Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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저자는 기술 공용, 생명 과학 대학, 울트라 센드 심분리기의 편리한 사용에 대한 국립 대만 대학 감사합니다. 시아노균 균주 시코시티스 sp. PCC 6803 및 렙토립비아 sp. JSC-1은 미국 펜실베이니아 주립 대학의 아카데미미아 시니카의 추, Hsiu-An 박사, 미국 펜실베이니아 주립 대학의 도널드 A. 브라이언트 박사로부터 각각 재능이 있었습니다. 이 작품은 과학기술부(대만)(109-2636-B-002-013-110-2628-B-002-065-)와 교육부(대만) 유산영장프로그램(109V1102, 110V102)이 지원했다.

시코시스테티스 SP. PCC 6803, 모델 포도당 내성 균주, 박사에서 얻은 추, Hsiu-An 아카데미아 시니카, 대만. 렙토렝비아 SP. JSC-1, 비 모델 필라멘트, 미국 펜실베니아 주립 대학에서 박사 도널드 A. 브라이언트에서 얻은.
1. 세포 배양 및 수확
<ol><li>비헤페스 배지28의 50mL를 포함하는 100mL 원추형 플라스크로 금속 접종 루프를 사용하여 접?...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat.">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li><li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins.">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li><li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka,+Gujarat,+India.">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li><li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).</li><li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits.">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata.">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).</li><li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

이 프로토콜은 시아노박테리아, 단세포 모델 Syn6803 및 필라멘트 비모델 JSC-1의 두 가지 유형에서 그대로 PBS를 격리하는 간단하고 표준적인 방법을 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 자당의 불연속 밀도 그라데이션에 세포 균질화 및 초원심 분리입니다. 일반적으로 필라멘트 세포의 중단은 단세포 세포보다 더 복잡합니다. 시작 물질의 양을 증가 (세포 펠릿의 젖은 무게) 및 구슬 구타의 반복?...

Phycobilisome (PBS)는 시아노 박테리아1의 틸라코이드 막에서 광시스템의 세포질 측에 부착하는 거대한 수용성 안료 단백질 복합체입니다. PBS는 주로 유색 물리 단백질과 무색 링커 단백질1,2로 구성됩니다. 물리코빌리단백질은 물리에리스린, 피코에리스로시아닌, 피코시아닌 및 동종코시아니닌3의 4가지 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다. 4개의 주요 단은 엽록소가 비효율적으로 흡수한 490-650 nm 범위에서 다른 광에너지를 흡수합니다3. PBS는 광 에너지를 수집하고 광시스템 II 및 I4에 전달하기 위한 광 수확 안테나 역할을 할 수 있습니다.
PBS의 구조와 구성은 종마다 다릅니다. 전체적으로, 피코빌리솜의 세 가지 모양 (헤미디스탈, 번들 모양 및 막대 모양)은 다른 시아노박테리아 종5에서 확인되었습니다. 같은 종에서도 PBS의 조성은 광질 및 영양 고갈과 같은 환경에 반응하여 변화합니다6,7,8,9,10,11. 따라서, 시아노박테리아로부터 PBS를 분리하는 실험 절차는 PBS12를 공부하는 데 중요한 역할을 해왔다. 수십 년 동안 많은 다른 프로토콜은 PBS를 격리하고 그 구조, 구성 및 기능을 분석6,7,8,12,13,14,15,16,17. PBS 절연을 위한 다양한 방법은 실제로 다른 시약 및 계측기로 다른 종의 복합체를 분리하는 유연성을 제공합니다. 그러나, 그것은 또한 시아노 박테리아와 PBS에 익숙하지 않은 과학자에 대 한 적합 한 프로토콜을 선택 하 여 더 어렵게. 따라서, 일반화되고 간단한 프로토콜은 시아노박테리아에서 PBS 격리를 시작하는 데 관심이있는 사람들을 위해이 작품에서 개발된다.
이전 간행물에서 PBS를 격리하는 방법은 여기에 요약되어 있습니다. PBS는 수용성 단백질 복합체이며 쉽게 해리되기 때문에 추출 시 PBS를 안정화하기 위해서는 이온 강도가 높은 인산염 버퍼가 필요합니다18. 시아노박테리움에서 PBS의 격리를 위한 방법을 설명하는 몇몇 연구 기사는 과거에 간행되었습니다. 대부분의 방법은 인산염 완충제의 고농도를 필요로8,14,15,18,19. 그러나, 세포의 기계적 중단을 위한 절차는 유리 구슬 보조 추출, 초음파 처리20 및 프랑스 프레스6,8,14와 같이 변화합니다. 상이한 물리코빌리단백질은 황산암모늄을 함유한 침전을 통해 얻어지고 HPLC21 또는 크로마토그래피 컬럼22에 의해 정제될 수 있다. 한편, 그대로 PBS는 자당밀도 그라데이션 6,8,15에 의해 쉽게 분리될 수 있다.
이 프로토콜에서, 1개의 모형 cyanobacterium 및 1개의 비 모형 cyanobacterium는 PBS 격리를 위한 물질로 이용되었습니다. 이들은 모델 단세포 포도당 내성 Synechocystis sp. PCC 6803 (이하 Syn6803) 및 비 모델 필라멘트 렙토렝비아 sp. JSC-1 (이하 JSC-1), 각각 7,23,24이다. 프로토콜은 고온 강도 인산염 버퍼에서 단세포 및 필라멘트 시아노박테리아의 중단에 의해 시작됩니다. 용해 후, 슈퍼나탕은 원심분리에 의해 채취한 다음, 틸라코이드 막으로부터 수용성 단백질을 용해시키기 위해 니오니안 세제(Triton X-100)로 처리됩니다. 총 수용성 단백질은 PBS를 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 그라데이션에 적용됩니다. 이 프로토콜의 불연속 자당 그라데이션은 4개의 자당 솔루션으로 구성되며, 자당 계층25의 가장 낮은 분수에서 그대로 PBS를 분할합니다. PBS의 무결성은 SDS-PAGE, 아연 염색 및 77K 형광 분광기6,7,8,26에 의해 분석될 수 있다. 이 방법은 시아노박테리아에서 온전한 PBS를 분리하고 스펙트럼, 구조 및 조성 특성을 연구하는 것을 목표로 하는 과학자들에게 적합합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 장점이 있습니다. (1) 이 방법은 표준화되어 단세포 및 필라멘트 시아노박테리아 모두에서 온전한 PBS를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 대부분의 논문은 시아노박테리아4,7,8,12,13,14,16,18의 한 가지 유형에 적용되는 방법을 설명합니다. (2) PBS가 저온19,27에서 해리됨에 따라 이 방법은 실온에서 수행됩니다. (3) 이 방법은 비드 비터를 사용하여 세포를 방해하는 방법을 설명합니다. 따라서, 그것은 고압 프랑스어 프레스보다 저렴하고 안전하고 다른 방법으로 초음파 처리기에서 가능한 청력 손상8,13,14,20. (4) 이 방법은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 그대로 PBS를 분리한다. 이러한 방식으로, 크기가 다르고 부분적으로 해리된 PBS를 가진 온전한 PBS는 자당 농도에 따라 분리될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

시아노박테리아에서 피코빌리솜은 빛을 수확하고 광화학을 위해 광시스템 I와 II로 에너지를 전달하는 중요한 안테나 단백질 복합체입니다. 식물성 생물의 구조와 구성을 연구하는 것은 시아노 박테리아에서 광합성의 진화와 차이를 드러내기 때문에 과학자들에게 큰 관심사입니다. 이 프로토콜은 비드 비터에 의해 저렴한 비용으로 시아노균 세포를 분해하는 상세하고 최적화된 방법을 제공합니다. 그대로 피코빌리솜은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 세포 추출물로부터 분리될 수 있다. 이 방법은 다른 세포 모형을 가진 모형 및 비 모형 시아노박테리아 둘 다에 적합한 다는 것을 보여주었습니다. 또한 77K 형광 분광기 및 아연 황산염 및 쿠마시 블루에 의해 얼룩진 SDS-PAGE에 의해 물리 코빌리단백질의 무결성과 특성을 확인하기 위한 단계별 절차가 제공됩니다. 격리된 피코빌리솜은 또한 추가 구조 및 조성 분석을 실시할 수 있다. 전반적으로,이 프로토콜은 치아 노 박테리아에 익숙하지 않은 연구원이 신속하게 분리하고 그대로 피코빌리솜을 특성화 할 수있는 유용한 시작 가이드를 제공합니다.

Syn6803 및 JSC-1 세포는 30°C에서 B-HEPES 배지에서 일정한 교반을 하는 원추형 플라스크에서 재배되었으며, LED 백색광(50 μmol 광자 m-2s-1)에서 1%(v/v) CO2로 채워진 성장 챔버에서 재배하였다. 기하급수적 성장 단계(OD750 = ~0.5)에서, 세포는 최종 광학 밀도 OD750 = ~0.2를 가진 신선한 배지로 하위 배양되었다. 후기 지수 성장 단계(OD750 = 0.6-0.8)에 도달한 후 배양...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

그것은 시안 균에 익숙하지 않은 사람들이 쉽게 phycobilisome를 분리 할 수 있도록 간단하고 빠른 프로토콜입니다. 이 기술의 장점은 작은 규모에 적응하고 수행하기 쉽다는 것입니다. 모델 및 비모델 시노박테리아의 피코빌리좀을 그대로 분리하는 간단하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 방법입니다.먼저 750나노미터에서 0.8OD의 세포 배양을 1리터 플라스크로 전송하여 B-HEPES 배지 의 500밀리리터로 희석하여 750나노미터에서 0.2의 OD를 달성한다. OD가 0.8에서 1에 도달할 때까지 일정한 교반으로 문화를 성장하여 후기 기하급수적 성장 단계를 나타냅니다. 원심 분리는 실온에서 20 분 동안 10, 000 배 g의 속도로 문화를 원심분리하고 상체를 폐기합니다.세포 펠릿을 일시 중단하고 0.75 대구칼륨 인산염 완충제, pH 7로 두 번 세척한다. 실온에서 원심화로 50 밀리리터 원심분리기 튜브의 세포를 펠렛. 상체를 버리고 0.75 개의 어금니 칼륨 인산염 버퍼로 세포를 다시 중단하십시오.전자 균형에 의해 펠릿의 젖은 무게를 측정하고 완충제의 5 밀리리터에서 펠릿의 1 그램 젖은 무게를 다시 중단합니다. 셀 서스펜션 1밀리리터와 0.4~0.6그램의 0.1 밀리미터 유리 구슬을 2밀리리터 스크류 캡 바이알에 넣습니다. 비드 비터에 의해 30 초 동안 셀을 끊습니다.실내 온수 욕조에서 2분간 튜브를 식힙니다. 용해 후, 500 배 g의 속도로 실온에서 10 초 동안 유리병을 원심 분리합니다. 파이펫으로 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 수집합니다.구슬은 0.75의 0.75 개의 어금니 칼륨 인산염 버퍼로 한 번 씻은 다음 동일한 원심 분리 튜브로 옮겨냅니다. 트리톤 X-100을 용액 이면에 트리톤 X-100을 추가하고 실온에서 흔들 셰이커에 인큐베이션하고 20분 동안 40 RPM을 배양합니다. 17, 210배g에서 20분 동안 튜브를 원심분리하고 상온에서 상부 트리톤 미셀 층없이 상류층을 최대 1시간 동안 보관합니다.pH 7에서 0.75 의 어금강 칼륨 인산염 완충제에서 4개의 자당 농도를 만듭니다. 40 밀리리터 원심분리기 튜브 의 바닥에 두 개의 어금니 자당 버퍼2.8 밀리리터를 놓고 3 층의 자당 솔루션으로 오버레이하십시오. 마지막으로, 생성된 그라데이션을 통해 상체 분획을 포함하는 PBS 3밀리리터를 추가하고 원심분리기를 추가합니다.초환화시, 분획된 PBS와 물리코빌리단백질을 층 사이에 응축시키고 Syn6803 및 인터페이스에서 파란색 밴드를 관찰한다. 0.75 대구칼륨 인산염 완충제와 막원심 필터 단위로 분획을 반복적으로 집중하고 희석시켜 자당을 제거한다. PBS 형광을 측정하기 위해 농축 된 PBS 샘플을 0.75 개의 어금니 칼륨 인산염 버퍼로 희석하여 최대 500 마이크로 리터 부피를 구성합니다.희석된 PBS 샘플을 투명 유리 튜브에 추가하고 완전히 동결될 때까지 액체 질소로 튜브를 고정시하십시오. 냉동 튜브를 액체 질소로 미리 채워진 투명 한 분해 용기로 이동합니다. 완전한 셀 용해는 중도화 전에 상골과 짙은 파란색 녹색 색상을 보여줍니다.격리된 PBS의 자당 밀도 그라데이션 분리는 해리된 물리코빌리단백질의 여러 분획을 나타내며 가장 낮은 분획은 그대로 PBS를 나타낸다. JSC 1 과 Syn6803의 해리 및 그대로 PBS로부터의 흡수 스펙트럼은 622 나노미터에서 동일한 피크를 가지며, 이는 피코시아닌에 해당한다. 더욱이, JSC-1의 해리 및 온전한 PBS 모두에서 571 나노미터에서 물리에리스린 흡수 피크.해리된 PBS의 방출 스펙트럼은 Phycocyanin에서 방출을 나타내는 Syn6803 및 JSC-1에서 약 650 나노미터에서 1개의 강한 피크를 가지고 있습니다. 651나노미터 및 684나노미터의 형광 방출 최대 피크는 피코시아닌에 의해 수확된 에너지가 ApcD 및 ApcE인 알로피코시아니안 및 말단 방출기로 효율적으로 전달되었다는 것을 보여줍니다. 이 수치는 자외선 조사 하에 아연 스테인드 SDS-PAGE를 나타내며, 여기서 phycobiliprotein 하위 단위는 강하게 형광이고 ApcE는 화살로 표시된 약한 형광을 보였다.쿠마시 블루 스테닝은 상부 분획이 다른 비PBS 용해성 단백질을 포함하고 그대로 PBS와 Syn6803은 화살로 표시된 저명한 ApcE 밴드를 나타내며, 해리된 PBS 분획이 부족하다는 것을 보여준다. 초원심분리는 1:3의 비율로 제조된 자당 그라데이션이 1:10의 비율로 만들어진 그라데이션보다 더 넓은 밴드를 표시한다는 것을 보여줍니다. 세포와 솔보리시스를 완전히 통해 더 많은 물리코빌리좀을 얻는 것이 중요합니다.저온-EM 또는 혼합 분광법과 같은 다른 방법은 피코빌리좀의 단백질 구조 또는 단백질 조성을 연구하는 데 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

연구

생물학

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

조직학적 검사 및 면역 조직화학을 위한 통합 안구 표면 조직을 얻기 위한 손상되지 않은 안구의 분리

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...