Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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著者らは、超遠心分離機の便利な使用のために、国立台湾大学ライフサイエンス大学テクノロジー・コモンズに感謝している。シアノバクテリア株 シネコシスティス sp.PCC 6803と レプトリンビヤ sp.JSC-1は、米国ペンシルベニア州立大学のアカデミア・シニカのチュウ博士、シーウアン、ドナルド・A・ブライアント博士からそれぞれ贈られました。この研究は、理工省(台湾)(109-2636-B-002-013-および110-2628-B-002-065-)と文部省(台湾)の湯山若手学者プログラム(109V11102および110V1102)によって資金提供されました。

シネコシスティスsp. PCC 6803は、モデルグルコース耐性株を、台湾のアカデミア・シニカのチュウ・シュアン博士から得た。非モデルフィラメントであるレプトロンビー sp. JSC-1 は、米国ペンシルベニア州立大学のドナルド・A・ブライアント博士から入手しました。
1. 細胞培養と収穫
<ol><li>金属接種ループを用いてSyn6803またはJSC-1細胞を50mLのB-H...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+from+blue-green+and+red+algae:+Isolation+criteria+and+dissociation+characteristics.">Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics.</a> Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).</li><li>Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat.">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li><li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins.">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li><li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka,+Gujarat,+India.">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li><li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).</li><li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits.">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata.">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).</li><li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

このプロトコルは、シアノバクテリア、単細胞モデルSyn6803、および糸状非モデルJSC-1で無傷のPBSを単離するための簡単で標準的な方法を説明しています。プロトコルの重要なステップは、セルの均質化とスクロースの不連続な密度勾配の超遠心化です。一般的に、糸状細胞の破壊は単細胞細胞よりも複雑である。出発物質の量(細胞ペレットの湿重量)およびビーズ叩きの繰り返し量を増加さ?...

フィコビリソーム(PBS)は、シアノバクテリア1のチラコイド膜中の光系の細胞質側に付着する巨大な水溶性色素タンパク質複合体です。PBSは主に、着色されたフィコビリタンパク質と無色リンカータンパク質1,2で構成されています。フィコビリタンパク質は、フィコエリスリン、フィコエリコシアニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン3の4つの主要なグループに分けることができます。4つの主要なグループは、クロロフィルが非効率的に吸収した490〜650nmの範囲で光エネルギーの異なる波長を吸収する3。PBSは光エネルギーを集め、それを光システムIIおよびI4に渡すライトハーベニングアンテナとして役立つことができる。
PBSの構造と組成は種によって異なります。総称して、異なるシアノバクテリア種5において、フィコビリソーム(ヘミディスコジアル、束状、および棒状)の3つの形状が同定されている。同種においても、PBSの組成は、光質や栄養枯渇などの環境に応じて変化する6,7,8,9,10,11。そこで、シアノバクテリアからPBSを単離する実験手順は、PBS12の研究に役立っています。数十年にわたり、多くの異なるプロトコルがPBSを分離し、その構造、組成、および機能6,7,8,12,13,14,15,16,17を分析してきました。PBSの分離のための多種多様な方法は確かに異なる試薬および器械と異なった種の複合体を単離する柔軟性を提供する。しかし、それはまた、シアノバクテリアやPBSに慣れていない科学者にとって、適切なプロトコルを選択することがより困難になります。したがって、チアノバクテリアからのPBS分離を開始することに興味がある人のために、この研究では一般化された簡単なプロトコルが開発されています。
前の出版物からPBSを分離する方法をここに要約します。PBSは水溶性タンパク質複合体であり容易に解約されるため、抽出時にPBSを安定化させるために高いイオン強度リン酸緩衝液が必要となる。チアノバクテリウムからのPBSの分離方法を記述したいくつかの研究記事が過去に公開されています。.ほとんどの方法は、高濃度のリン酸緩衝液8,14,15,18,19を必要とする。しかし、細胞の機械的破壊のための手順は、例えば、ガラスビーズ支援抽出、超音波20、およびフランスの圧知6、8,14など、様々です。異なるフィコビリタンパク質は、硫酸アンモニウム20で沈殿し、HPLC21またはクロマトグラフィーカラム22で精製することによって得ることができる。一方、無傷のPBSは、スクロース密度勾配超遠心分離6,8,15によって容易に単離することができる。
このプロトコルでは、1つのモデルシアノバクテリウムと1つの非モデルシアノバクテリウムがPBS分離の材料として使用されました。これらは、モデル単細胞グルコース耐性シネクロシスティスsp.PCC 6803(以下Syn6803)および非モデル糸状レプトレングビヤsp.JSC-1(以下JSC-1)、それぞれ7,23,24である。このプロトコルは、高イオン強度リン酸緩衝液中の単細胞および糸状シアノバクテリアの破壊によって始まります。溶解後、上清を遠心分離によって回収し、非イオン性洗剤(Triton X-100)で処理し、チラコイド膜から水溶性タンパク質を可溶化する。全水溶性タンパク質は、不連続なスクロース密度勾配に適用され、PBSを分画する。このプロトコルの不連続なスクロース勾配は、4つのスクロース溶液で構成され、スクロース層25の最下端に無傷のPBSを仕分ける。PBSの完全性はSDS-PAGE、亜鉛染色、および77K蛍光分光法6、7、8、26によって分析することができる。この方法は、シアノバクテリアから無傷のPBSを分離し、そのスペクトル、構造、および組成特性を研究することを目指す科学者に適しています。
このプロトコルには、いくつかの利点があります。(1)この方法は標準化されており、単細胞および糸状シアノバクテリアの両方から無傷のPBSを単離するために使用することができます。ほとんどの記事は、いずれかのタイプのシアノバクテリア4、7,8,12,13,14,16,18に適用される方法を記載しています。(2)この方法は室温で行い、PBSが低温19,27で解化するようにする。(3) この方法は、ビーズビーターを使用して細胞を破壊する方法を説明します。したがって、それは高圧フランスのプレスよりも安価で安全であり、他の方法で超音波処理器からの損傷を聞く可能性8、13、14、20。(4)この方法は、スクロース勾配超遠心分離により、そのままPBSを分離する。このようにして、異なるサイズおよび部分的に解離したPBSを有する無傷のPBSは、スクロース濃度に基づいて分離することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

シアノバクテリアでは、フィコビリソームは光を収穫し、光化学のために光システムIとIIにエネルギーを伝達する重要なアンテナタンパク質複合体です。系統の構造と組成を研究することは、シアノバクテリアにおける光合成の進化と発散を明らかにするため、科学者にとって大きな関心事です。このプロトコルは、ビードビーターによって効率的にシアノバクテリア細胞を低コストで破壊する詳細かつ最適化された方法を提供します。その後、無傷のフィコビリソームを、ショ糖勾配超遠心分離によって細胞抽出物から分離することができる。この方法は、異なる細胞タイプのモデルおよび非モデルシアノバクテリアの両方に適している実証されている。77K蛍光分光法と硫酸亜鉛とクマシーブルー染色SDS-PAGEによるフィコビリタンパク質の完全性と性質を確認するためのステップバイステップの手順も提供されています。分離されたフィコビリソームは、さらなる構造解析および組成解析を行うこともできます。全体として、このプロトコルは、シアノバクテリアに精通していない研究者が無傷のフィコビリソームを迅速に単離し、特徴付けることを可能にする有用な開始ガイドを提供する。

Syn6803およびJSC-1細胞は、1%(v/v)CO2で満たされた成長室で、B-HEPES培地で一定の攪拌を行い、LED白色光(50μmol光子m-2s-1)下で円錐形フラスコで培養した。指数成長期(OD750=〜0.5)において、細胞を最終光学密度OD750=〜0.2で新鮮な培地にサブ培養した。後期指数成長相(OD750 = 0.6-0.8)に達した後、培養物を回収し、遠心分離(20分間室温で10,000 x g)した?...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

現在のプロトコルは、不連続なスクロース密度勾配を介して遠心分離によってシアノバクテリアからのフィコビリソームの分離を詳述する。77K蛍光発光スペクトルとSDS-PAGE分析により、インタクトなフィコビリソームの画分が確認されます。得られたフィコビリソーム画分は、TEMの陰性染色および質量分析分析に適しています。

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

これは、シアノバクテリアに不慣れな人々が容易にフィコビリソームを分離することを可能にするシンプルで高速なプロトコルです。この技術の利点は、小規模に適合し、実行が容易である点です。これは、モデルと非モデルシノバクテリアの無傷のフィコビリソームを単離するためのシンプルで信頼性の高い効率的な方法です。750ナノメートルの0.8 ODの細胞培養を1リットルフラスコに移し、500ミリリットルのB-HEPES培地で希釈し、750ナノメートルで0.2のODを達成する。ODが0.8〜1に達するまで摂氏30度で一定の攪拌で培養を成長させ、後期指数成長相を示す。室温で20分間10,000倍gの速度で培養を遠心し、上清を捨てます。細胞ペレットを懸濁し、0.75モルリン酸カリウムバッファー、pH 7で2回洗浄します。ペレットは、室温で遠心分離することにより50ミリリットル遠心分離管内の細胞を。上清を捨て、0.75モルリン酸カリウムバッファーで細胞を再中断します。電子バランスでペレットの湿重量を測定し、バッファーの5ミリリットルでペレットの1グラムのウェット重量を再懸濁します。セルサスペンション1ミリリットル、0.1ミリガラスビーズ0.4~0.6グラムを2ミリリットルスクリューキャップバイアルに加えます。ビーズビーターで細胞を30秒間割ります。室温の水浴でチューブを2分間冷まします。リシス後、500倍gの速度で室温で10秒間バイアルを遠心分離する。15ミリリットルの遠心チューブにピペットで上清を収集します。0.5ミリリットルの0.75モルリン酸カリウムバッファーでビーズを1回洗浄し、同じ遠心分離管に移します。Lysed細胞懸濁液にTriton X-100を加え、ロッキングシェーカーを室温で40RPM、20分間、または溶液が均質になるまでインキュベートします。チューブを17、210回gで20分間遠心し、上トリトンミセル層を含まない上清を室温で最大1時間保存します。pH 7で0.75モルリン酸カリウム緩衝液に4つの濃度のスクロースを作ります。40ミリリットル遠心分離管の下部に2.8ミリリットルの2モルショ糖バッファーを配置し、3層のショ糖溶液を重ね合わせます。最後に、上清画分を含むPBSを3ミリリットル加え、得られた勾配を遠心分離する。超中心化の際に、画層間の分画されたPBSとフィコビリタンパク質を凝縮し、Syn6803およびインターフェースの青いバンドを観察します。0.75モルリン酸カリウムバッファーで画分を繰り返し濃縮し、遠心フィルター単位を膜化することによって、スクロースを除去します。PBSの蛍光を測定するために、濃縮されたPBSサンプルを0.75モルリン酸カリウムバッファーで希釈し、最大500マイクロリットルの体積を作ります。希釈したPBSサンプルを透明なガラスチューブに加え、チューブを完全に凍結するまで液体窒素で凍結します。液体窒素であらかじめ充填された透明なデュワー容器に凍結チューブを移動します。完全な細胞のリシスは、重心化前に上清および濃い青色緑色を示す。単離されたPBSのショ糖密度勾配分離は、解離されたフィコビリタンパク質の数画を示し、最も低い画分は無傷のPBSを表す。JSC 1とSyn6803の解離および無傷のPBSからの吸収スペクトルは、フィコシアニンに対応する622ナノメートルで同じピークを有する。また、JSC-1の解離および無傷の両方のPBSにおいて571ナノメートルのフィコエリスリン吸収ピーク。解離したPBSの発光スペクトルは、Syn6803およびJSC-1で約650ナノメートルで1つの強いピークを有し、フィコシアニンからの放出を表す。651ナノメートルと684ナノメートルの蛍光発光ピークは、フィコシアニンによって収穫されたエネルギーがコア内のアソフィコシアニンおよびApcEである末端エミッタに効率的に移されたことを明らかにした。図は、フィコビリタンパク質サブユニットが強く蛍光を発し、ApcEが弱い蛍光を示したUV照射下の亜鉛染色SDS-PAGEを示し、矢印で示した。クマシブルー染色は、上端分には他の非PBS水溶性タンパク質が含まれていることを示しており、無傷のPBSおよびSyn6803は、解約されたPBS画分に欠けている矢印で示された顕著なApcEバンドを示す。超遠心分離は、1:3の比率で調製されたスクロース勾配が、1:10の比率で作られた勾配よりも広いバンドを表示することを示しています。細胞を溶起させ、上清を完全にソルボライシスして、より多くのフィコビリソームを得ることが重要です。他の方法は、クライオEMまたは混合分光法のような、タンパク質構造またはフィコビリソームのタンパク質組成を研究するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

RNA含有エキソソームの単離と解析

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

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アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離

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Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...