Name: isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Yazarlar, ultracentrifuge'un rahat kullanımı için Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University'ye teşekkür ediyor. Siyanobakteri suşları Synechocystis sp. PCC 6803 ve Leptolyngbya sp. JSC-1 sırasıyla Dr. Chu, Tayvan Academia Sinica'daki Hsiu-An ve ABD Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'nden Dr. Donald A. Bryant tarafından hediye edildi. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (Tayvan) (109-2636-B-002-013- ve 110-2628-B-002-065-) ve Eğitim Bakanlığı (Tayvan) Yushan Genç Bilgin Programı (109V1102 ve 110V1102) tarafından finanse edildi.

Synechocystis sp. PCC 6803 modeli glikoz-hoşgörülü suş, Dr. Chu, Hsiu-An Academia Sinica, Tayvan'dan elde edildi. Leptolyngbya sp. JSC-1, model olmayan filamentli, ABD Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'nden Dr. Donald A. Bryant'tan alındı.
1. Hücre kültürü ve hasat
<ol><li>Syn6803 veya JSC-1 hücrelerini metalik bir aşılama döngüsü kullanarak 50 mL B-HEPES medium28 içeren 100 mL konik şişeye aşıla. 50 μmol foton...

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes:+A+model.">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes:+Structure+and+dynamics.">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li><li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+harvesting+by+phycobilisomes.">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria.">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104 (2013).</li><li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems:+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes.">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).</li><li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria.">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li><li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light.">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li><li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+photoacclimation+(FaRLiP)+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light.">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li><li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light.">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).</li><li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria:+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis.">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li><li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phycobilisome,+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions.">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li><li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp.">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li><li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light.">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li><li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes.">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica.">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris.">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li><li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+(PCC+7335).+I:+The+phycobilisomes,+a+proteomic+approach.">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li><li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301.">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li><li>Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobilisomes+from+blue-green+and+red+algae:+Isolation+criteria+and+dissociation+characteristics.">Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics.</a> Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).</li><li>Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat.">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li><li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins.">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li><li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka,+Gujarat,+India.">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li><li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).</li><li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits.">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata.">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).</li><li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li><li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+phycobilisomes:+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism.">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li><li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409.">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li><li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers.">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).</li><li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li><li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212.">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li><li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li><li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f.">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).</li><li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga.">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li><li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li><li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane.">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li><li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis:+A+new+photosystem+I+antenna.">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li></ol>

Bu protokol, iki tür siyanobakteri, tek hücreli model Syn6803 ve filamentli model dışı JSC-1'de bozulmamış PBS'yi yalıtmaya yönelik basit ve standart bir yöntemi açıklar. Protokolün kritik adımları hücre homojenizasyonu ve sakkarozun süreksiz yoğunluk gradyanı üzerinde ultrasantrifüjlemedir. Genellikle, filamentli hücrelerin bozulması tek hücreli olanlardan daha karmaşıktır. Başlangıç malzemesinin miktarının (hücre peletinin ıslak ağırlığı) artırılması ve boncuk çırpma tekrarı...

Fitobilizom (PBS), siyanobakterilerin timlakoid zarlarındaki fotostemlerin sitoplazmik tarafına bağlanan suda çözünür pigment-protein kompleksidir1. PBS öncelikle renkli fitobiliproteinler ve renksiz bağlayıcı proteinlerden oluşur1,2. Fitobiliproteinler dört ana gruba ayrılabilir: fitoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin ve allophycocyanin3. Dört ana grup, klorofillerin verimsiz olarak emdiği 490-650 nm aralığında farklı ışık enerjisi dalga boylarını emer3. PBS, ışık enerjisi toplamak ve Fotosistem II ve I4'e teslim etmek için ışık hasat anteni olarak hizmet edebilir.
PBS'nin yapısı ve bileşimi türlerden türlere değişir. Toplu olarak, farklı siyanobakteri türlerinde üç fitoidom şekli (hemidiscodial, demet şeklinde ve çubuk şeklinde) tanımlanmıştır5. Aynı türlerde bile, PBS'nin bileşimi, ışık kalitesi ve besin tükenmesi6,7,8,9,10,11 gibi çevreye yanıt olarak değişir. Bu nedenle, PBS'yi siyanobakterilerden izole etmek için deneysel prosedür PBS12'nin incelenmesinde etkili olmuştur. Birkaç on yıl içinde, birçok farklı protokol PBS'yi izole etti ve yapısını, bileşimini ve işlevini analiz etti6,7,8,12,13,14,15,16,17. PBS izolasyonu için çok çeşitli yöntemler, kompleksi farklı türlerde farklı reaktifler ve aletlerle izole etme esnekliği sağlar. Bununla birlikte, siyanobakteriler ve PBS'ye aşina olmayan bilim adamları için uygun bir protokol seçmeyi de zorlaştırır. Bu nedenle, pbs izolasyonu siyanobakterilerden başlamak isteyenler için bu çalışmada genelleştirilmiş ve basit bir protokol geliştirilmiştir.
PBS'yi önceki yayınlardan izole etme yöntemleri burada özetlenmiştir. PBS suda çözünen bir protein kompleksi olduğundan ve kolayca ayrıştığından, ekstraksiyon sırasında PBS'yi stabilize etmek için yüksek iyonik mukavemetli fosfat tamponu gereklidir18. Geçmişte PBS'nin siyanobakteryumdan izolasyonu için yöntemleri açıklayan çeşitli araştırma makaleleri yayınlanmıştır. Yöntemlerin çoğu yüksek konsantrasyonda fosfat tamponu gerektirir8,14,15,18,19. Bununla birlikte, hücrelerin mekanik olarak bozulmasına yönelik prosedürler, cam boncuk destekli ekstraksiyon, sonication20 ve Fransız presi6,8,14 gibi değişir. Farklı fitobiliproteinler amonyum sülfat20 ile çökeltme ile elde edilebilir ve HPLC21 veya kromatografik bir sütun22 ile saflaştırılabilir. Öte yandan, sağlam PBS sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation6,8,15 ile kolayca izole edilebilir.
Bu protokolde PBS izolasyonu için malzeme olarak bir model siyanobakteri ve bir model dışı siyanobakteryum kullanılmıştır. Bunlar sırasıyla model tek hücreli glikoz-hoşgörülü Synechocystis sp. PCC 6803 (bundan böyle Syn6803) ve model dışı filamentli Leptolyngbya sp. JSC-1 (bundan böyle JSC-1), sırasıyla 7,23,24'tür. Protokol, yüksek iyonik mukavemetli fosfat tamponunda tek hücreli ve filamentli siyanobakterilerin bozulmasıyla başlar. Lizozdan sonra, süpernatantlar santrifüjleme ile toplanır ve daha sonra timlakoid membranlardan suda çözünen proteinleri yatıştırmak için noyonik bir deterjan (Triton X-100) ile muamele edilir. Toplam suda çözünen proteinler, PBS'yi fraksiyone etmek için süreksiz bir sakkaroz yoğunluk gradyanine uygulanır. Bu protokoldeki süreksiz sakkaroz gradyanı dört sakkaroz çözeltisi oluşur ve bozulmamış PBS'yi sakkaroz tabakasının en düşük fraksiyonlarında bölümler25. PBS'nin bütünlüğü SDS-PAGE, çinko boyama ve 77K floresan spektroskopisi6,7,8,26 ile analiz edilebilir. Bu yöntem, bozulmamış PBS'yi siyanobakterilerden izole etmeyi ve spektral, yapısal ve bileşimsel özelliklerini incelemeyi amaçlayan bilim adamları için uygundur.
Bu protokolün birkaç avantajı vardır. (1) Bu yöntem standartlaştırılmıştır ve bozulmamış PBS'yi hem tek hücreli hem de filamentli siyanobakterilerden izole etmek için kullanılabilir. Makalelerin çoğu, bir tür siyanobakteri4,7,8,12,13,14,16,18'de uygulanan yöntemi açıklar. (2) PBS düşük sıcaklıkta ayrıştığı için bu yöntem oda sıcaklığında gerçekleştirilir19,27. (3) Bu yöntem, hücreleri bozmak için boncuk çırpıcı kullanmayı açıklar; bu nedenle, yüksek basınçlı Fransız basınından ve diğer yöntemlerde sonicator'dan olası işitme hasarından daha ucuz ve güvenlidir8,13,14,20. (4) Bu yöntem, sakkaroz gradyan ultra santrifüjleme ile bozulmamış PBS'yi izole eder. Bu şekilde, farklı boyutlarda ve kısmen ayrışmış PBS'ye sahip bozulmamış PBS, sakkaroz konsantrasyonuna göre ayrılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>13PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL centrifugation tube</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>40PA</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.1875.2500</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-HEPES medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0149</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako pure chemical industries</td>
			<td>2-291</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WLC 2/A2/C/2</td>
			<td>for the wet weight measurement of cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>F-7000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>Gly001.500</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CR22N</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature measurement accessory</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5J0-0112</td>
			<td>The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.07018,2511</td>
			<td>for Coomassie Blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Pico 21</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>121512.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>141509.121</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap vial</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>10832</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-2300</td>
			<td>for Znic staining signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSD101</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Zymeset</td>
			<td>BSU101</td>
			<td>for PBS isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS 011.1</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX 506.500</td>
			<td>for PBS extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 10 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 3 K membrane centrifugal filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>for buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CP80WX</td>
			<td>ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cary 60</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131787.121</td>
			<td>for Znic staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0338</td>
			<td>protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of intact phycobilisome in cyanobacteria

Siyanobakterilerde fitobilizom, ışığı toplayan ve fotokimya için fotosistem I ve II'ye enerji aktaran hayati bir anten protein kompleksidir. Fitofilizomun yapısını ve bileşimini incelemek bilim adamları tarafından büyük ilgi çekicidir, çünkü siyanobakterilerdeki fotosentezin evrimini ve ayrışmasını ortaya koymaktadır. Bu protokol, siyanobakteri hücrelerini bir boncuk çırpıcı tarafından düşük maliyetle verimli bir şekilde kırmak için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir yöntem sağlar. Bozulmamış fitobilizom daha sonra sakkaroz gradyan ultracentrifugation ile hücre özünden izole edilebilir. Bu yöntem farklı hücre tiplerine sahip hem model hem de model dışı siyanobakteriler için uygun olduğunu göstermiştir. Çinko sülfat ve Coomassie Blue ile boyanmış 77K floresan spektroskopisi ve SDS-PAGE ile fitobiliproteinlerin bütünlüğünü ve özelliğini doğrulamak için adım adım bir prosedür de sağlanmaktadır. İzole fitoidom ayrıca daha fazla yapısal ve bileşimsel analize tabi tutulabilir. Genel olarak, bu protokol, siyanobakterilere aşina olmayan araştırmacıların bozulmamış fitobilizomları hızlı bir şekilde izole etmelerini ve karakterize etmelerini sağlayan yararlı bir başlangıç kılavuzu sağlar.

Syn6803 ve JSC-1 hücreleri, %1 (v/v) CO2 ile dolu bir büyüme odasında LED beyaz ışık (50 μmol foton m-2s-1) altında, 30 °C'de B-HEPES ortamında sürekli karıştırılarak konik şişelerde yetiştirildi. Üstel büyüme aşamasında (OD750 = ~0.5), hücreler son optik yoğunluklu OD750 = ~0.2 ile taze ortama alt kültüre edildi. Geç üstel büyüme aşamasına ulaştıktan sonra (OD750 = 0.6-0.8), kültürler toplandı ve santrifüjlendi (20 ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Mevcut protokol, filobobizomların siyanobakterilerden santrifüjleme ile süreksiz bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ile izolasyonunu detaylandırıyor. Sağlam fitoidürlerin fraksiyonları 77K floresan emisyon spektrumu ve SDS-PAGE analizi ile doğrulanır. Ortaya çıkan fitobilizom fraksiyonları TEM ve kütle spektrometresi analizinin negatif boyanması için uygundur.

Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Siyanobakterilere aşina olmayan insanların fitobilizomları rahatça izole etmelerini sağlayan basit ve hızlı bir protokoldür. Bu tekniğin avantajı küçük bir ölçeğe uyarlanmış olması ve yapımının kolay olmasıdır. Model ve model dışı sikobakterilerin bozulmamış fitoidizomlarını izole etmek için basit, güvenilir ve verimli bir yöntemdir.750 nanometrede 0,8 OD hücre kültürünü bir litrelik bir şişeye aktararak başlayın ve 750 nanometrede 0,2 OD elde etmek için 500 mililitre B-HEPES ortamında seyreltin. OD 0,8'e 1'e ulaşana kadar kültürü 30 santigrat derecede sürekli karıştırarak büyütün, bu da geç üstel büyüme aşamasını gösterir. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kültürü 10.000 kez g hızında santrifüjleyin ve üst kısmı atın.Hücre peletlerini askıya alın ve 0.75 molar potasyum fosfat tamponu, pH yedi ile iki kez yıkanın. 50 mililitrelik santrifüj tüpündeki hücreleri oda sıcaklığında santrifüjle peletle. Süpernatant atın ve hücreleri 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile yeniden biriktirin.Peletin ıslak ağırlığını elektronik bir terazi ile ölçün ve peletin bir gram ıslak ağırlığını tamponun beş mililitresine yeniden harcayın. İki mililitrelik vidalı kapak şişesine bir mililitre hücre süspansiyonu ve 0,4 ila 0,6 gram 0,1 milimetre cam boncuk ekleyin. Hücreleri bir boncuk çırpıcı ile 30 saniye boyunca kırın.Tüplerin oda sıcaklığındaki su banyosunda iki dakika soğumasını bekleyin. Lizizden sonra, şişeleri oda sıcaklığında 500 kez g hızında 10 saniye santrifüjlayın. 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipet ile süpernatant toplayın.Boncukları bir kez 0,5 mililitre 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile yıkayın, ardından aynı santrifüj tüpüne aktarın. Lizli hücre süspansiyonu için Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcıya ve 20 dakika boyunca veya çözelti homojen hale gelene kadar 40 RPM'ye inkübe edin. Tüpleri 17, 210 kez g'da 20 dakika santrifüjleyin ve üst Triton misel tabakası olmadan süpernatantı oda sıcaklığında bir saate kadar saklayın.pH yedide 0,75 molar potasyum fosfat tamponunda dört konsantrasyon sakkaroz yapın. 40 mililitre santrifüj tüpünün altına 2,8 mililitre iki azı dişi sakkaroz tamponu yerleştirin ve üç kat sakkaroz çözeltisi ile kaplama yapın. Son olarak, süpernatant fraksiyonu içeren üç mililitre PBS ekleyin ve elde edilen degradeleri santrifüjleyin.Ultra merkezileştirme üzerine, katmanlar arasında kesirli PBS ve fitobiliproteinleri yoğunlaştırın ve Syn6803 ve arayüzlerdeki mavi bantları gözlemleyin. Fraksiyonları 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile tekrar tekrar konsantre ederek ve seyrelterek sakkarozu çıkarın ve santrifüj filtre ünitelerini membranleyin. PBS floresanını ölçmek için konsantre PBS örneğini 0,75 molar potasyum fosfat tamponu ile seyrelterek 500 mikrolitre hacmine kadar yapın.Seyreltilmiş PBS örneğini şeffaf bir cam tüpe ekleyin ve tüpü tamamen donana kadar sıvı nitrojen içinde dondurun. Donmuş tüpü sıvı nitrojenle önceden doldurulmuş şeffaf bir savaş kabına taşıyın. Komple hücre lizisi, merkezlenmeden önce süpernatant ve koyu mavi-yeşil rengi gösterir.İzole PBS'nin sakkaroz yoğunluğu gradyan ayrımı, ayrışmış fitobiliproteinlerin birkaç fraksiyonunu gösterir ve en düşük fraksiyon sağlam PBS'yi temsil eder. JSC one ve Syn6803'ün ayrışmış ve bozulmamış PBS'sinden emilim spektrumu, phycocyanin'e karşılık gelen 622 nanometrede aynı tepeye sahiptir. Ayrıca, JSC-1'in hem ayrışmış hem de bozulmamış PBS'sinde 571 nanometrede fitoerythrin emilimi zirvesi.Ayrışmış PBS'nin emisyon spektrumu, phycocyanin emisyonunu temsil eden Syn6803 ve JSC-1'de yaklaşık 650 nanometrede güçlü bir tepeye sahiptir. Floresan emisyon maksimal 651 nanometre ve 684 nanometredeki zirveler, fitokyanin tarafından hasat edilen enerjinin çekirdekteki ApcD ve ApcE olan allophycocyanin ve terminal yayıcılarına verimli bir şekilde aktarıldığını ortaya koymaktadır. Şekil, fitobiliprotein alt ünlemlerinin güçlü bir şekilde floresan olduğu ve ApcE'nin okla belirtilen zayıf floresan gösterdiği UV ışınlaması altında çinko lekeli SDS-PAGE'i göstermektedir.Kumasi mavi boyama, üst fraksiyonların diğer PBS olmayan suda çözünür proteinler içerdiğini ve bozulmamış PBS ve Syn6803'ün, ayrışmış PBS fraksiyonlarında eksik olan, okla gösterilen belirgin bir ApcE bandı gösterdiğini göstermektedir. Ultrasantrifüjleme, 1:3 oranında hazırlanan sakkaroz gradyanın 1:10 oranında yapılan degradeden daha geniş bantlar gösterdiğini göstermektedir. Daha fazla fitoidom elde etmek için hücreleri liziz ve süpernatantları tamamen solvoliz etmek önemlidir.Kriyo-EM veya karışık spektrometre gibi diğer yöntemler, fitoidizomların protein yapısını veya protein bileşimini incelemek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...