Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Forfatterne takker Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University for bekvem brug af ultracentrifugen. De cyanobakterielle stammer Synechocystis sp. PCC 6803 og Leptolyngbya sp. JSC-1 blev begavet fra Dr. Chu, Hsiu-An på den akademiske verden Sinica, Taiwan, og Dr. Donald A. Bryant på Pennsylvania State University, USA, henholdsvis. Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for Videnskab og Teknologi (Taiwan) (109-2636-B-002-013- og 110-2628-B-002-065-) og Undervisningsministeriet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 og 110V1102).

Synechocystis sp. PCC 6803, modellen glukosetolerant stamme, blev fremstillet af Dr. Chu, Hsiu-An på Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, den ikke-model filamentous,blev opnået fra Dr. Donald A. Bryant på Pennsylvania State University, USA.
1. Cellekultur og høst
<ol><li>Pod syn6803- eller JSC-1-celler ved hjælp af en metallisk podningsløkke i en 100 mL konisk kolbe indeholdende 50 mL B-HEPES medium28. Opdel cellern...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+from+blue-green+and+red+algae:+Isolation+criteria+and+dissociation+characteristics.">Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics.</a> Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).</li><li>Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat.">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li><li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins.">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li><li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka,+Gujarat,+India.">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li><li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).</li><li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits.">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata.">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).</li><li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Denne protokol beskriver en enkel og standardmetode til isolering af intakt PBS i to typer cyanobakterier, encellet model Syn6803 og filamentøs ikke-model JSC-1. De kritiske trin i protokollen er celle homogenisering og ultracentrifugering på en diskontinuerlig tæthed gradient af saccharose. Generelt er afbrydelsen af filamentøse celler mere kompliceret end encellede celler. Forøgelse af mængden af udgangsmaterialet (den våde vægt af cellepillen) og gentagelsen af perle-slå var nyttigt at øge udbyttet af PBS fr...

Phycobilisome (PBS) er et enormt vandopløseligt pigmentproteinkompleks, der fastgøres til den cytoplasmatiske side af fotosystemerne i thylakoidmembranerne i cyanobakterier1. PBS består primært af farvede phycobiliproteiner og farveløse linkerproteiner1,2. De phycobiliproteiner kan opdeles i fire store grupper: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, og allophycocyanin3. De fire store grupper absorberer forskellige bølgelængder af lysenergi i intervallet 490-650 nm, som klorofyl absorberes ineffektivt3. PBS kan fungere som en lyshøstantenne til opsamling af lysenergi og levering til Photosystem II og I4.
Strukturen og sammensætningen af PBS varierer fra art til art. Samlet set er tre former for phycobilisome (hemidiscodial, bundtformet og stangformet) blevet identificeret i forskellige cyanobakterielle arter5. Selv i de samme arter ændres sammensætningen af PBS som reaktion på miljøet, såsom lyskvalitet og næringsstofudtømning6,7,8,9,10,11. Derfor har forsøgsproceduren for at isolere PBS fra cyanobakterier været medvirkende til at studere PBS12. I løbet af flere årtier har mange forskellige protokoller isoleret PBS og analyseret dets struktur, sammensætning og funktion6,7,8,12,13,14,15,16,17. De mange forskellige metoder til PBS-isolering giver faktisk fleksibilitet til at isolere komplekset hos forskellige arter med forskellige reagenser og instrumenter. Det gør dog også det vanskeligere at vælge en passende protokol for forskere, der ikke er bekendt med cyanobakterier og PBS. Derfor er en generaliseret og ligetil protokol udviklet i dette arbejde for dem, der er interesseret i at starte PBS isolation fra cyanobakterier.
Metoderne til isolering af PBS fra tidligere publikationer er sammenfattet her. Da PBS er et vandopløseligt proteinkompleks og let adskilles, kræves der en høj ionisk styrkephosphatbuffer for at stabilisere PBS under ekstraktion18. Flere forskningsartikler, der beskriver metoder til isolering af PBS fra cyanobakterium, er tidligere blevet offentliggjort. De fleste af metoderne kræver en høj koncentration af fosfatbuffer8,14,15,18,19. Men procedurerne for mekanisk forstyrrelse af cellerne varierer, såsom glasperler-assisteret ekstraktion, sonikering20, og fransk presse6,8,14. Forskellige phycobiliproteiner kan fås ved nedbør med ammoniumsulfat20 og renses af HPLC21 eller en kromatografisk kolonne22. På den anden side kan intakt PBS let isoleres ved saccharosetæthedsgradient ultracentrifugering6,8,15.
I denne protokol blev et model cyanobacterium og et ikke-model cyanobacterium brugt som materialer til PBS-isolering. De er model encellede glukose-tolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (herefter Syn6803) og ikke-model filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (herefter JSC-1), henholdsvis7,23,24. Protokollen begynder med afbrydelse af den encellede og filamentøse cyanobakterier i en høj-ionisk styrke fosfat buffer. Efter lysis opsamles supernatanterne ved centrifugering og behandles derefter med et ikkeionisk vaskemiddel (Triton X-100) for at opløse de vandopløselige proteiner fra thylakoidmembranerne. De samlede vandopløselige proteiner påføres en diskontinurosetæthedsgradient for at fraktionere PBS. Den diskontinuerlige saccharosegradient i denne protokol består af fire saccharoseopløsninger og opdeler den intakte PBS i de laveste fraktioner saccharoselag25. PBS' integritet kan analyseres af SDS-PAGE, zinkfarvning og 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denne metode er velegnet til forskere, der har til formål at isolere intakt PBS fra cyanobakterier og studere dens spektrale, strukturelle og kompositoriske egenskaber.
Der er flere fordele ved denne protokol. (1) Denne metode er standardiseret og kan anvendes til isolering af intakt PBS fra både encellet og filamentøs cyanobakterier. De fleste af artiklerne beskriver den metode, der anvendes i enten én type cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denne metode udføres ved stuetemperatur, da PBS tager afstand ved lav temperatur19,27. (3) Denne metode beskriver brugen af en perle-tæppebanker til at forstyrre cellerne; derfor er det billigere og sikrere end højtrykt fransk presse og mulig høreskade fra soniker i andre metoder8,13,14,20. (4) Denne metode isolerer intakt PBS ved saccharosegradient ultracentrifugering. På denne måde kan intakt PBS med forskellige størrelser og delvist dissocierede PBS adskilles baseret på saccharosekoncentration.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

I cyanobakterier er phycobilisome et vitalt antenneproteinkompleks, der høster lys og overfører energi til fotosystem I og II til fotokemi. At studere strukturen og sammensætningen af fycobilisome er af stor interesse for forskere, fordi det afslører udviklingen og divergensen af fotosyntese i cyanobakterier. Denne protokol giver en detaljeret og optimeret metode til at bryde cyanobakterielle celler til lave omkostninger med en perle-tæppebanker effektivt. Den intakte phycobilisome kan derefter isoleres fra celleekstraktet ved saccharose gradient ultracentrifugering. Denne metode har vist, at den er egnet til både model og ikke-model cyanobakterier med forskellige celletyper. En trin-for-trin procedure er også fastsat for at bekræfte integriteten og egenskaben af phycobiliproteiner ved 77K fluorescens spektroskopi og SDS-PAGE plettet af zink sulfat og Coomassie Blue. Det isolerede fycobilisome kan også underkastes yderligere strukturelle og kompositoriske analyser. Samlet set giver denne protokol en nyttig startvejledning, der giver forskere, der ikke er bekendt med cyanobakterier, mulighed for hurtigt at isolere og karakterisere intakt fycobilisome.

Syn6803- og JSC-1-cellerne blev dyrket i koniske kolber med konstant omrøring i B-HEPES medium ved 30 °C under et LED hvidt lys (50 μmol fotoner m-2s-1) i et vækstkammer fyldt med 1% (v/v) CO2. I den eksponentielle vækstfase (OD750 = ~ 0,5) blev cellerne subkulturerede i frisk medium med en endelig optisk tæthed OD750 = ~ 0,2. Efter at have nået den sene eksponentielle vækstfase (OD750 = 0,6-0,8) blev kulturerne indsamlet og centrifugeret (10.000 x...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Den nuværende protokol beskriver isoleringen af fykobiliomer fra cyanobakterier ved centrifugering gennem en diskontinuerlig saccharosetæthedsgradient. Fraktioner af intakte phycobilisomes bekræftes af 77K fluorescerende emissionsspektrum og SDS-PAGE analyse. De resulterende fykobilisome fraktioner er velegnede til negativ farvning af TEM og massespektrometri analyse.

Isolering og karakterisering af intakt Phycobilisome i cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Det er en enkel og en hurtig protokol, der giver folk, der ikke er bekendt med cyanobakterier, mulighed for at isolere fycobilisome på lethed. Fordelen ved denne teknik er, at den er tilpasset en lille skala, og det er let at udføre. Det er en enkel, pålidelig og effektiv metode til isolering intakte phycobilisomes af model og ikke-model cynobacteria.Begynd med at overføre cellekulturen på 0,8 OD ved 750 nanometer til en en liter kolbe og fortynd den i 500 milliliter B-HEPES medium til en opnå OD på 0,2 ved 750 nanometer. Dyrk kulturen med konstant omrøring ved 30 grader Celsius, indtil OD når 0,8 til 1, hvilket indikerer en sen eksponentiel vækstfase. Centrifugere kulturen med en hastighed på 10.000 gange g i 20 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.Ophæng cellepillerne og vaskes to gange med 0,75 molar kaliumphosphatbuffer, pH syv. Pellet cellerne i en 50 milliliter centrifuge rør ved centrification ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og genbrug cellerne med 0,75 molar kaliumphosphat buffer.Mål pelletens våde vægt med en elektronisk balance og genbrug pelletens vådvægt på et gram i fem milliliter af bufferen. Tilsæt en milliliter celleaffjedring og 0,4 til 0,6 gram 0,1 millimeter glasperler i et to milliliter skruehætteglas. Bryd cellerne i 30 sekunder med en perle tæppebanker.Lad rørene køle af i et vandbad med stuetemperatur i to minutter. Efter lysis centrifugerer hætteglassene i 10 sekunder ved stuetemperatur med en hastighed på 500 gange g. Saml supernatanten med en pipette i et 15 milliliter centrifugerør.Vask perlerne med 0,5 milliliter på 0,75 molar kaliumphosphat buffer én gang, derefter overført til det samme centrifugerør. Tilsæt Triton X-100 til den lysede celleaffjedring og inkuber på en gynge shaker ved stuetemperatur og 40 RPM i 20 minutter, eller indtil opløsningen bliver homogen. Centrifuge rørene i 20 minutter ved 17, 210 gange g og opbevar supernatanten uden det øverste Triton micellelag ved stuetemperatur i op til en time.Lav fire koncentrationer af saccharose i 0,75 molar kaliumphosphat buffer ved pH syv. Placer 2,8 milliliter af to molar saccharosebuffer i bunden af 40 millilitercentrifugerøret og overlejr med tre lag saccharoseopløsninger. Endelig tilsættes tre milliliter PBS, der indeholder supernatantfraktionen og centrifugerer de resulterende gradienter.Ved ultracentrificering kondenseres de fraktionerede PBS og phycobiliproteiner mellem lagene og observerer de blå bånd i Syn6803 og grænseflader. Saccharose fjernes ved gentagne gange at koncentrere og fortynde fraktioner med 0,75 molar kaliumphosphat buffer og membrane centrifugalfilterenhederne. Til måling af PBS fluorescens fortyndes den koncentrerede PBS-prøve med 0,75 molar kaliumphosphatbuffer for at udgøre op til 500 mikroliters volumen.Tilsæt den fortyndede PBS-prøve til et gennemsigtigt glasrør og frys røret i flydende nitrogen, indtil det er helt frosset. Flyt det frosne rør til en gennemsigtig dewar container fyldt med flydende nitrogen. Komplet celle lysis viser supernatant og mørkeblå-grøn farve før centrification.Saccharosetæthedsgradientens adskillelse af isolerede PBS viser flere fraktioner af dissocierede phycobiliproteiner, og den laveste fraktion repræsenterer den intakte PBS. Absorptionsspektre fra den dissocierede og intakte PBS af JSC one og Syn6803 har samme top ved 622 nanometer, svarende til fysiocyanin. Desuden topper phycoerythrinabsorptionen ved 571 nanometer i både dissocierede og intakte PBS af JSC-1.Emissionsspektret for den dissocierede PBS har en stærk top på ca. 650 nanometer i Syn6803 og JSC-1, der repræsenterer emissionen fra fysiocyanin. De fluorescerende emissionsmaksimum toppe på 651 nanometer og 684 nanometer afslører, at den energi, der høstes af phycocyanin blev overført effektivt til allophycocyanin og terminal udledere, som er ApcD og ApcE, i kernen. Figuren viser zink plettet SDS-PAGE under UV bestråling, hvor phycobiliprotein subenheder er stærkt fluorescerende og ApcE viste svag fluorescens, angivet med pilen.Kumasi blå farvning viser, at de øverste fraktioner indeholder andre ikke-PBS vandopløselige proteiner og intakt PBS og Syn6803 viser en fremtrædende ApcE band, angivet med en pil, mangler i de dissociated PBS fraktioner. Ultracentrifugering viser, at saccharosegradienten, der er forberedt i et forhold på 1:3, viser bredere bånd end gradienten, der er lavet i et forhold på 1:10. Det er vigtigt at lysis cellerne og solvolyse supernatanterne helt for at opnå flere fykobiliomer.Andre metoder, som kryo-EM eller blandet spektrometri, kan bruges til at studere proteinstrukturen eller proteinsammensætningen af fykobiliomer.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolering og karakterisering af RNA-Varer Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolation, Kultur og funktionel karakterisering af Voksen Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection af nitrogenoxid og Superoxide i Endotel Layer af intakte arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolering og karakterisering af mikrovesikler fra perifert blod

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolering af intakt, hele musen mælkekirtlerne for analyse af ekstracellulære Matrix udtryk og morfologi, kirtel

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering af DNA jordpakning i cyanobakterier af høj spænding Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Isolering af intakt øjeæblet for at opnå integreret okulær overflade væv til histologisk undersøgelse og immun histokemi

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolation og karakterisering af voksne hjertefibroblaster og Myofibroblaster

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering af exosomer fra skeletmuskelfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolering og karakterisering af musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...