Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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Os autores agradecem à Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University pelo uso conveniente da ultracentrifuge. As cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 e Leptolyngbya sp. JSC-1 foram doadas pelo Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan, e pelo Dr. Donald A. Bryant da Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA, respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (Taiwan) (109-2636-B-002-013- e 110-2628-B-002-065-) e pelo Programa Acadêmico Jovem do Ministério da Educação (Taiwan) Yushan Young Scholar (109V1102 e 110V1102).

O Synechocystis sp. PCC 6803, o modelo de cepa tolerante à glicose, foi obtido do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, o não-modelo filamentous, foi obtido do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA.
1. Cultura celular e colheita
<ol><li>Inoculação Células Syn6803 ou JSC-1 usando um laço de inoculação metálica em um frasco cônico de 100 mL contendo 50 mL de B-HEPES médio...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. 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PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Este protocolo descreve um método simples e padrão para isolar PBS intacto em dois tipos de cianobactérias, modelo unicelular Syn6803 e não-modelo filamentous JSC-1. As etapas críticas do protocolo são a homogeneização celular e a ultracentrifugação em um gradiente de densidade descontínua de sacarose. Geralmente, a interrupção das células filamentosas é mais complicada do que as unicelulares. O aumento da quantidade do material inicial (o peso úmido da pelota celular) e a repetição da batida de contas ...

Ficobilisome (PBS) é um enorme complexo de proteína pigmento solúvel em água que se liga ao lado citoplasmático dos fotossistemas nas membranas thylakoidas de cianobactérias1. A PBS é composta principalmente de ficobiliproteínas coloridas e proteínas de linker incolor1,2. As ficobiliproteínas podem ser divididas em quatro grandes grupos: ficoerthrina, ficoerytrocyanina, ficocitanina e alofilianina3. Os quatro principais grupos absorvem diferentes comprimentos de onda de energia leve na faixa de 490-650 nm, que clorofilas absorviam ineficientemente3. O PBS pode servir como uma antena de captação de luz para coletar energia leve e entregá-la ao Photosystem II e I4.
A estrutura e a composição da PBS variam de espécie para espécie. Coletivamente, três formas de ficobiliso (hemidiscodial, em forma de feixe e em forma de vara) foram identificadas em diferentes espécies cianobacterianas5. Mesmo na mesma espécie, a composição da PBS muda em resposta ao meio ambiente, como qualidade da luz e esgotamento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Portanto, o procedimento experimental para isolar a PBS das cianobactérias tem sido fundamental no estudo do PBS12. Ao longo de várias décadas, diversos protocolos isolaram a PBS e analisaram sua estrutura, composição e função6,7,8,12,13,14,15,16,17. A grande variedade de métodos para o isolamento da PBS de fato proporciona flexibilidade na isolação do complexo em diferentes espécies com diferentes reagentes e instrumentos. No entanto, também torna a escolha de um protocolo adequado mais difícil para cientistas que não estão familiarizados com cianobactérias e PBS. Portanto, um protocolo generalizado e direto é desenvolvido neste trabalho para os interessados em iniciar o isolamento da PBS a partir de cianobactérias.
Os métodos para isolar a PBS de publicações anteriores são resumidos aqui. Uma vez que o PBS é um complexo proteico solúvel em água e é prontamente dissociado, um tampão de fosfato de alta resistência iônica é necessário para estabilizar a PBS durante a extração18. Vários artigos de pesquisa que descrevem métodos para o isolamento da PBS de cianobacterium foram publicados no passado. A maioria dos métodos requer uma alta concentração de tampão fosfato8,14,15,18,19. No entanto, os procedimentos para interrupção mecânica das células variam, como extração assistida por contas de vidro, sonicação20 e prensa francesa6,8,14. Diferentes ficobiliproteínas podem ser obtidas por precipitação com sulfato de amônio20 e purificadas por HPLC21 ou uma coluna cromatográfica22. Por outro lado, a PBS intacta pode ser facilmente isolada por ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose6,8,15.
Neste protocolo, um modelo de cianobacterium e um cianobacterium não modelo foram utilizados como materiais para o isolamento da PBS. São eles modelo unicelular tolerante à glicose Synechocystis sp. PCC 6803 (doravante Syn6803) e não-modelo filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (doravante JSC-1), respectivamente7,23,24. O protocolo começa pela interrupção das cianobactérias unicelulares e filamentosas em um tampão fosfato de alta resistência iônica. Após a lise, os supernacantes são coletados por centrifugação e, em seguida, tratados com um detergente noniônico (Triton X-100) para solubilizar as proteínas solúveis em água das membranas thylakoid. As proteínas solúveis em água totais são aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar o PBS. O gradiente de sacarose descontínuo neste protocolo consiste em quatro soluções de sacarose e partições o PBS intacto nas frações mais baixas da camada de sacarose25. A integridade do PBS pode ser analisada por SDS-PAGE, manchas de zinco e espectroscopia de fluorescência de 77K6,7,8,26. Este método é adequado para cientistas que visam isolar o PBS intacto das cianobactérias e estudar suas propriedades espectrais, estruturais e composicionais.
Há várias vantagens deste protocolo. (1) Este método é padronizado e pode ser usado para isolar PBS intacto tanto de cianobactérias unicelulares quanto filamentosas. A maioria dos artigos descreve o método aplicado em qualquer um tipo de cianobactéria4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método é realizado à temperatura ambiente, uma vez que o PBS se dissocia a baixa temperatura19,27. (3) Este método descreve o uso de um batedor de contas para interromper as células; portanto, é mais barato e mais seguro do que a imprensa francesa de alta pressão e possíveis danos auditivos do sonicator em outros métodos8,13,14,20. (4) Este método isola a PBS intacta por ultra centrifugação gradiente de sacarose. Desta forma, pbs intacto com diferentes tamanhos e PBS parcialmente dissociado pode ser separado com base na concentração de sacarose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

Em cianobactérias, o ficobiliso é um complexo proteico de antena vital que colhe luz e transfere energia para fotossistema I e II para fotoquímica. Estudar a estrutura e a composição do ficobilisome é de grande interesse para os cientistas porque revela a evolução e divergência da fotossíntese nas cianobactérias. Este protocolo fornece um método detalhado e otimizado para quebrar células cianobacterianas a baixo custo por um batedor de contas de forma eficiente. O ficobiliso intacto pode então ser isolado do extrato celular por ultracentrifugação gradiente de sacarose. Este método demonstrou ser adequado tanto para cianobactérias modelo quanto não modelo com diferentes tipos de células. Um procedimento passo a passo também é fornecido para confirmar a integridade e propriedade de ficobiliproteínas por espectroscopia de fluorescência de 77K e SDS-PAGE manchada por sulfato de zinco e Coomassie Blue. O ficobiliso isolado também pode ser submetido a novas análises estruturais e composicionais. No geral, este protocolo fornece um guia de partida útil que permite aos pesquisadores não familiarizados com cianobactérias isolar e caracterizar ficobilisma intacta.

As células Syn6803 e JSC-1 foram cultivadas em frascos cônicos com agitação constante em meio B-HEPES a 30 °C, sob uma luz branca led (50 fótons de μmol m-2s-1) em uma câmara de crescimento preenchida com 1% (v/v) CO2. Na fase de crescimento exponencial (OD750 = ~0,5), as células foram subculturadas em meio fresco com densidade óptica final OD750 = ~0,2. Após atingir a fase de crescimento exponencial tardio (OD750 = 0,6-0,8), as culturas foram c...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

É um protocolo simples e rápido que permite que pessoas desconhecidas com cianobactérias isolem o ficobiliso à vontade. A vantagem dessa técnica é que ela é adaptada a uma pequena escala e é fácil de executar. É um método simples, confiável e eficiente para isolar ficobilisos intactos de cinoobactérias modelo e não-modelo.Comece transferindo a cultura celular de 0,8 OD a 750 nanômetros em um frasco de um litro e dilua-o em 500 mililitros de meio B-HEPES para alcançar o OD de 0,2 a 750 nanômetros. Cresça a cultura com agitação constante a 30 graus Celsius até que o OD atinja 0,8 a 1, indicando uma fase de crescimento exponencial tardio. Centrifugar a cultura a uma velocidade de 10.000 vezes g por 20 minutos em temperatura ambiente e descartar o supernatante.Suspenda as pelotas celulares e lave duas vezes com tampão de fosfato de potássio molar de 0,75, pH sete. Pellet as células em um tubo centrífugo de 50 mililitros por centrificação à temperatura ambiente. Descarte o supernascimento e resuspenque as células com 0,75 tampão de fosfato de potássio molar.Meça o peso úmido da pelota por um equilíbrio eletrônico e resuspenda o peso úmido de um grama da pelota em cinco mililitros do tampão. Adicione um mililitro de suspensão celular e 0,4 a 0,6 gramas de contas de vidro de 0,1 milímetro em um frasco de tampa de parafuso de dois mililitros. Quebre as células por 30 segundos por um batedor de contas.Deixe os tubos esfriarem em um banho de água em temperatura ambiente por dois minutos. Após a lise, centrifugar os frascos por 10 segundos à temperatura ambiente a uma velocidade de 500 vezes g. Colete o supernatante com uma pipeta em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Lave as contas com 0,5 mililitros de 0,75 tampão de fosfato de potássio molar uma vez, depois transferido para o mesmo tubo de centrífugas. Adicione Triton X-100 à suspensão celular e incuba em um agitador de balanço à temperatura ambiente e 40 RPM por 20 minutos ou até que a solução se torne homogênea. Centrifugar os tubos por 20 minutos a 17,210 vezes g e armazenar o supernante sem a camada de micelle Triton superior à temperatura ambiente por até uma hora.Faça quatro concentrações de sacarose em 0,75 tampão de fosfato de potássio molar em pH sete. Coloque 2,8 mililitros de dois tampão de sacarose molar na parte inferior do tubo de centrífuga de 40 mililitros e sobreposição com três camadas de soluções de sacarose. Por fim, adicione três mililitros de PBS contendo a fração sobrenanante e centrifugar os gradientes resultantes.Após a ultracentrificação, condensar as PBS fracionadas e ficobiliproteínas entre as camadas e observar as bandas azuis em Syn6803 e interfaces. Remova a sacarose concentrando e diluindo repetidamente as frações com tampão de fosfato de potássio molar de 0,75 molar e membrana das unidades do filtro centrífuga. Para medir a fluorescência PBS diluir a amostra concentrada de PBS com 0,75 tampão de fosfato de potássio molar para fazer até 500 microliters volume.Adicione a amostra de PBS diluída a um tubo de vidro transparente e congele o tubo em nitrogênio líquido até que esteja totalmente congelado. Mova o tubo congelado para um recipiente transparente de de guerra pré-preenchido com nitrogênio líquido. A lise celular completa mostra a cor azul-verde-azul-escura sobrenatante e escura antes da centrificação.A separação gradiente de densidade de sacarose da PBS isolada mostra várias frações de ficobiliproteínas dissociadas e a fração mais baixa representa o PBS intacto. Os espectros de absorção do PBS dissociado e intacto de JSC um e Syn6803 têm o mesmo pico de 622 nanômetros, correspondente à ficocitanina. Além disso, o pico de absorção de ficoerythrin em 571 nanômetros em PBS dissociado e intacto de JSC-1.Os espectros de emissões do PBS dissociado têm um forte pico de aproximadamente 650 nanômetros em Syn6803 e JSC-1, representando a emissão de ficocitanina. Os picos máximos de emissão fluorescente de 651 nanômetros e 684 nanômetros revelam que a energia colhida pela ficocitanina foi transferida eficientemente para a aofilia e emissores terminais, que são ApcD e ApcE, no núcleo. A figura mostra sds-page manchado de zinco sob irradiação UV onde as subunidades de ficobiliproteína são fortemente fluorescentes e o ApcE mostrou fluorescência fraca, indicada com a seta.A coloração azul de Kumasi mostra que as frações superiores contêm outras proteínas solúveis em água não-PBS e a PBS intacta e Syn6803 mostra uma faixa ApcE proeminente, indicada com uma seta, faltando nas frações dissociadas da PBS. A ultracentrifugação demonstra que o gradiente de sacarose preparado em uma proporção de 1:3 exibe faixas mais largas do que o gradiente feito a uma proporção de 1:10. É importante lise as células e solvolise os supernatantes completamente para obter mais ficobilisários.Outros métodos, como crio-EM ou espectrometria mista, podem ser usados para estudar a estrutura proteica ou a composição proteica de ficobilisos.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biologia

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...