Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
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Los autores agradecen a Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University por el uso conveniente de la ultracentrífuga. Las cepas de cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 y Leptolyngbya sp. JSC-1 fueron donadas por el Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán, y el Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE.UU., respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Taiwán) (109-2636-B-002-013- y 110-2628-B-002-065-) y el Programa de Jóvenes Becarios Yushan del Ministerio de Educación (Taiwán) (109V1102 y 110V1102).

La Synechocystis sp. PCC 6803, la cepa modelo tolerante a la glucosa, se obtuvo del Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán. Leptolyngbya sp. JSC-1, el filamentoso no modelo, se obtuvo del Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE. UU.
1. Cultivo celular y cosecha
<ol><li>Inocular células Syn6803 o JSC-1 utilizando un bucle de inoculación metálico en un matraz cónico de 100 mL que contiene 50 mL de medio B-HEPES28.<sup cl...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. 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R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. 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PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Este protocolo describe un método simple y estándar para aislar PBS intacto en dos tipos de cianobacterias, el modelo unicelular Syn6803 y el filamentoso no modelo JSC-1. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización celular y la ultracentrifugación en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. En general, la interrupción de las células filamentosas es más complicada que las unicelulares. El aumento de la cantidad del material de partida (el peso húmedo del pellet celular) y la repetición del b...

El ficobilisoma (PBS) es un enorme complejo pigmentario-proteico soluble en agua que se une al lado citoplasmático de los fotosistemas en las membranas tilacoides de las cianobacterias1. El PBS se compone principalmente de ficobiliproteínas coloreadas y proteínas enlazadoras incoloras1,2. Las ficobiliproteínas se pueden dividir en cuatro grupos principales: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina y aloficocianina3. Los cuatro grupos principales absorben diferentes longitudes de onda de energía lumínica en el rango de 490-650 nm, que las clorofilas absorbieron de manera ineficiente3. El PBS puede servir como una antena de recolección de luz para recolectar energía de la luz y entregarla al Photosystem II e I4.
La estructura y composición de PBS varían de una especie a otra. En conjunto, se han identificado tres formas de ficobilisoma (hemidiscodial, en forma de haz y en forma de varilla) en diferentes especies de cianobacterias5. Incluso en la misma especie, la composición del PBS cambia en respuesta al medio ambiente, como la calidad de la luz y el agotamiento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, el procedimiento experimental para aislar PBS de cianobacterias ha sido fundamental en el estudio de PBS12. Durante varias décadas, muchos protocolos diferentes han aislado PBS y analizado su estructura, composición y función6,7,8,12,13,14,15,16,17. La amplia variedad de métodos para el aislamiento de PBS proporciona flexibilidad para aislar el complejo en diferentes especies con diferentes reactivos e instrumentos. Sin embargo, también hace que la elección de un protocolo adecuado sea más difícil para los científicos que no están familiarizados con las cianobacterias y el PBS. Por lo tanto, se desarrolla un protocolo generalizado y sencillo en este trabajo para aquellos interesados en iniciar el aislamiento de PBS de cianobacterias.
Los métodos para aislar PBS de publicaciones anteriores se resumen aquí. Dado que pbS es un complejo de proteínas solubles en agua y se disocia fácilmente, se requiere un tampón de fosfato de alta fuerza iónica para estabilizar PBS durante la extracción18. Varios artículos de investigación que describen métodos para el aislamiento de PBS de cianobacterias se han publicado en el pasado. La mayoría de los métodos requieren una alta concentración de tampón de fosfato8,14,15,18,19. Sin embargo, los procedimientos para la alteración mecánica de las células varían, como la extracción asistida por perlas de vidrio, la sonicación20 y la prensa francesa6,8,14. Se pueden obtener diferentes ficobiliproteínas por precipitación con sulfato de amonio20 y purificadas por HPLC21 o una columna cromatográfica22. Por otro lado, el PBS intacto se puede aislar fácilmente mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa6,8,15.
En este protocolo, se utilizaron un modelo de cianobacteria y un modelo de cianobacteria no modelo como materiales para el aislamiento de PBS. Son el modelo unicelular tolerante a la glucosa Synechocystis sp. PCC 6803 (en adelante Syn6803) y el no modelo filamentoso Leptolyngbya sp. JSC-1 (en adelante JSC-1), respectivamente7,23,24. El protocolo comienza por la interrupción de las cianobacterias unicelulares y filamentosas en un tampón de fosfato de alta resistencia iónica. Después de la lisis, los sobrenadantes se recogen por centrifugación y luego se tratan con un detergente no iónico (Tritón X-100) para solubilizar las proteínas solubles en agua de las membranas tilacoides. Las proteínas solubles en agua totales se aplican a un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo para fraccionar el PBS. El gradiente de sacarosa discontinua en este protocolo consiste en cuatro soluciones de sacarosa y particiona el PBS intacto en las fracciones más bajas de la capa de sacarosa25. La integridad de PBS se puede analizar mediante SDS-PAGE, tinción de zinc y espectroscopia de fluorescencia 77K6,7,8,26. Este método es adecuado para científicos que tienen como objetivo aislar PBS intacto de cianobacterias y estudiar sus propiedades espectrales, estructurales y de composición.
Hay varias ventajas de este protocolo. (1) Este método está estandarizado y se puede utilizar para aislar PBS intacto de cianobacterias unicelulares y filamentosas. La mayoría de los artículos describen el método que se aplicó en cualquiera de los dos tipos de cianobacterias4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método se realiza a temperatura ambiente, ya que el PBS se disocia a baja temperatura19,27. (3) Este método describe el uso de un batidor de cuentas para interrumpir las células; por lo tanto, es más barato y más seguro que la prensa francesa de alta presión y el posible daño auditivo del sonicador en otros métodos8,13,14,20. (4) Este método aísla PBS intacto por ultracentruga de gradiente de sacarosa. De esta manera, el PBS intacto con diferentes tamaños y PBS parcialmente disociado se puede separar en función de la concentración de sacarosa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

En las cianobacterias, el ficobilisoma es un complejo de proteína de antena vital que cosecha luz y transfiere energía al fotosistema I y II para la fotoquímica. El estudio de la estructura y composición del ficobilisoma es de gran interés para los científicos porque revela la evolución y divergencia de la fotosíntesis en las cianobacterias. Este protocolo proporciona un método detallado y optimizado para romper las células de cianobacterias a bajo costo por un batidor de cuentas de manera eficiente. El ficobilisoma intacto se puede aislar del extracto celular mediante ultracentrifugación por gradiente de sacarosa. Este método ha demostrado ser adecuado tanto para cianobacterias modelo como no modelo con diferentes tipos de células. También se proporciona un procedimiento paso a paso para confirmar la integridad y la propiedad de las ficobiliproteínas mediante espectroscopia de fluorescencia 77K y SDS-PAGE teñido por sulfato de zinc y azul coomassie. El ficobilisoma aislado también puede ser sometido a análisis estructurales y compositivos adicionales. En general, este protocolo proporciona una guía de inicio útil que permite a los investigadores que no están familiarizados con las cianobacterias aislar y caracterizar rápidamente el ficobilisoma intacto.

Las células Syn6803 y JSC-1 se cultivaron en matraces cónicos con agitación constante en medio B-HEPES a 30 °C, bajo una luz blanca LED (50 fotones μmol m-2s-1) en una cámara de crecimiento llena de 1% (v/v) de CO2. En la fase de crecimiento exponencial (OD750 = ~0.5), las células se subcultivaron en medio fresco con una densidad óptica final OD750 = ~0.2. Después de alcanzar la fase de crecimiento exponencial tardío (OD750 = 0,6-0,8), los cultiv...

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Es un protocolo simple y rápido que permite a las personas que no están familiarizadas con las cianobacterias aislar el ficobilisoma a gusto. La ventaja de esta técnica es que se adapta a pequeña escala y es fácil de realizar. Es un método simple, confiable y eficiente para aislar ficobilisomas intactos de cinobacterias modelo y no modelo.Comience transfiriendo el cultivo celular de 0,8 OD a 750 nanómetros en un matraz de un litro y diluya en 500 mililitros de medio B-HEPES para lograr el OD de 0,2 a 750 nanómetros. Cultive el cultivo con agitación constante a 30 grados Celsius hasta que el OD alcance 0.8 a 1, lo que indica una fase de crecimiento exponencial tardío. Centrifugar el cultivo a una velocidad de 10, 000 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.Suspenda los gránulos celulares y lávelos dos veces con tampón de fosfato de potasio molar 0,75, pH siete. Peletizar las células en un tubo centrífugo de 50 mililitros mediante centrifugación a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con un tampón de fosfato de potasio molar de 0,75.Mida el peso húmedo del pellet mediante una balanza electrónica y resuspenda el peso húmedo de un gramo del pellet en cinco mililitros del tampón. Agregue un mililitro de suspensión celular y de 0.4 a 0.6 gramos de perlas de vidrio de 0.1 milímetros en un vial de tapón de rosca de dos mililitros. Rompe las celdas durante 30 segundos con un batidor de cuentas.Deje que los tubos se enfríen en un baño de agua a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de la lisis, centrífuga los viales durante 10 segundos a temperatura ambiente a una velocidad de 500 veces g. Recoge el sobrenadante con una pipeta en un tubo centrífugo de 15 mililitros.Lave las perlas con 0,5 mililitros de tampón de fosfato de potasio molar 0,75 una vez, luego transfiera al mismo tubo de centrífuga. Agregue Triton X-100 a la suspensión de células lisadas e incube en un agitador oscilante a temperatura ambiente y 40 RPM durante 20 minutos o hasta que la solución se vuelva homogénea. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 17, 210 veces g y almacenar el sobrenadante sin la capa superior de micela Tritón a temperatura ambiente durante un máximo de una hora.Hacer cuatro concentraciones de sacarosa en tampón de fosfato de potasio molar 0.75 a pH siete. Coloque 2,8 mililitros de tampón de sacarosa molar en la parte inferior del tubo centrífugo de 40 mililitros y colóquelos con tres capas de soluciones de sacarosa. Finalmente, agregue tres mililitros de PBS que contengan la fracción sobrenadante y centrifugue los gradientes resultantes.Tras la ultracentrificación, condensar el PBS fraccionado y las ficobiliproteínas entre las capas y observar las bandas azules en Syn6803 e interfaces. Retire la sacarosa concentrando y diluyendo repetidamente las fracciones con tampón de fosfato de potasio molar 0.75 y membran las unidades de filtro centrífugo. Para medir la fluorescencia de PBS, diluya la muestra concentrada de PBS con un tampón de fosfato de potasio molar de 0,75 para obtener un volumen de hasta 500 microlitros.Agregue la muestra diluida de PBS a un tubo de vidrio transparente y congele el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado. Mueva el tubo congelado a un recipiente transparente de dewar prellenado con nitrógeno líquido. La lisis celular completa muestra el sobrenadante y el color azul verdoso oscuro antes de la centrificación.La separación del gradiente de densidad de sacarosa de PBS aislados muestra varias fracciones de ficobiliproteínas disociadas y la fracción más baja representa el PBS intacto. Los espectros de absorción del PBS disociado e intacto de JSC one y Syn6803 tienen el mismo pico a 622 nanómetros, correspondiente a la ficocianina. Además, el pico de absorción de ficoeritrina a 571 nanómetros en PBS disociados e intactos de JSC-1.Los espectros de emisión del PBS disociado tienen un pico fuerte de aproximadamente 650 nanómetros en Syn6803 y JSC-1, lo que representa la emisión de ficocianina. Los picos máximos de emisión fluorescente a 651 nanómetros y 684 nanómetros revelan que la energía recolectada por la ficocianina se transfirió de manera eficiente a la aloficocianina y a los emisores terminales, que son ApcD y ApcE, en el núcleo. La figura muestra SDS-PAGE teñido de zinc bajo irradiación UV donde las subunidades de ficobiliproteína son fuertemente fluorescentes y el ApcE mostró fluorescencia débil, indicada con la flecha.La tinción azul de Kumasi muestra que las fracciones superiores contienen otras proteínas no solubles en agua pbS y el PBS intacto y Syn6803 muestran una banda apcE prominente, indicada con una flecha, que carece de las fracciones disociadas de PBS. La ultracentrifugación demuestra que el gradiente de sacarosa preparado en una proporción de 1:3 muestra bandas más anchas que el gradiente realizado en una proporción de 1:10. Es importante la lisis de las células y la solvolisis de los sobrenadantes por completo para obtener más ficobilisomas.Otros métodos, como la crio-EM o la espectrometría mixta, se pueden utilizar para estudiar la estructura de las proteínas o la composición proteica de los ficobilisomas.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Investigación

Biología

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Aislamiento de intact eyeball para obtener tejido superficial ocular integral para el examen histológico y la inmunohistoquímica

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...