Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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Gli autori ringraziano Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University per il comodo uso dell'ultracentrifuga. I ceppi cianobatterici Synechocystis sp. PCC 6803 e Leptolyngbya sp. JSC-1 sono stati donati rispettivamente dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan, e dal Dr. Donald A. Bryant presso la Pennsylvania State University, USA. Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (Taiwan) (109-2636-B-002-013- e 110-2628-B-002-065-) e dal Ministero dell'Istruzione (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 e 110V1102).

Il Synechocystis sp. PCC 6803, il ceppo modello tollerante al glucosio, è stato ottenuto dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, il filamentoso non modello, è stato ottenuto dal Dr. Donald A. Bryant della Pennsylvania State University, USA.
1. Coltura cellulare e raccolta
<ol><li>Inoculare le celle Syn6803 o JSC-1 utilizzando un anello di inoculazione metallico in un pallone conico da 100 ml contenente 50 mL di B-HEPES...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo semplice e standard per isolare PBS intatto in due tipi di cianobatteri, il modello unicellulare Syn6803 e il filamentoso non modello JSC-1. Le fasi critiche del protocollo sono l'omogeneizzazione cellulare e l'ultracentrifugazione su un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Generalmente, la distruzione delle cellule filamentose è più complicata di quelle unicellulari. L'aumento della quantità di materiale di partenza (il peso umido del pellet cellulare) e la ripetizione...

Il ficobilisoma (PBS) è un enorme complesso pigmento-proteina solubile in acqua che si attacca al lato citoplasmatico dei fotosistemi nelle membrane tilacoidi dei cianobatteri1. La PBS è composta principalmente da ficobiliproteine colorate e proteine linker incolori1,2. Le ficobiliproteine possono essere suddivise in quattro gruppi principali: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina e alloficocianina3. I quattro gruppi principali assorbono diverse lunghezze d'onda dell'energia luminosa nell'intervallo 490-650 nm, che le clorofille hanno assorbito in modo inefficiente3. Il PBS può fungere da antenna per la raccolta della luce per la raccolta dell'energia luminosa e la consegna al fotosistema II e I4.
La struttura e la composizione del PBS variano da specie a specie. Collettivamente, tre forme di ficobilisoma (emidiscodiale, a forma di fascio e a forma di bastoncello) sono state identificate in diverse specie cianobatteriche5. Anche nella stessa specie, la composizione del PBS cambia in risposta all'ambiente, come la qualità della luce e l'esaurimento dei nutrienti6,7,8,9,10,11. Pertanto, la procedura sperimentale per isolare PBS dai cianobatteri è stata determinante nello studio di PBS12. Nel corso di diversi decenni, molti protocolli diversi hanno isolato PBS e analizzato la sua struttura, composizione e funzione6,7,8,12,13,14,15,16,17. L'ampia varietà di metodi per l'isolamento PBS fornisce infatti flessibilità nell'isolare il complesso in diverse specie con diversi reagenti e strumenti. Tuttavia, rende anche più difficile la scelta di un protocollo adatto per gli scienziati che non hanno familiarità con cianobatteri e PBS. Pertanto, in questo lavoro viene sviluppato un protocollo generalizzato e diretto per coloro che sono interessati ad avviare l'isolamento PBS dai cianobatteri.
I metodi per isolare PBS dalle pubblicazioni precedenti sono riassunti qui. Poiché PBS è un complesso proteico solubile in acqua ed è facilmente dissociato, è necessario un tampone fosfato ad alta forza ionica per stabilizzare PBS durante l'estrazione18. Diversi articoli di ricerca che descrivono i metodi per l'isolamento della PBS dal cianobatterio sono stati pubblicati in passato. La maggior parte dei metodi richiede un'alta concentrazione di tampone fosfato8,14,15,18,19. Tuttavia, le procedure per l'interruzione meccanica delle cellule variano, come l'estrazione assistita da perle di vetro, la sonicazione20 e la stampa francese6,8,14. Diverse ficobiliproteine possono essere ottenute per precipitazione con solfato di ammonio20 e purificate da HPLC21 o da una colonna cromatografica22. D'altra parte, il PBS intatto può essere facilmente isolato dall'ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio6,8,15.
In questo protocollo, un cianobatterio modello e un cianobatterio non modello sono stati utilizzati come materiali per l'isolamento PBS. Sono modello unicellulare tollerante al glucosio Synechocystis sp. PCC 6803 (di seguito Syn6803) e Leptolyngbya sp. filamentosa non modello JSC-1 (di seguito JSC-1), rispettivamente7,23,24. Il protocollo inizia con l'interruzione dei cianobatteri unicellulari e filamentosi in un tampone fosfato ad alta resistenza ionica. Dopo la lisi, i supernatanti vengono raccolti per centrifugazione e quindi trattati con un detergente non ionico (Triton X-100) per solubilizzare le proteine idrosolubili dalle membrane tilacoidi. Le proteine idrosolubili totali vengono applicate a un gradiente di densità discontinuo di saccarosio per frazionare il PBS. Il gradiente discontinuo di saccarosio in questo protocollo è costituito da quattro soluzioni di saccarosio e suddivide il PBS intatto nelle frazioni più basse dello strato di saccarosio25. L'integrità del PBS può essere analizzata mediante SDS-PAGE, colorazione dello zinco e spettroscopia di fluorescenza 77K6,7,8,26. Questo metodo è adatto per gli scienziati che mirano a isolare PBS intatto dai cianobatteri e studiare le sue proprietà spettrali, strutturali e compositive.
Ci sono diversi vantaggi di questo protocollo. (1) Questo metodo è standardizzato e può essere utilizzato per isolare PBS intatto da cianobatteri sia unicellulari che filamentosi. La maggior parte degli articoli descrive il metodo che si applicava in entrambi i tipi di cianobatteri4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Questo metodo viene eseguito a temperatura ambiente, poiché PBS si dissocia a bassa temperatura19,27. (3) Questo metodo descrive l'uso di un battitore di perline per interrompere le cellule; pertanto, è più economico e più sicuro della stampa francese ad alta pressione e possibili danni all'udito da sonicatore in altri metodi8,13,14,20. (4) Questo metodo isola il PBS intatto mediante ultracentrizzazione a gradiente di saccarosio. In questo modo, PBS intatto con dimensioni diverse e PBS parzialmente dissociato può essere separato in base alla concentrazione di saccarosio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

Nei cianobatteri, il ficobilisoma è un complesso proteico antenna vitale che raccoglie la luce e trasferisce energia al fotosistema I e II per la fotochimica. Studiare la struttura e la composizione del ficobilisoma è di grande interesse per gli scienziati perché rivela l'evoluzione e la divergenza della fotosintesi nei cianobatteri. Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato e ottimizzato per rompere le cellule cianobatteriche a basso costo da un battitore di perline in modo efficiente. Il ficobilisoma intatto può quindi essere isolato dall'estratto cellulare mediante ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo metodo ha dimostrato di essere adatto sia per cianobatteri modello che non modello con diversi tipi di cellule. Viene inoltre fornita una procedura passo-passo per confermare l'integrità e la proprietà delle ficobiliproteine mediante spettroscopia di fluorescenza 77K e SDS-PAGE colorato da solfato di zinco e Coomassie Blue. Il ficobilisoma isolato può anche essere sottoposto ad ulteriori analisi strutturali e compositive. Nel complesso, questo protocollo fornisce un'utile guida di partenza che consente ai ricercatori che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare e caratterizzare rapidamente il ficobilisoma intatto.

Le cellule Syn6803 e JSC-1 sono state coltivate in palloni conici con agitazione costante in mezzo B-HEPES a 30 °C, sotto una luce bianca a LED (50 fotoni μmol m-2s-1) in una camera di crescita riempita con l'1% (v/v) di CO2. Nella fase di crescita esponenziale (OD750 = ~0,5), le cellule sono state sottocoltate in mezzo fresco con una densità ottica finale OD750 = ~0,2. Dopo aver raggiunto la fase di crescita esponenziale tardiva (OD750 = 0,6-0,8), le c...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.

Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

È un protocollo semplice e veloce che consente alle persone che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare il ficobilisoma a proprio agio. Il vantaggio di questa tecnica è che è adattata a una piccola scala ed è facile da eseguire. È un metodo semplice, affidabile ed efficiente per isolare ficobilisomi intatti di cinobatteri modello e non modello.Inizia trasferendo la coltura cellulare di 0,8 OD a 750 nanometri in un pallone da un litro e diluiscila in 500 millilitri di mezzo B-HEPES per ottenere l'OD di 0,2 a 750 nanometri. Coltiva la coltura con agitazione costante a 30 gradi Celsius fino a quando l'OD raggiunge 0,8 a 1, indicando una fase di crescita esponenziale tardiva. Centrifugare la coltura ad una velocità di 10.000 volte g per 20 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.Sospendere i pellet cellulari e lavare due volte con tampone fosfato di potassio molare 0,75, pH sette. Pellet le celle in un tubo di centrifuga da 50 millilitri mediante centrificazione a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospese le cellule con 0,75 tampone di fosfato di potassio molare.Misurare il peso umido del pellet con una bilancia elettronica e risospesare il peso umido di un grammo del pellet in cinque millilitri del buffer. Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare e da 0,4 a 0,6 grammi di perle di vetro da 0,1 millimetri in un flaconcino con tappo a vite da due millilitri. Rompere le celle per 30 secondi da un battitore di perline.Lasciare raffreddare i tubi a bagnomaria a temperatura ambiente per due minuti. Dopo la lisi, centrifugare i flaconcini per 10 secondi a temperatura ambiente ad una velocità di 500 volte g. Raccogliere il surnatante con una pipetta in un tubo centrifugo da 15 millilitri.Lavare le perline con 0,5 millilitri di tampone fosfato di potassio molare 0,75 una volta, quindi trasferirle nello stesso tubo centrifuga. Aggiungere Triton X-100 alla sospensione a cellule lisate e incubare su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente e 40 RPM per 20 minuti o fino a quando la soluzione diventa omogenea. Centrifugare i tubi per 20 minuti a 17, 210 volte g e conservare il surnatante senza lo strato superiore di micella Triton a temperatura ambiente per un massimo di un'ora.Fare quattro concentrazioni di saccarosio in 0,75 molare tampone di fosfato di potassio a pH sette. Posizionare 2,8 millilitri di due tamponi di saccarosio molare sul fondo del tubo della centrifuga da 40 millilitri e sovrapporre con tre strati di soluzioni di saccarosio. Infine, aggiungere tre millilitri di PBS contenenti la frazione surnatante e centrifugare i gradienti risultanti.Dopo l'ultracentrificazione, condensare il PBS frazionato e le ficobiliproteine tra gli strati e osservare le bande blu in Syn6803 e le interfacce. Rimuovere il saccarosio concentrando e diluendo ripetutamente le frazioni con tampone fosfato di potassio molare 0,75 e membranare le unità filtranti centrifughe. Per misurare la fluorescenza PBS diluire il campione PBS concentrato con tampone fosfato di potassio molare 0,75 per ottenere un volume di microlitri fino a 500 microlitri.Aggiungere il campione PBS diluito in un tubo di vetro trasparente e congelare il tubo in azoto liquido fino a quando non è completamente congelato. Spostare il tubo congelato in un contenitore dewar trasparente preriempito con azoto liquido. La lisi cellulare completa mostra il colore surnatante e blu-verde scuro prima della centrificazione.La separazione del gradiente di densità del saccarosio del PBS isolato mostra diverse frazioni di ficobiliproteine dissociate e la frazione più bassa rappresenta il PBS intatto. Gli spettri di assorbimento dal PBS dissociato e intatto di JSC one e Syn6803 hanno lo stesso picco a 622 nanometri, corrispondente alla ficocianina. Inoltre, il picco di assorbimento della ficoeritrina a 571 nanometri sia nel PBS dissociato che intatto di JSC-1.Gli spettri di emissione del PBS dissociato hanno un forte picco a circa 650 nanometri in Syn6803 e JSC-1, che rappresenta l'emissione di ficociani. I picchi massimi di emissione fluorescente a 651 nanometri e 684 nanometri rivelano che l'energia raccolta dalla ficocianina è stata trasferita in modo efficiente all'alloficocianina e agli emettitori terminali, che sono ApcD e ApcE, nel nucleo. La figura mostra SDS-PAGE colorato di zinco sotto irradiazione UV dove le subunità ficobiliproteine sono fortemente fluorescenti e l'ApcE ha mostrato una debole fluorescenza, indicata con la freccia.La colorazione blu di Kumasi mostra che le frazioni superiori contengono altre proteine idrosolubili non PBS e le PBS intatte e Syn6803 mostrano una banda ApcE prominente, indicata con una freccia, priva delle frazioni PBS dissociate. L'ultracentrifugazione dimostra che il gradiente di saccarosio preparato in un rapporto di 1:3 mostra bande più larghe rispetto al gradiente realizzato con un rapporto di 1:10. È importante lisi delle cellule e solvolisi completamente i supernatanti per ottenere più ficobilisomi.Altri metodi, come la crio-EM o la spettrometria mista, possono essere utilizzati per studiare la struttura proteica o la composizione proteica dei ficobilisomi.

Research

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Biology

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