المجموعة الواسعة من طرق عزل PBS بالفعل المرونة في عزل المجمع في الأنواع المختلفة باستخدام كواشف وأدوات مختلفة. ومع ذلك ، فإنه يجعل أيضا اختيار بروتوكول مناسب أكثر صعوبة للعلماء غير المألوفين مع البكتيريا الزرقاء و PBS. لذلك ، تم تطوير بروتوكول معمم ومباشر في هذا العمل للراغبين في بدء عزل PBS عن البكتيريا الزرقاء.
يتم تلخيص طرق عزل PBS عن المنشورات السابقة هنا. نظرا لأن PBS عبارة عن مركب بروتيني قابل للذوبان في الماء ويتم فصله بسهولة ، فإن هناك حاجة إلى مخزن فوسفات أيوني عالي القوة لتحقيق الاستقرار في PBS أثناء الاستخراج18. تم نشر العديد من المقالات البحثية التي تصف طرق عزل PBS عن البكتيريا الزرقاء في الماضي. تتطلب معظم الطرق تركيزا عاليا من المخزن المؤقت للفوسفات8،14،15،18،19. ومع ذلك ، تختلف إجراءات التعطيل الميكانيكي للخلايا ، مثل الاستخراج بمساعدة الخرز الزجاجي ، صوتنة 20 ، والصحافة الفرنسية 6،8،14. يمكن الحصول على بروتينات فيكوبيلي مختلفة عن طريق هطول الأمطار مع كبريتات الأمونيوم20 وتنقيتها بواسطة HPLC21 أو عمود كروماتوغرافي22. من ناحية أخرى ، يمكن عزل PBS السليم بسهولة عن طريق الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز6،8،15.
في هذا البروتوكول ، تم استخدام نموذج واحد من البكتيريا الزرقاء وواحد من البكتيريا الزرقاء غير النموذجية كمواد لعزل PBS. وهي نموذج أحادي الخلية يتحمل الجلوكوز Synechocystis sp. PCC 6803 (المشار إليه فيما يلي باسم Syn6803) و Leptolyngbya sp. JSC-1 الخيطي غير النموذجي (المشار إليه فيما يلي باسم JSC-1) ، على التوالي 7,23,24. يبدأ البروتوكول بتعطيل البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية والخيطية في مخزن مؤقت للفوسفات عالي القوة الأيونية. بعد التحلل ، يتم جمع المواد الفائقة عن طريق الطرد المركزي ثم معالجتها بمنظف غير أيوني (Triton X-100) لإذابة البروتينات القابلة للذوبان في الماء من أغشية thylakoid. يتم تطبيق إجمالي البروتينات القابلة للذوبان في الماء على تدرج كثافة السكروز المتقطع لتجزئة PBS. يتكون تدرج السكروز المتقطع في هذا البروتوكول من أربعة محاليل سكروز ويقسم PBS السليم في أدنى أجزاء طبقة السكروز25. يمكن تحليل سلامة PBS بواسطة SDS-PAGE ، وتلطيخ الزنك ، والتحليل الطيفي الفلوري 77K 6,7,8,26. هذه الطريقة مناسبة للعلماء الذين يهدفون إلى عزل PBS السليم من البكتيريا الزرقاء ودراسة خصائصه الطيفية والهيكلية والتركيبية.
هناك العديد من المزايا لهذا البروتوكول. (1) هذه الطريقة موحدة ويمكن استخدامها لعزل PBS السليم عن كل من البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية والخيطية. تصف معظم المقالات الطريقة التي تم تطبيقها في أي نوع واحد من البكتيريا الزرقاء4,7,8,12,13,14,16,18. (2) يتم تنفيذ هذه الطريقة في درجة حرارة الغرفة ، حيث ينفصل PBS عند درجة حرارة منخفضة19,27. (3) تصف هذه الطريقة استخدام مضرب الخرز لتعطيل الخلايا. لذلك ، فهي أرخص وأكثر أمانا من الصحافة الفرنسية عالية الضغط وتلف السمع المحتمل من الصوت بطرق أخرى8،13،14،20. (4) هذه الطريقة تعزل PBS سليمة عن طريق الطرد المركزي الفائق التدرج السكروز. وبهذه الطريقة ، يمكن فصل PBS السليم بأحجام مختلفة و PBS المنفصل جزئيا بناء على تركيز السكروز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

في البكتيريا الزرقاء ، الفيكوبيليسوم هو مركب بروتين هوائي حيوي يحصد الضوء وينقل الطاقة إلى النظام الضوئي الأول والثاني للكيمياء الضوئية. دراسة بنية وتكوين الفيكوبيليسوم هي ذات أهمية كبيرة للعلماء لأنها تكشف عن تطور واختلاف التمثيل الضوئي في البكتيريا الزرقاء. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفصلة ومحسنة لكسر خلايا البكتيريا الزرقاء بتكلفة منخفضة بواسطة مضرب الخرز بكفاءة. يمكن بعد ذلك عزل الفيكوبيليسوم السليم من مستخلص الخلية عن طريق الطرد المركزي الفائق لتدرج السكروز. وقد أثبتت هذه الطريقة أنها مناسبة لكل من البكتيريا الزرقاء النموذجية وغير النموذجية مع أنواع الخلايا المختلفة. كما يتم توفير إجراء خطوة بخطوة لتأكيد سلامة وخصائص البروتينات الفيزيائية بواسطة التحليل الطيفي الفلوري 77K و SDS-PAGE الملطخ بكبريتات الزنك و Coomassie Blue. يمكن أيضا إخضاع الفيكوبيليسوم المعزول لمزيد من التحليلات الهيكلية والتركيبية. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول دليل بداية مفيد يسمح للباحثين غير المطلعين على البكتيريا الزرقاء بعزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم بسرعة.

تمت زراعة خلايا Syn6803 و JSC-1 في قوارير مخروطية مع تحريك مستمر في وسط B-HEPES عند 30 درجة مئوية ، تحت ضوء أبيض LED (فوتونات 50 ميكرومول m-2s-1) في غرفة نمو مليئة ب 1٪ (v / v) CO2. في مرحلة النمو الأسي (OD750 = ~ 0.5) ، تم زرع الخلايا في وسط جديد مع كثافة بصرية نهائية OD750 = ~ 0.2. بعد الوصول إلى م...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

يفصل البروتوكول الحالي عزل الفيكوبيليزومات من البكتيريا الزرقاء عن طريق الطرد المركزي من خلال تدرج كثافة السكروز المتقطع. يتم تأكيد أجزاء من الفيكوبيليسومات السليمة من خلال طيف انبعاثات الفلورسنت 77K وتحليل SDS-PAGE. الكسور الفيزيائية الناتجة مناسبة للتلطيخ السلبي ل TEM وتحليل الطيف الكتلي.

عزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم في البكتيريا الزرقاء

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

إنه بروتوكول بسيط وسريع يسمح للأشخاص الذين ليسوا على دراية بالبكتيريا الزرقاء بعزل الفيكوبيليسوم بسهولة. ميزة هذه التقنية هي أنها تتكيف مع نطاق صغير ومن السهل تنفيذها. إنها طريقة بسيطة وموثوقة وفعالة لعزل الفيكوبيليزومات السليمة للبكتيريا الخلوية النموذجية وغير النموذجية.ابدأ بنقل ثقافة الخلية البالغة 0.8 OD عند 750 نانومتر إلى قارورة لتر واحد وقم بتخفيفها في 500 ملليلتر من وسط B-HEPES لتحقيق OD البالغ 0.2 عند 750 نانومتر. قم بزراعة الثقافة مع التحريك المستمر عند 30 درجة مئوية حتى يصل OD إلى 0.8 إلى 1 ، مما يشير إلى مرحلة نمو أسية متأخرة. جهاز الطرد المركزي للثقافة بسرعة 10،000 مرة غرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.تعليق الكريات الخلوية وغسلها مرتين مع 0.75 مولار فوسفات البوتاسيوم العازلة، ودرجة الحموضة سبعة. بيليه الخلايا في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر عن طريق التركيز في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا باستخدام 0.75 وحدة تخزين مؤقتة لفوسفات البوتاسيوم المولي.قم بقياس الوزن الرطب للحبيبة بواسطة ميزان إلكتروني وأعد تعليق الوزن الرطب للجرام الواحد للحبيبة في خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت. أضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية و 0.4 إلى 0.6 جرام من الخرز الزجاجي 0.1 ملليمتر في قارورة غطاء لولبية بمقدار مليلترين. كسر الخلايا لمدة 30 ثانية بواسطة مضرب حبة.اترك الأنابيب لتبرد في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد التحلل ، قم بطرد القوارير لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة بسرعة 500 مرة جم. جمع supernatant مع ماصة في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.اغسل الخرز ب 0.5 ملليلتر من 0.75 مولي من فوسفات البوتاسيوم العازل مرة واحدة ، ثم نقلها إلى نفس أنبوب الطرد المركزي. أضف Triton X-100 إلى نظام تعليق الخلايا المحللة واحتضنه على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة و 40 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة أو حتى يصبح المحلول متجانسا. قم بطرد الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 17،210 مرات غرام وتخزين supernatant بدون طبقة الميسيل Triton العليا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ساعة واحدة.اصنع أربعة تركيزات من السكروز في 0.75 مولي من فوسفات البوتاسيوم العازل عند درجة الحموضة السابعة. ضع 2.8 ملليلتر من اثنين من عازلة السكروز المولية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 40 ملليلتر وتراكب مع ثلاث طبقات من محاليل السكروز. أخيرا ، أضف ثلاثة ملليلترات من PBS تحتوي على الكسر الفائق وطرد التدرجات الناتجة.عند التمركز الفائق ، قم بتكثيف PBS المجزأة والبروتينات الفيزيائية بين الطبقات ولاحظ النطاقات الزرقاء في Syn6803 والواجهات. قم بإزالة السكروز عن طريق التركيز المتكرر وتخفيف الكسور باستخدام 0.75 مولي من فوسفات البوتاسيوم العازل وغشاء وحدات مرشح الطرد المركزي. لقياس التألق PBS ، قم بتخفيف عينة PBS المركزة باستخدام 0.75 مخزن مؤقت لفوسفات البوتاسيوم المولي لتكوين حجم يصل إلى 500 ميكرولتر.أضف عينة PBS المخففة إلى أنبوب زجاجي شفاف وقم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل حتى يتم تجميده بالكامل. حرك الأنبوب المجمد إلى حاوية ديوار شفافة مملوءة مسبقا بالنيتروجين السائل. يظهر التحلل الكامل للخلايا اللون الأزرق والأخضر الداكن قبل التركيز.يظهر الفصل المتدرج لكثافة السكروز ل PBS المعزول عدة أجزاء من البروتينات الفيزيائية المنفصلة ويمثل الكسر الأدنى PBS السليم. أطياف الامتصاص من PBS المنفصلة والسليمة ل JSC one و Syn6803 لها نفس الذروة عند 622 نانومتر ، المقابلة للفيكوسيانين. علاوة على ذلك ، يبلغ امتصاص الفيكوريثرين ذروته عند 571 نانومتر في كل من PBS المنفصلة والسليمة من JSC-1.أطياف الانبعاثات من PBS المنفصلة لها ذروة قوية واحدة عند حوالي 650 نانومتر في Syn6803 و JSC-1 ، مما يمثل الانبعاثات من الفيكوسيانين. تكشف القمم القصوى للانبعاثات الفلورية عند 651 نانومتر و 684 نانومتر أن الطاقة التي يتم حصادها بواسطة الفيكوسيانين تم نقلها بكفاءة إلى الباعثات الالوفيكوسيانين والبواعث الطرفية ، وهي ApcD و ApcE ، في القلب. يوضح الشكل SDS-PAGE الملطخ بالزنك تحت الأشعة فوق البنفسجية حيث تكون الوحدات الفرعية للبروتين الفيزيائي متألقة بقوة وأظهر ApcE تألقا ضعيفا ، يشار إليه بالسهم.يظهر تلطيخ كوماسي الأزرق أن الكسور العليا تحتوي على بروتينات أخرى غير PBS قابلة للذوبان في الماء وأن PBS و Syn6803 سليمين يظهران نطاقا بارزا من ApcE ، يشار إليه بسهم ، يفتقر إلى كسور PBS المنفصلة. يوضح الطرد المركزي الفائق أن تدرج السكروز المحضر بنسبة 1:3 يعرض نطاقات أوسع من التدرج الذي تم إجراؤه بنسبة 1:10. من المهم تحلل الخلايا وتحلل المذيبات تماما للحصول على المزيد من الفيكوبيليزومات.يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل cryo-EM أو قياس الطيف المختلط ، لدراسة بنية البروتين أو تكوين البروتين من phycobilisomes.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...