Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Forfatterne takker Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University for praktisk bruk av ultracentrifuge. De cyanobakterielle stammene Synechocystis sp. PCC 6803 og Leptolyngbya sp. JSC-1 ble begavet fra henholdsvis Dr. Chu, Hsiu-An ved Academia Sinica, Taiwan og Dr. Donald A. Bryant ved Pennsylvania State University, USA. Dette arbeidet ble finansiert av Vitenskaps- og teknologidepartementet (Taiwan) (109-2636-B-002-013- og 110-2628-B-002-065-) og Utdanningsdepartementet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 og 110V1102).

Synechocystis sp. PCC 6803, den modellglukosetolerante stammen, ble hentet fra Dr. Chu, Hsiu-An ved Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, den ikke-modell filamentøse, ble hentet fra Dr. Donald A. Bryant ved Pennsylvania State University, USA.
1. Cellekultur og høsting
<ol><li>Inokuler Syn6803- eller JSC-1-celler ved hjelp av en metallisk inokulasjonssløyfe i en 100 ml konisk kolbe som inneholder 50 ml B-HEPES medium28. ...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+from+blue-green+and+red+algae:+Isolation+criteria+and+dissociation+characteristics.">Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics.</a> Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).</li><li>Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat.">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li><li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins.">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li><li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka,+Gujarat,+India.">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li><li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).</li><li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits.">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata.">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).</li><li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en enkel og standard metode for å isolere intakt PBS i to typer cyanobakterier, encellet modell Syn6803 og filamentøs ikke-modell JSC-1. De kritiske trinnene i protokollen er cellehomogenisering og ultracentrifugation på en diskontinuerlig tetthet gradient av sukrose. Generelt er forstyrrelsen av filamentøse celler mer komplisert enn encellede. Å øke mengden av startmaterialet (den våte vekten av cellepelleten) og gjentakelsen av perleslag var nyttig for å øke utbyttet av PBS fra fila...

Fykobilisom (PBS) er et stort vannløselig pigmentproteinkompleks som festes til den cytoplasmatiske siden av fotosystemene i thylakoidmembranene i cyanobakterier1. PBS består hovedsakelig av fargede fykobiliproteiner og fargeløse linkerproteiner1,2. Phycobiliproteins kan deles inn i fire store grupper: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin og allophycocyanin3. De fire store gruppene absorberer forskjellige bølgelengder av lysenergi i området 490-650 nm, som klorofyller absorberte ineffektivt3. PBS kan fungere som en lett høstende antenne for å samle lysenergi og levere den til Photosystem II og I4.
Strukturen og sammensetningen av PBS varierer fra art til art. Samlet har tre former for fykobilisom (hemidiscodial, buntformet og stangformet) blitt identifisert i forskjellige cyanobakterielle arter5. Selv i samme art endres sammensetningen av PBS som respons på miljøet, for eksempel lyskvalitet og næringsnedbrytning6,7,8,9,10,11. Derfor har den eksperimentelle prosedyren for å isolere PBS fra cyanobakterier vært medvirkende til å studere PBS12. I løpet av flere tiår har mange forskjellige protokoller isolert PBS og analysert sin struktur, sammensetning og funksjon6,7,8,12,13,14,15,16,17. Det brede utvalget av metoder for PBS-isolasjon gir faktisk fleksibilitet til å isolere komplekset i forskjellige arter med forskjellige reagenser og instrumenter. Imidlertid gjør det også å velge en passende protokoll vanskeligere for forskere som ikke er kjent med cyanobakterier og PBS. Derfor er en generalisert og grei protokoll utviklet i dette arbeidet for de som er interessert i å starte PBS-isolasjon fra cyanobakterier.
Metodene for å isolere PBS fra tidligere publikasjoner er oppsummert her. Siden PBS er et vannløselig proteinkompleks og lett dissosieres, er det nødvendig med en høy ionisk styrkefosfatbuffer for å stabilisere PBS under ekstraksjon18. Flere forskningsartikler som beskriver metoder for isolering av PBS fra cyanobakterier har tidligere blitt publisert. De fleste metodene krever en høy konsentrasjon av fosfatbuffer8,14,15,18,19. Prosedyrene for mekanisk forstyrrelse av cellene varierer imidlertid, for eksempel glassperler-assistert ekstraksjon, sonikering20 og fransk presse6,8,14. Ulike fykobiliproteiner kan oppnås ved nedbør med ammoniumsulfat20 og renses av HPLC21 eller en kromatografisk kolonne22. På den annen side kan intakt PBS enkelt isoleres ved sukrosetetthetsgradient ultracentrifugation6,8,15.
I denne protokollen ble en modell cyanobakterie og en ikke-modell cyanobakterier brukt som materialer for PBS-isolasjon. De er modell unicellular glukose-tolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (heretter Syn6803) og ikke-modell filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (heretter JSC-1), henholdsvis7,23,24. Protokollen begynner med forstyrrelser av den unicellulære og filamentøse cyanobakterien i en høyionisk styrkefosfatbuffer. Etter lysis samles supernatantene ved sentrifugering og behandles deretter med et ikke-ionisk vaskemiddel (Triton X-100) for å løse de vannløselige proteinene fra thylakoidmembranene. De totale vannløselige proteinene påføres en diskontinuerlig sukrosetetthetsgradient for å fraksjonere PBS. Den diskontinuerlige sukrosegradienten i denne protokollen består av fire sukroseløsninger og partisjonerer den intakte PBS i de laveste fraksjonene av sukroselag25. Integriteten til PBS kan analyseres av SDS-PAGE, sinkfarging og 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denne metoden er egnet for forskere som tar sikte på å isolere intakt PBS fra cyanobakterier og studere dens spektrale, strukturelle og komposisjonelle egenskaper.
Det er flere fordeler med denne protokollen. (1) Denne metoden er standardisert og kan brukes til å isolere intakt PBS fra både encellet og filamentøs cyanobakterier. De fleste artiklene beskriver metoden som gjaldt i enten en type cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denne metoden utføres ved romtemperatur, da PBS dissosierer ved lav temperatur19,27. (3) Denne metoden beskriver bruk av en perle-beater for å forstyrre cellene; Derfor er det billigere og tryggere enn høytrykks fransk presse og mulig hørselsskade fra soniker i andre metoder8,13,14,20. (4) Denne metoden isolerer intakt PBS ved sukrose gradient ultra-sentrifugering. På denne måten kan intakt PBS med forskjellige størrelser og delvis dissosiert PBS skilles basert på sukrosekonsentrasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

I cyanobakterier er fykobilisom et viktig antenneproteinkompleks som høster lys og overfører energi til fotosystem I og II for fotokjemi. Å studere strukturen og sammensetningen av fykobilisome er av stor interesse for forskere fordi det avslører utviklingen og divergensen av fotosyntese i cyanobakterier. Denne protokollen gir en detaljert og optimalisert metode for å bryte cyanobakterielle celler til lav pris av en perle-beater effektivt. Det intakte fykobilisomet kan deretter isoleres fra celleekstraktet ved sukrose gradient ultracentrifugation. Denne metoden har vist seg å være egnet for både modell og ikke-modell cyanobakterier med forskjellige celletyper. En trinnvis prosedyre er også gitt for å bekrefte integriteten og egenskapen til phycobiliproteins av 77K fluorescensspektroskopi og SDS-PAGE farget av sinksulfat og Coomassie Blue. Det isolerte fykobilisomet kan også utsettes for ytterligere strukturelle og komposisjonsanalyser. Totalt sett gir denne protokollen en nyttig startveiledning som gjør det mulig for forskere som ikke er kjent med cyanobakterier å raskt isolere og karakterisere intakt fykobilisom.

Syn6803- og JSC-1-cellene ble dyrket i koniske kolber med konstant omrøring i B-HEPES medium ved 30 °C, under et LED-hvitt lys (50 μmol fotoner m-2s-1) i et vekstkammer fylt med 1% (v/v) CO2. I den eksponentielle vekstfasen (OD750 = ~ 0,5) ble cellene subkulturert i friskt medium med en endelig optisk tetthet OD750 = ~ 0,2. Etter å ha nådd den sene eksponentielle vekstfasen (OD750 = 0,6-0,8), ble kulturene samlet inn og sentrifugert (10.000 x g </...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Den nåværende protokollen beskriver isolering av fykobilisomer fra cyanobakterier ved sentrifugering gjennom en diskontinuerlig sukrosetetthetsgradient. Fraksjonene av intakte fykobilisomer bekreftes av 77K fluorescerende utslippsspekter og SDS-PAGE-analyse. De resulterende fykobilisomfraksjonene er egnet for negativ farging av TEM og massespektrometrianalyse.

Isolasjon og karakterisering av intakt fykobilisom i cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Det er en enkel og rask protokoll som gjør at folk som ikke er kjent med cyanobakterier, kan isolere fykobilisom i ro. Fordelen med denne teknikken er at den er tilpasset en liten skala, og den er lett å utføre. Det er en enkel, pålitelig og effektiv metode for å isolere intakte fykobilisomer av modell og ikke-modell cynobakterier.Begynn med å overføre cellekulturen på 0,8 OD ved 750 nanometer til en liter kolbe og fortynn den i 500 milliliter B-HEPES medium for å oppnå OD på 0,2 ved 750 nanometer. Vokse kulturen med konstant omrøring ved 30 grader Celsius til OD når 0,8 til 1, noe som indikerer en sen eksponentiell vekstfase. Sentrifuger kulturen med en hastighet på 10.000 ganger g i 20 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.Suspender cellepellets og vasket to ganger med 0,75 molar kaliumfosfatbuffer, pH syv. Pellet cellene i et 50 milliliter sentrifugerør ved sentrifisering ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspend cellene med 0,75 molar kaliumfosfatbuffer.Mål pellets våte vekt ved en elektronisk balanse og resuspend den ene gram våte vekten av pellet i fem milliliter av bufferen. Tilsett en milliliter celleoppheng og 0,4 til 0,6 gram 0,1 millimeter glassperler i et to milliliter skruehett hetteglass. Bryt cellene i 30 sekunder med en perle beater.La rørene avkjøles i et vannbad med romtemperatur i to minutter. Etter lysis, sentrifuger hetteglassene i 10 sekunder ved romtemperatur med en hastighet på 500 ganger g. Samle supernatanten med en pipette i et 15 milliliter sentrifugerør.Vask perlene med 0,5 milliliter 0,75 molar kaliumfosfatbuffer en gang, deretter overført til samme sentrifugerør. Legg Triton X-100 til den lysede cellefjæringen og inkuber på en gynge shaker ved romtemperatur og 40 RPM i 20 minutter eller til løsningen blir homogen. Sentrifuger rørene i 20 minutter ved 17 210 ganger g og oppbevar supernatanten uten det øvre Triton-micellelaget ved romtemperatur i opptil en time.Lag fire konsentrasjoner av sukrose i 0,75 molar kaliumfosfatbuffer ved pH syv. Plasser 2,8 milliliter to molar sukrose buffer på bunnen av 40 milliliter sentrifugerør og overlegg med tre lag med sukroseløsninger. Til slutt legger du til tre milliliter PBS som inneholder den supernatante brøkdelen og sentrifugerer de resulterende gradientene.Ved ultrasentrifisering kondenserer du de fraksjonerte PBS- og fykobiliproteinene mellom lagene og observerer de blå båndene i Syn6803 og grensesnitt. Fjern sukrose ved gjentatte ganger å konsentrere og fortynne fraksjonene med 0,75 molar kaliumfosfatbuffer og membran sentrifugalfilterenhetene. For måling av PBS fortynner fluorescens den konsentrerte PBS-prøven med 0,75 molar kaliumfosfatbuffer for å utgjøre opptil 500 mikroliters volum.Tilsett den fortynnede PBS-prøven til et gjennomsiktig glassrør og frys røret i flytende nitrogen til det er helt frosset. Flytt det frosne røret til en gjennomsiktig dewar-beholder som er ferdigfylt med flytende nitrogen. Komplett cellelys viser den supernatante og mørkeblågrønne fargen før sentrifisering.Sukrose tetthet gradient separasjon av isolert PBS viser flere brøkdeler av dissosierte phycobiliproteins og den laveste brøkdelen representerer intakt PBS. Absorpsjonsspektraet fra de dissosierte og intakte PBS av JSC en og Syn6803 har samme topp på 622 nanometer, tilsvarende fycocyanin. Videre topper fycoerythrin absorpsjonen på 571 nanometer i både dissosierte og intakte PBS av JSC-1.Utslippsspektraet til den dissosierte PBS har en sterk topp på ca. 650 nanometer i Syn6803 og JSC-1, som representerer utslippene fra fycocyanin. De fluorescerende utslippsmaksimale toppene på 651 nanometer og 684 nanometer avslører at energien høstet av fycocyanin ble overført effektivt til allophycocyanin og terminale emittere, som er ApcD og ApcE, i kjernen. Figuren viser sinkfarget SDS-SIDE under UV-bestråling der phycobiliprotein-underenhetene er sterkt fluorescerende og ApcE viste svak fluorescens, indikert med pilen.Kumasi blå farging viser at de øvre fraksjonene inneholder andre ikke-PBS vannløselige proteiner og intakt PBS og Syn6803 viser et fremtredende ApcE-bånd, indikert med en pil, som mangler i de dissosierte PBS-fraksjonene. Ultracentrifugation viser at sukrosegradienten som er klargjort med et forhold på 1:3, viser bredere bånd enn graderingen som er laget med et forhold på 1:10. Det er viktig å lysis cellene og solvolyse supernatantene helt for å oppnå flere fykobilisomer.Andre metoder, som kryo-EM eller blandet spektrometri, kan brukes til å studere proteinstrukturen eller proteinsammensetningen av fykobilisomer.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolering og karakterisering av RNA som inneholder Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolasjon, Kultur, og Funksjonell karakterisering av voksne musen Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection av nitrogenoksid og Superoxide i endothelial lag av intakte Arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolering og karakterisering av mikrovesikler fra perifert blod

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolering av intakt, hele musen brystkjertlene for analyse av ekstracellulær Matrix uttrykk og kjertel morfologi

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA komprimering i Cyanobakterie av høyspent Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Isolering av intakt øyeeplet å få Integral øye Surface tissue for histologiske eksamen og immunhistokjemi

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolasjon og karakterisering av voksen hjertefibroblaster og myofibroblaster

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering av eksosomer fra skjelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolasjon og karakterisering av musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...