Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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Les auteurs remercient Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University pour l’utilisation pratique de l’ultracentrifugeuse. Les souches cyanobactériennes Synechocystis sp. PCC 6803 et Leptolyngbya sp. JSC-1 ont été offertes par le Dr Chu, Hsiu-An à l’Academia Sinica, Taiwan, et le Dr Donald A. Bryant à la Pennsylvania State University, USA, respectivement. Ce travail a été financé par le ministère de la Science et de la Technologie (Taïwan) (109-2636-B-002-013- et 110-2628-B-002-065-) et le ministère de l’Éducation (Taïwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 et 110V1102).

La Synechocystis sp. PCC 6803, la souche modèle tolérante au glucose, a été obtenue auprès du Dr Chu, Hsiu-An à l’Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, le filamenteux non modèle, a été obtenu auprès du Dr Donald A. Bryant à la Pennsylvania State University, aux États-Unis.
1. Culture cellulaire et récolte
<ol><li>Inoculez des cellules Syn6803 ou JSC-1 à l’aide d’une boucle d’inoculation métallique dans une fiole conique de ...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode simple et standard pour isoler le PBS intact dans deux types de cyanobactéries, le modèle unicellulaire Syn6803 et le non-modèle filamenteux JSC-1. Les étapes critiques du protocole sont l’homogénéisation cellulaire et l’ultracentrifugation sur un gradient de densité discontinu de saccharose. Généralement, la perturbation des cellules filamenteuses est plus compliquée que les cellules unicellulaires. L’augmentation de la quantité de matière première (le poids humide de...

Le phycobilisome (PBS) est un énorme complexe pigment-protéine soluble dans l’eau qui se fixe au côté cytoplasmique des photosystèmes dans les membranes thylakoïdes des cyanobactéries1. Le PBS est principalement composé de phycobiliprotéines colorées et de protéines linker incolores1,2. Les phycobiliprotéines peuvent être divisées en quatre grands groupes : la phycoérythrine, la phycoérythricyanine, la phycocyanine et l’allophycocyanine3. Les quatre grands groupes absorbent différentes longueurs d’onde d’énergie lumineuse dans la gamme de 490 à 650 nm, que les chlorophylles absorbent de manière inefficace3. Le PBS peut servir d’antenne de collecte de lumière pour collecter l’énergie lumineuse et la fournir aux photosystèmes II et I4.
La structure et la composition du PBS varient d’une espèce à l’autre. Collectivement, trois formes de phycobilisomes (hémidiscodiales, en forme de faisceau et en forme de bâtonnet) ont été identifiées chez différentes espèces de cyanobactéries5. Même chez la même espèce, la composition du PBS change en fonction de l’environnement, comme la qualité de la lumière et l’épuisement des nutriments6,7,8,9,10,11. Par conséquent, la procédure expérimentale visant à isoler le PBS des cyanobactéries a joué un rôle déterminant dans l’étude du PBS12. Pendant plusieurs décennies, de nombreux protocoles différents ont isolé le PBS et analysé sa structure, sa composition et sa fonction6,7,8,12,13,14,15,16,17. La grande variété de méthodes d’isolement pbs offre en effet une flexibilité dans l’isolation du complexe chez différentes espèces avec différents réactifs et instruments. Cependant, cela rend également le choix d’un protocole approprié plus difficile pour les scientifiques peu familiers avec les cyanobactéries et le PBS. Par conséquent, un protocole généralisé et simple est développé dans ce travail pour ceux qui s’intéressent à commencer l’isolement PBS des cyanobactéries.
Les méthodes d’isolement du PBS des publications précédentes sont résumées ici. Étant donné que le PBS est un complexe protéique soluble dans l’eau et qu’il est facilement dissocié, un tampon phosphate à haute résistance ionique est nécessaire pour stabiliser le PBS pendant l’extraction18. Plusieurs articles de recherche décrivant des méthodes d’isolement du PBS à partir de cyanobactéries ont été publiés dans le passé. La plupart des méthodes nécessitent une forte concentration de tampon phosphate8,14,15,18,19. Cependant, les procédures de perturbation mécanique des cellules varient, telles que l’extraction assistée par billes de verre, la sonication20 et la presse Français 6,8,14. Différentes phycobiliprotéines peuvent être obtenues par précipitation avec du sulfate d’ammonium20 et purifiées par CLHP21 ou une colonne chromatographique22. D’autre part, le PBS intact peut être facilement isolé par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose6,8,15.
Dans ce protocole, une cyanobactérie modèle et une cyanobactérie non modèle ont été utilisées comme matériaux pour l’isolation PBS. Il s’agit de Synechocystis sp. PCC 6803 (ci-après Syn6803) et de Leptolyngbya sp. JSC-1 filamenteux non modèle, tolérant au glucose, et de Leptolyngbya sp. JSC-1 (ci-après JSC-1), respectivement7,23,24. Le protocole commence par la perturbation des cyanobactéries unicellulaires et filamenteuses dans un tampon phosphate à haute résistance ionique. Après lyse, les surnageants sont collectés par centrifugation puis traités avec un détergent non ionique (Triton X-100) pour solubiliser les protéines hydrosolubles des membranes thylakoïdes. Les protéines totales solubles dans l’eau sont appliquées sur un gradient de densité de saccharose discontinu pour fractionner le PBS. Le gradient de saccharose discontinu dans ce protocole se compose de quatre solutions de saccharose et divise le PBS intact dans les fractions les plus faibles de la couche de saccharose25. L’intégrité du PBS peut être analysée par SDS-PAGE, coloration au zinc et spectroscopie de fluorescence 77K6,7,8,26. Cette méthode convient aux scientifiques qui visent à isoler le PBS intact des cyanobactéries et à étudier ses propriétés spectrales, structurelles et compositionnelles.
Il y a plusieurs avantages de ce protocole. (1) Cette méthode est normalisée et peut être utilisée pour isoler le PBS intact des cyanobactéries unicellulaires et filamenteuses. La plupart des articles décrivent la méthode qui s’appliquait à l’un ou l’autre type de cyanobactéries4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Cette méthode est réalisée à température ambiante, car le PBS se dissocie à basse température19,27. (3) Cette méthode décrit l’utilisation d’un batteur de perles pour perturber les cellules; par conséquent, il est moins cher et plus sûr que la presse à Français à haute pression et les dommages auditifs possibles du sonicator dans d’autres méthodes8,13,14,20. (4) Cette méthode isole le PBS intact par ultracentrifugation par gradient de saccharose. De cette façon, le PBS intact avec différentes tailles et le PBS partiellement dissocié peuvent être séparés en fonction de la concentration en saccharose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

Chez les cyanobactéries, le phycobilisome est un complexe protéique d’antenne vital qui récolte la lumière et transfère de l’énergie aux photosystèmes I et II pour la photochimie. L’étude de la structure et de la composition du phycobilisome est d’un grand intérêt pour les scientifiques car elle révèle l’évolution et la divergence de la photosynthèse chez les cyanobactéries. Ce protocole fournit une méthode détaillée et optimisée pour casser efficacement les cellules cyanobactériennes par un batteur de perles. Le phycobilisome intact peut ensuite être isolé de l’extrait cellulaire par ultracentrifugation par gradient de saccharose. Cette méthode s’est avérée adaptée aux cyanobactéries modèles et non modèles avec différents types de cellules. Une procédure étape par étape est également fournie pour confirmer l’intégrité et la propriété des phycobiliprotéines par spectroscopie de fluorescence 77K et SDS-PAGE coloré par sulfate de zinc et bleu de Coomassie. Le phycobilisome isolé peut également être soumis à d’autres analyses structurelles et compositionnelles. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un guide de départ utile qui permet aux chercheurs qui ne connaissent pas les cyanobactéries d’isoler et de caractériser rapidement les phycobilisomes intacts.

Les cellules Syn6803 et JSC-1 ont été cultivées dans des flacons coniques avec agitation constante en milieu B-HEPES à 30 °C, sous une lumière blanche LED (photons m-2s-1 de 50 μmol) dans une chambre de croissance remplie de 1% (v/v) de CO2. À la phase de croissance exponentielle (OD750 = ~0,5), les cellules ont été sous-cultivées en milieu frais avec une densité optique finale OD750 = ~0,2. Après avoir atteint la phase de croissance exponentielle tardiv...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Le protocole actuel détaille l’isolement des phycobilisomes des cyanobactéries par centrifugation à travers un gradient de densité de saccharose discontinu. Les fractions de phycobilisomes intacts sont confirmées par le spectre d’émission fluorescent 77K et l’analyse SDS-PAGE. Les fractions phycobilisomes résultantes conviennent à la coloration négative de la TEM et à l’analyse par spectrométrie de masse.

Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

C’est un protocole simple et rapide qui permet aux personnes peu familières avec les cyanobactéries d’isoler facilement le phycobilisome. L’avantage de cette technique est qu’elle est adaptée à une petite échelle et qu’elle est facile à réaliser. Il s’agit d’une méthode simple, fiable et efficace pour isoler les phycobilisomes intacts des cynobactéries modèles et non modèles.Commencez par transférer la culture cellulaire de 0,8 OD à 750 nanomètres dans une fiole d’un litre et diluez-la dans 500 millilitres de milieu B-HEPES pour obtenir la DO de 0,2 à 750 nanomètres. Cultivez la culture en remuant constamment à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la DO atteigne 0,8 à 1, indiquant une phase de croissance exponentielle tardive. Centrifuger la culture à une vitesse de 10 000 fois g pendant 20 minutes à température ambiante et jeter le surnageant.Suspendez les granulés cellulaires et lavez-les deux fois avec un tampon de phosphate de potassium molaire de 0,75, pH sept. Granulés les cellules dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres par centrification à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec un tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire.Mesurez le poids humide de la pastille à l’aide d’une balance électronique et remettez en suspension le gramme de poids humide de la pastille dans cinq millilitres du tampon. Ajouter un millilitre de suspension cellulaire et 0,4 à 0,6 gramme de billes de verre de 0,1 millimètre dans un flacon à bouchon à vis de deux millilitres. Cassez les cellules pendant 30 secondes à l’aide d’un batteur de perles.Laissez les tubes refroidir dans un bain-marie à température ambiante pendant deux minutes. Après lyse, centrifuger les flacons pendant 10 secondes à température ambiante à une vitesse de 500 fois g. Recueillir le surnageant avec une pipette dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Lavez les billes avec 0,5 millilitre de tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire une fois, puis transférez-les dans le même tube de centrifugeuse. Ajouter triton X-100 à la suspension à cellules lysées et incuber sur un agitateur à bascule à température ambiante et à 40 tr/ min pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Centrifugez les tubes pendant 20 minutes à 17, 210 fois g et stockez le surnageant sans la couche supérieure de micelle Triton à température ambiante jusqu’à une heure.Faire quatre concentrations de saccharose dans un tampon de phosphate de potassium molaire de 0,75 à pH sept. Placer 2,8 millilitres de tampon de saccharose à deux molaires au fond du tube de centrifugeuse de 40 millilitres et superposer avec trois couches de solutions de saccharose. Enfin, ajoutez trois millilitres de PBS contenant la fraction surnageante et centrifugez les gradients résultants.Lors de l’ultracentrification, condenser les PBS et les phycobiliprotéines fractionnées entre les couches et observer les bandes bleues dans Syn6803 et les interfaces. Éliminer le saccharose en concentrant et en diluant à plusieurs reprises les fractions avec un tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire et en membrasant les unités de filtration centrifuges. Pour mesurer la fluorescence PBS, diluez l’échantillon concentré de PBS avec un tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire pour obtenir jusqu’à 500 microlitres de volume.Ajouter l’échantillon de PBS dilué dans un tube en verre transparent et congeler le tube dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit entièrement congelé. Déplacez le tube congelé dans un récipient transparent prérempli d’azote liquide. La lyse cellulaire complète montre la couleur surnageante et bleu-vert foncé avant la centrification.La séparation du gradient de densité de saccharose du PBS isolé montre plusieurs fractions de phycobiliprotéines dissociées et la fraction la plus faible représente le PBS intact. Les spectres d’absorption du PBS dissocié et intact de JSC one et Syn6803 ont le même pic à 622 nanomètres, correspondant à la phycocyanine. De plus, le pic d’absorption de la phycoérythrine à 571 nanomètres dans le PBS dissocié et intact de JSC-1.Les spectres d’émission du PBS dissocié ont un pic fort à environ 650 nanomètres dans Syn6803 et JSC-1, représentant l’émission de phycocyanine. Les pics maximaux d’émission fluorescente à 651 nanomètres et 684 nanomètres révèlent que l’énergie récoltée par la phycocyanine a été transférée efficacement à l’allophycocyanine et aux émetteurs terminaux, qui sont ApcD et ApcE, dans le noyau. La figure montre SDS-PAGE coloré en zinc sous irradiation UV où les sous-unités phycobiliprotéiques sont fortement fluorescentes et l’ApcE a montré une faible fluorescence, indiquée par la flèche.La coloration bleue de Kumasi montre que les fractions supérieures contiennent d’autres protéines solubles dans l’eau non PBS et que les PBS et Syn6803 intacts montrent une bande ApcE proéminente, indiquée par une flèche, dépourvue des fractions PBS dissociées. L’ultracentrifugation démontre que le gradient de saccharose préparé à un rapport de 1:3 affiche des bandes plus larges que le gradient fait à un rapport de 1:10. Il est important de lyser complètement les cellules et de solvolyser complètement les surnageants pour obtenir plus de phycobilisomes.D’autres méthodes, comme la cryo-EM ou la spectrométrie mixte, peuvent être utilisées pour étudier la structure protéique ou la composition protéique des phycobilisomes.

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