Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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Die Autoren danken Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University für den bequemen Einsatz der Ultrazentrifuge. Die Cyanobakterienstämme Synechocystis sp. PCC 6803 und Leptolyngbya sp. JSC-1 wurden von Dr. Chu, Hsiu-An an der Academia Sinica, Taiwan, bzw. Dr. Donald A. Bryant an der Pennsylvania State University, USA, geschenkt. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Taiwan) (109-2636-B-002-013- und 110-2628-B-002-065-) und dem Yushan Young Scholar Program des Bildungsministeriums (Taiwan) (109V1102 und 110V1102) finanziert.

Der Synechocystis sp. PCC 6803, der Glukose-tolerante Modellstamm, wurde von Dr. Chu, Hsiu-An an der Academia Sinica, Taiwan, erhalten. Leptolyngbya sp. JSC-1, das Nicht-Modell-Filament, wurde von Dr. Donald A. Bryant an der Pennsylvania State University, USA, erhalten.
1. Zellkultur und Ernte
<ol><li>Impfen von Syn6803- oder JSC-1-Zellen unter Verwendung einer metallischen Impfschleife in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml B-HEPES-Medium28.<sup class=...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. 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PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. 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Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und Standardmethode zur Isolierung von intaktem PBS in zwei Arten von Cyanobakterien, dem einzelligen Modell Syn6803 und dem fadenförmigen Nicht-Modell JSC-1. Die kritischen Schritte des Protokolls sind die Zellhomogenisierung und die Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Dichtegradienten von Saccharose. Im Allgemeinen ist die Störung von filamentösen Zellen komplizierter als einzellige. Die Erhöhung der Menge des Ausgangsmaterials (das Nassgewicht des Zellpellets...

Phycobilisom (PBS) ist ein riesiger wasserlöslicher Pigment-Protein-Komplex, der sich an die zytoplasmatische Seite der Photosysteme in den Thylakoidmembranen von Cyanobakterien bindet1. PBS besteht hauptsächlich aus farbigen Phycobiliproteinen und farblosen Linkerproteinen1,2. Die Phycobiliproteine können in vier Hauptgruppen unterteilt werden: Phycoerythrin, Phycoerythrocyanin, Phycocyanin und Allophycocyanin3. Die vier Hauptgruppen absorbieren unterschiedliche Wellenlängen der Lichtenergie im Bereich von 490-650 nm, die Chlorophylle ineffizient absorbierten3. Das PBS kann als Lichtsammelantenne dienen, um Lichtenergie zu sammeln und an Photosystem II und I4 abzugeben.
Die Struktur und Zusammensetzung von PBS variiert von Art zu Art. Insgesamt wurden drei Formen von Phycobilisomen (hemidiscodial, bündelförmig und stäbchenförmig) in verschiedenen Cyanobakterienspezies identifiziert5. Selbst bei den gleichen Arten ändert sich die Zusammensetzung von PBS als Reaktion auf die Umwelt, wie Lichtqualität und Nährstoffmangel6,7,8,9,10,11. Daher war das experimentelle Verfahren zur Isolierung von PBS aus Cyanobakterien maßgeblich an der Untersuchung von PBS12 beteiligt. Über mehrere Jahrzehnte haben viele verschiedene Protokolle PBS isoliert und seine Struktur, Zusammensetzung und Funktion analysiert6,7,8,12,13,14,15,16,17. Die große Vielfalt an Methoden zur PBS-Isolierung bietet in der Tat Flexibilität bei der Isolierung des Komplexes in verschiedenen Spezies mit unterschiedlichen Reagenzien und Instrumenten. Es erschwert jedoch auch die Auswahl eines geeigneten Protokolls für Wissenschaftler, die mit Cyanobakterien und PBS nicht vertraut sind. Daher wird in dieser Arbeit ein verallgemeinertes und einfaches Protokoll für diejenigen entwickelt, die daran interessiert sind, die PBS-Isolierung aus Cyanobakterien zu beginnen.
Die Methoden zur Isolierung von PBS aus früheren Publikationen sind hier zusammengefasst. Da PBS ein wasserlöslicher Proteinkomplex ist und leicht dissoziiert werden kann, ist ein hochionischer Phosphatpuffer erforderlich, um PBS während der Extraktion zu stabilisieren18. Mehrere Forschungsartikel, die Methoden zur Isolierung von PBS aus Cyanobakterien beschreiben, wurden in der Vergangenheit veröffentlicht. Die meisten Methoden erfordern eine hohe Konzentration an Phosphatpuffer8,14,15,18,19. Die Verfahren zur mechanischen Störung der Zellen variieren jedoch, wie z. B. glasperlengestützte Extraktion, Beschallung20 und French Press6,8,14. Verschiedene Phycobiliproteine können durch Fällung mit Ammoniumsulfat20 gewonnen und mittels HPLC21 oder einer chromatographischen Säule gereinigt werden22. Auf der anderen Seite kann intaktes PBS leicht durch Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation isoliert werden6,8,15.
In diesem Protokoll wurden ein Modellcyanobakterium und ein Nicht-Modell-Cyanobakterium als Materialien für die PBS-Isolierung verwendet. Es handelt sich um einzellige glucosetolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (im Folgenden Syn6803) und nicht-modellartige filamentöse Leptolyngbya sp. JSC-1 (im Folgenden JSC-1) bzw. 7,23,24. Das Protokoll beginnt mit dem Aufbrechen der einzelligen und filamentösen Cyanobakterien in einem hochionischen Phosphatpuffer. Nach der Lyse werden die Überstände durch Zentrifugation gesammelt und dann mit einem nichtionischen Reinigungsmittel (Triton X-100) behandelt, um die wasserlöslichen Proteine aus den Thylakoidmembranen zu lösen. Die gesamten wasserlöslichen Proteine werden auf einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten aufgetragen, um das PBS zu fraktionieren. Der diskontinuierliche Saccharosegradient in diesem Protokoll besteht aus vier Saccharoselösungen und teilt das intakte PBS in die niedrigsten Anteile der Saccharoseschicht auf25. Die Integrität von PBS kann durch SDS-PAGE, Zinkfärbung und 77K-Fluoreszenzspektroskopie6,7,8,26 analysiert werden. Diese Methode eignet sich für Wissenschaftler, die intaktes PBS aus Cyanobakterien isolieren und seine spektralen, strukturellen und kompositorischen Eigenschaften untersuchen wollen.
Es gibt mehrere Vorteile dieses Protokolls. (1) Diese Methode ist standardisiert und kann zur Isolierung von intaktem PBS sowohl aus einzelligen als auch aus filamentösen Cyanobakterien verwendet werden. Die meisten Artikel beschreiben die Methode, die in einer der beiden Arten von Cyanobakterien angewendet wurde4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Diese Methode wird bei Raumtemperatur durchgeführt, da PBS bei niedriger Temperatur dissoziiert19,27. (3) Diese Methode beschreibt die Verwendung eines Perlenschlägers, um die Zellen zu stören; Daher ist es billiger und sicherer als Hochdruck-French-Presse und mögliche Hörschäden durch Ultraschall in anderen Methoden8,13,14,20. (4) Diese Methode isoliert intaktes PBS durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation. Auf diese Weise können intaktes PBS mit unterschiedlichen Größen und teilweise dissoziiertes PBS basierend auf der Saccharosekonzentration getrennt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

In Cyanobakterien ist das Phycobilisom ein lebenswichtiger Antennenproteinkomplex, der Licht erntet und Energie an das Photosystem I und II für die Photochemie überträgt. Die Untersuchung der Struktur und Zusammensetzung von Phycobilisom ist für Wissenschaftler von großem Interesse, da sie die Evolution und Divergenz der Photosynthese in Cyanobakterien aufdeckt. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte und optimierte Methode, um Cyanobakterienzellen kostengünstig durch einen Perlenschläger effizient zu brechen. Das intakte Phycobilisom kann dann aus dem Zellextrakt durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation isoliert werden. Diese Methode hat gezeigt, dass sie sowohl für Modell- als auch für Nicht-Modell-Cyanobakterien mit unterschiedlichen Zelltypen geeignet ist. Ein schrittweises Verfahren wird auch bereitgestellt, um die Integrität und Eigenschaft von Phycobiliproteinen durch 77K-Fluoreszenzspektroskopie und SDS-PAGE, die mit Zinksulfat und Coomassie Blue gefärbt wurden, zu bestätigen. Das isolierte Phycobilisom kann auch weiteren Struktur- und Zusammensetzungsanalysen unterzogen werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen hilfreichen Startleitfaden, der es Forschern, die mit Cyanobakterien nicht vertraut sind, ermöglicht, intakte Phycobilisomen schnell zu isolieren und zu charakterisieren.

Die Zellen Syn6803 und JSC-1 wurden in konischen Kolben unter ständigem Rühren in B-HEPES-Medium bei 30 °C unter einem LED-Weißlicht (50 μmol Photonen m-2s-1) in einer mit 1% (v/v) CO2 gefüllten Wachstumskammer kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase (OD750 = ~0,5) wurden die Zellen in frisches Medium mit einer endgültigen optischen Dichte OD750 = ~0,2 subkulturiert. Nach Erreichen der späten exponentiellen Wachstumsphase (OD750 = 0,6-0,8)...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.

Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Es ist ein einfaches und schnelles Protokoll, das es Menschen, die mit Cyanobakterien nicht vertraut sind, ermöglicht, Phycobilisom leicht zu isolieren. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie an einen kleinen Maßstab angepasst ist und einfach durchzuführen ist. Es ist eine einfache, zuverlässige und effiziente Methode zur Isolierung intakter Phycobilisomen von Modell- und Nicht-Modell-Cynobakterien.Beginnen Sie mit der Übertragung der Zellkultur von 0,8 OD bei 750 Nanometern in einen Ein-Liter-Kolben und verdünnen Sie sie in 500 Milliliter B-HEPES-Medium, um einen OD von 0,2 bei 750 Nanometern zu erreichen. Züchten Sie die Kultur unter ständigem Rühren bei 30 Grad Celsius, bis der OD 0,8 zu 1 erreicht, was auf eine späte exponentielle Wachstumsphase hinweist. Zentrifugieren Sie die Kultur mit einer Geschwindigkeit von 10.000 mal g für 20 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.Suspendieren Sie die Zellpellets und waschen Sie sie zweimal mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer, pH sieben. Pelletieren Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen durch Zentrierung bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer.Messen Sie das Nassgewicht des Pellets mit einer elektronischen Waage und resuspendieren Sie das ein Gramm Nassgewicht des Pellets in fünf Milliliter des Puffers. Fügen Sie einen Milliliter Zellsuspension und 0,4 bis 0,6 Gramm 0,1 Millimeter Glasperlen in eine Zwei-Milliliter-Schraubkappenfläschchen hinzu. Brechen Sie die Zellen für 30 Sekunden durch einen Perlenschläger.Lassen Sie die Schläuche in einem Wasserbad bei Raumtemperatur zwei Minuten abkühlen. Nach der Lyse zentrifugieren Sie die Fläschchen für 10 Sekunden bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 500 mal g. Den Überstand mit einer Pipette in einem 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen auffangen.Die Kügelchen einmal mit 0,5 Millilitern 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer waschen und dann in dasselbe Zentrifugenröhrchen geben. Triton X-100 zur lysierten Zellsuspension geben und auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur und 40 U / min für 20 Minuten oder bis die Lösung homogen wird. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 20 Minuten bei 17,210 mal g und lagern Sie den Überstand ohne die obere Triton-Mizellenschicht bei Raumtemperatur bis zu einer Stunde.Machen Sie vier Konzentrationen Saccharose in 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer bei pH sieben. 2,8 Milliliter zweier backen Saccharosepuffer am Boden des 40 Milliliter Zentrifugenröhrchens platzieren und mit drei Schichten Saccharoselösungen überlagern. Schließlich fügen Sie drei Milliliter PBS hinzu, die die überstehende Fraktion enthalten, und zentrifugieren Sie die resultierenden Gradienten.Kondensieren Sie bei der Ultrazentrierung die fraktionierten PBS- und Phycobiliproteine zwischen den Schichten und beobachten Sie die blauen Bänder in Syn6803 und Grenzflächen. Entfernen Sie die Saccharose durch wiederholtes Konzentrieren und Verdünnen der Fraktionen mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer und Membran der Zentrifugalfiltereinheiten. Zur Messung der PBS-Fluoreszenz verdünnen Sie die konzentrierte PBS-Probe mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer auf bis zu 500 Mikroliter Volumen.Geben Sie die verdünnte PBS-Probe in ein transparentes Glasröhrchen und frieren Sie das Röhrchen in flüssigem Stickstoff ein, bis es vollständig eingefroren ist. Bewegen Sie das gefrorene Röhrchen in einen transparenten Dewar-Behälter, der mit flüssigem Stickstoff vorgefüllt ist. Die vollständige Zelllyse zeigt die überstehende und dunkelblau-grüne Farbe vor der Zentrierung.Die Saccharosedichtegradiententrennung von isoliertem PBS zeigt mehrere Fraktionen dissoziierter Phycobiliproteine und die niedrigste Fraktion repräsentiert die intakte PBS. Die Absorptionsspektren aus dem dissoziierten und intakten PBS von JSC one und Syn6803 haben mit 622 Nanometern den gleichen Peak, der dem Phycocyanin entspricht. Darüber hinaus erreicht die Phycoerythrin-Absorption einen Peak von 571 Nanometern sowohl im dissoziierten als auch im intakten PBS von JSC-1.Die Emissionsspektren des dissoziierten PBS haben einen starken Peak bei etwa 650 Nanometern in Syn6803 und JSC-1, der die Emission von Phycocyanin darstellt. Die maximalen Peaks der fluoreszierenden Emission bei 651 Nanometern und 684 Nanometern zeigen, dass die von Phycocyanin geerntete Energie effizient auf Allophycocyanin und terminale Emitter, die ApcD und ApcE sind, im Kern übertragen wurde. Die Abbildung zeigt zinkgefärbte SDS-PAGE unter UV-Bestrahlung, wobei die Phycobiliprotein-Untereinheiten stark fluoreszierend sind und der ApcE eine schwache Fluoreszenz zeigte, die mit dem Pfeil angezeigt wird.Kumasi-Blaufärbung zeigt, dass die oberen Fraktionen andere nicht-PBS-wasserlösliche Proteine enthalten und das intakte PBS und Syn6803 zeigt ein prominentes ApcE-Band, das mit einem Pfeil angezeigt wird und in den dissoziierten PBS-Fraktionen fehlt. Die Ultrazentrifugation zeigt, dass der in einem Verhältnis von 1:3 hergestellte Saccharosegradient breitere Bänder aufweist als der Gradient im Verhältnis 1:10. Es ist wichtig, die Zellen zu lysieren und die Überstände vollständig zu solvolysieren, um mehr Phycobilisomen zu erhalten.Andere Methoden, wie Kryo-EM oder Gemischte Spektrometrie, können verwendet werden, um die Proteinstruktur oder die Proteinzusammensetzung von Phycobilisomen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Forschung

Biologie

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Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

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Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...