Name: spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles
Uploaded: 2021-12-10T14:45:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af forskningsbevillinger fra: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Denne protokol giver tilstrækkelig information til med succes at udføre rygmarvstranssektion. Bemærk, at der er fremragende detaljerede protokoller for disse teknikker, der er offentliggjort andetsteds14, som kan supplere den, der præsenteres her. Alle dyreforsøg er godkendt af Udvalget for Bioetik og Biosikkerhed fra Det Biologiske Fakultet, Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Naturlig parring af frøer
<ol><li>Tre til fem dage før parring forinjiceres subkutant mandlige og kvindelige frøer med 50 enheder humant choriongonadotropin (hCG). Brug teknikken "jernklo" til at begrænse frøerne; Da frøerne er glatte, skal du bruge et net til at omslutte frøen, hvis det er nødvendigt. Indsæt spidsen af en 26 G x 1/2" nål bagud til sidelinjen, og skub den dorsalt til en dybde på 1 cm mellem huden og musklen.</li>
	<li>Før parring injiceres hanen med 300 enheder og kvinden med 700 enheder hCG.</li>
	<li>For at parringen kan finde sted, anbrings hannen og hunnen i 2 liter 0,1x Barth-opløsning umiddelbart efter nedkøling af opløsningen ved 4 °C i 15 minutter, så den ligner forårsforholdene, og lade den stå natten over ved 18 °C.</li>
	<li>Seksten timer senere skal du forsigtigt samle embryonerne ved hjælp af en plastpasteurpipette, med spidsen afskåret, og læg dem i petriskåle med en diameter på 10 cm. Det embryonale gelélag fjernes ved at inkubere embryonerne med 25 ml 2 % cystein i destilleret vand (pH 7,8; sørg for, at opløsningen dækker embryonerne) i 5 minutter med let omrøring. Vask 3 gange med destilleret vand og 3 gange med 0,1x Barth-opløsning (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazinethhansulfonsyre (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).</li>
	<li>Vælg sunde embryoner, der har en brunlig farve og symmetrisk opdelende blastomerer. Anbring embryonerne i petriskåle med en diameter på 10 cm med 50 ml 0,1x Barth-opløsning med en densitet på højst 100 embryoner pr. Skål.</li>
</ol>2. Husdyrhold
<ol><li>I løbet af den første uge skal embryonerne holdes ved 18 °C, indtil de kommer ud af vitellinsækken. I løbet af denne tid skal du skifte Barth-opløsningen hver dag og fjerne hvidlige døde embryoner og haletudser, der præsenterer enhver synlig anatomisk ændring eller haletudser uden nogen svømmebevægelse.</li>
	<li>Efter den første uge overføres tadpoles til klorfrit vand i plasttanke med en tæthed på 10 dyr pr. Liter. Dyrk haletudser ved 20-21 ° C med en 12-timers lys / 12-timers mørk cyklus, med iltsten til rådighed i hver tank for at lufte vandet og fodres en gang dagligt med 0,5 mg pr. Dyr. Udskift vand en gang om ugen, og kontroller for akkumuleret affald og døde dyr dagligt24.</li>
</ol>3. Iscenesættelse
<ol><li>Tre til fire uger efter befrugtning skal du placere dyrene i en petriskål; Kontroller derefter morfologien og udseendet af forben og bagben en efter en. Om nødvendigt anæstesiiseres dyrene ved at placere dyrene i en petriskål med 50 ml 0,02% tricainmesylat i 0,1x Barth-opløsning for bedre manipulation. Efter højst 2 minutter anbringes dyrene i 0,1x Barth-opløsning til genopretning fra anæstesien.</li>
	<li>Se efter følgende anatomiske egenskaber ved trin 50 dyr25: forben, der lige vises og er sfæriske (figur 1); bagben, der stikker ud og er sfæriske (figur 1). BEMÆRK: Dyr fra trin 49 til 51 kan anvendes til denne procedure (figur 1); For mere information om stadier henvises til Nieuwkoop og Fabers normale tabel over Xenopus laevis25.</li>
</ol>4. Kirurgi: rygmarvstranssektion og skam-opererede dyr
<ol><li>Anæstesi trin 50 haletudser ved at placere dem i en petriskål med 50 ml 0,02% tricainmesylat i 0,1x Barth-opløsning i 2 minutter.</li>
	<li>Ved hjælp af en spiseskefuld og tang placeres haletudsen, dorsal side-up, på et vådt stykke gasbind i den øverste halvdel af en glas petriskål.</li>
	<li>Udfør et snit af huden og dorsale muskler på midten af thoraxniveauet (figur 2A, B) ved hjælp af mikrodissektionsfjedersaks.<ol>
<li>For bekæmpelse af skamdyr skal det sikres, at snitstørrelsen kun er ~ 0,2 mm (figur 2C); beskadiger ikke rygmarven (figur 2D,D').</li>
		<li>For transekterede dyr skal der udføres et andet snit på ~0,2 mm (figur 2C) for fuldt ud at transektere rygmarven (figur 2E,E').</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Pleje efter operationen
<ol><li>Efter operationen overføres haletudserne til en tank indeholdende 0,5 l 0,1x Barth-opløsning med 1x Penicillin-streptomycin med en densitet på 10-12 dyr pr. Tank. Vedligehold de transekterede og kontroller skamdyr i separate tanke. BEMÆRK: Tadpoles vil komme sig efter anæstesi om et par minutter.</li>
	<li>Tadpoles med beluftning ved en temperatur på 20-21 °C opretholdes.</li>
	<li>Skift Barth-opløsningen med antibiotika hver anden dag indtil forsøgets afslutning.</li>
	<li>Begynd at fodre dyrene en dag efter operationen, en gang om dagen.</li>
	<li>Eliminer døde dyr.</li>
</ol>6. Svømning assay
<ol><li>Få en kasse med LED-belysning indefra, dækket af et gennemsigtigt polystyrenark, som gør det muligt for lyset at passere igennem.</li>
	<li>Installer et kamera over LED-boksen.</li>
	<li>Læg en petriskål med en diameter på 15 cm oven på kassen, fyldt med 100 ml 0,1x Barth-opløsning.</li>
	<li>En dag efter transsektion skal du placere en haletudse i petriskålen og lade den stå i en 5 minutters tilpasningsperiode.</li>
	<li>Efter tilpasning skal du begynde at videospore frisvømmeadfærden ved hjælp af den refererede software (se materialetabellen) i 5 minutter.</li>
	<li>Når videoen er afsluttet, skal du overføre haletudsen tilbage til dens tank.</li>
	<li>Gentag videosporingen 5, 10, 15 og 20 dage efter transektion (figur 3).</li>
</ol>7. Bioetiske overvejelser
BEMÆRK: Dødeligheden hos dyr efter sham-kirurgi og transektion er henholdsvis 13% og 30%. Derudover er der behov for mindst 15-20 dyr pr. gruppe til statistisk analyse. Start derfor med 23 sham og 26 transekteret dyr.
<ol><li>Anæstesi dyrene med 0,02% tricainmesylat i 2 minutter for at sikre reduktion i neuronal og motorisk aktivitet og smerte før operationen.</li>
	<li>Efter operationen skal du kontrollere dyrene for genopretning fra anæstesi. Derudover fodre og kontrollere dyrene dagligt.</li>
	<li>Efter afslutning af svømmeassayet ofres dyrene med en overdosis tricainmesylat (1% tricainmesylat fremstillet i 30 mM natriumbicarbonatopløsning).</li>
</ol>

<ol>
	<li>International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury">https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury</a> (2013)</li><li>Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Where+fish,+frogs+and+salamanders+lead+the+way,+can+we+follow.">Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow.</a> Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).</li><li>Lee-Liu, D., M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+African+clawed+frog+Xenopus+laevis:+A+model+organism+to+study+regeneration+of+the+central+nervous+system.">The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system.</a> Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).</li><li>Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+Xenopus.">Model systems for regeneration: Xenopus.</a> Development. 147 (6), (2020).</li><li>Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Lessons+for+mammals+from+non-mammalian+vertebrates.">Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates.</a> Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).</li><li>Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+needed+for+regeneration+of+spinal+cord+and+muscle+in+a+vertebrate.">Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate.</a> Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+gene+expression+during+Xenopus+tropicalis+tadpole+tail+regeneration.">Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Gargiolo, C., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+tracing+during+Xenopus+tail+regeneration.">Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration.</a> Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).</li><li>Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+neural+crest+derivatives+in+the+Xenopus+tadpole+tail.">Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail.</a> BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).</li><li>Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+spinal+cord+after+ablation+in+larval+Xenopus+laevistle.">Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle.</a> Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).</li><li>Gaete, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+tadpoles+proceeds+through+activation+of+Sox2-positive+cells.">Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells.</a> Neural Development. 7, 13 (2012).</li><li>Mu&#241;oz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+laevis.">Spinal cord regeneration in Xenopus laevis.</a> Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+as+a+method+to+investigate+spinal+cord+regeneration+in+regenerative+and+nonregenerative+xenopus+stages.">Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+cells+from+pre-metamorphic+stages+differentiate+into+neurons+and+promote+axon+growth+and+regeneration+after+transplantation+into+the+injured+spinal+cord+of+non-regenerative+Xenopus+laevis+froglets.">Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).</li><li>de Vidts, S., M&#233;ndez-Olivos, E., Palacios, M., Larra&#305;n, J., Mery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spinal+cord+damage+based+on+automatic+video+analysis+of+froglet+swimming.">Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming.</a> Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).</li><li>Slater, P. G., Palacios, M., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus,+a+model+to+study+wound+healing+and+regeneration:+Experimental+approaches.">Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).</li><li>Lee-Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profile+of+the+response+to+spinal+cord+injury+in+Xenopus+laevis+reveals+extensive+differences+between+regenerative+and+non-regenerative+stages.">Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages.</a> Neural Development. 9, 12 (2014).</li><li>Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+after+spinal+cord+injury+(SCI)+in+a+regenerative+and+a+nonregenerative+stage+in+the+frog+Xenopus+laevis.">Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).</li><li>Pe&#241;ailillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+response+to+spinal+cord+injury+identi+fi+ed+a+key+role+for+mTORC1+signaling+in+the+activation+of+neural+stem+progenitor+cells.">Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+in+Xenopus+laevis.">Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis.</a> Neural Development. 16 (1), 2 (2021).</li><li>Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK-STAT+pathway+activation+in+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+of+Xenopus+laevis.">JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis.</a> Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).</li><li>Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+Xenopus+laevis+tadpole+stages+to+adult.">How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+availability+contributes+to+a+graded+refractory+period+for+regeneration+in+Xenopus+tropicalis.">Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).</li><li>Vleminckx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: Methods and protocols. , (2018).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Protokollen beskrevet heri er en glimrende metode til at udføre SCI og evaluere funktionel opsving. For reproducerbarhed er det vigtigt at dyrke sunde haletudser og vælge dyr, der er ens i størrelse. Mangel på korrekt fodring skaber næringsstofstress, hvilket resulterer i dårlig regenerativ kapacitet26; derfor bør der lægges særlig vægt på tadpole fodring. Da haletudser når stadie 50 efter 3-4 uger, kan de opdrættes ved højere temperaturer for at fremskynde vækstprocessen, idet 18-25 °C er optimal27. Vandkvaliteten er vigtig, da dyr er følsomme over for vandforhold og kemiske produkter. De optimale vandforhold omfatter anvendelse af kulfiltreret, klorfrit vand med følgende parametre: pH (6,5-7,5), chlorid (<0,02 mg/l), vandets ledningsevne (1,0 mS/cm ± 0,1 enheder), kobber (<0,3 mg/l); karbobundethed (KH: 5-10 dKH); generel hårdhed (GH: 6-16 dGH); nitrat (NO3: <20 mg/l) og nitrit (NO2: <0,1 mg/l)14,27,28. For at undgå forurening skal plasttanke rengøres en gang om ugen til opdræt af dyr eller hver anden dag efter operationen ved at vaske grundigt med kloridfrit vand og en svamp; vaskemiddel skal undgås.
For en bedre overlevelsesrate efter operationen må haletudser ikke udsættes for anæstesi i lange perioder (højst 2 min). Desuden anbefales det at anæstesi en tadpole ad gangen. Da dyrene har brug for at forblive hydreret, skal du holde dyrene nedsænket i opløsning hele tiden før og efter operationen og hælde opløsningen med en ske oven på haletudsen, inden operationen påbegyndes. Sørg for, at skaden er omfattende nok til at dække hele rygmarven, men ikke for omfattende, da det kan fremkalde dårlig funktionel genopretning eller død. Hvis notochordet er beskadiget, vil dyret blive bøjet, og den funktionelle genopretning vil blive påvirket. Hvis skaden strækker sig ud over notokorden, øges sandsynligheden for død14. Under svømmeanalysen betragtes optagelsen som korrekt, hvis softwaren identificerer hvert dyr med en blå skygge; Ellers skal optagelsen gentages. Det er vigtigt at undgå bevægelses- og luft- eller lysændringer under optagelsesprocessen for at forhindre optagelsesfejl.
Der er stadig mange åbne spørgsmål om de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for rygmarvsskader og regenerering. Protokollen beskrevet i dette arbejde kan bruges til at studere bidraget fra forskellige cellulære begivenheder, genekspression og behandlinger på funktionel genopretning, bestemt ved måling af svømmekapacitet. Derudover kan mange andre teknikker anvendes på de opererede dyr. Rygmarven kan isoleres for at udføre protein- og/eller mRNA-ekstraktion14 for at studere protein- og genekspressionsprofiler efter skade og behandling19,20. Denne operation har også været grundlaget for at studere rygmarvscellerespons22 og adfærden af neurale stamceller12,13,22 efter rygmarvsskade. Signalkaskader involveret i rygmarvsregenerering er også blevet undersøgt ved hjælp af rygmarvsskadeparadigmet beskrevet heri23. Sammenfattende er den protokol, der er beskrevet her, en fremragende model til at studere rygmarvsskade og regenerering og er blevet brugt til mange undersøgelser, der har bidraget til den eksisterende viden om emnet.

Rygmarvsskade (SCI) er en lidelse, der rammer ca. 250.000-500.000 mennesker verden over hvert år1. Ud over denne høje forekomst påvirker SCI sensoriske og motoriske nerver, hvilket genererer lammelse under skadestedet og afbrydelse af nogle indre organer fra kontrollen af CNS. Rygmarven, en del af CNS, kan ikke regenerere, og på grund af lidelsens kompleksitet og manglen på fuldstændig forståelse af alle de involverede processer er der stadig ingen effektive terapier, der muliggør funktionel genopretning.
Ikke-pattedyrsorganismer, såsom teleostfisk, urodele padder og larvestadier af anuran amfibier, som kan regenerere rygmarven efter svær SCI2,3,4, er fremragende modelorganismer til at studere de processer, der styrer en vellykket regenerativ begivenhed og forstå svigt i pattedyrs regenerering. Denne forståelse er af stor interesse, da den kan give original indsigt i at udvikle nye terapeutiske mål og mulige terapier til SCI.
Anuranfrøen, Xenopus laevis, er en fremragende modelorganisme til at studere SCI. Det har fremragende regenerative kapaciteter under haletudsestadierne, som gradvist går tabt under metamorfose, hvilket muliggør eksperimentering i de regenerative og ikke-regenerative stadier3,5. Den etablerede skadesmetode til undersøgelse af SCI i Xenopus laevis haletudser består af haleamputation, hvor hele halen fjernes, herunder væv som muskel, notochord og rygmarv6. Denne tilgang har været medvirkende til forståelsen af generelle mekanismer for regenerative processer4,7,8,9,10.
Da haleamputation involverer flere væv ud over rygmarven, hvilket er forskelligt fra, hvad der sker efter human SCI, er der behov for et mere relevant skadeparadigme til undersøgelsen af SCI. Vi har stolet på undersøgelser, der er brugt i fortiden11 til at generere omfattende beskrivelser af skadesparadigmer5,12,13,14 og forskellige metoder til undersøgelse af SCI12,13,14,15,16,17,18 . Efter rygmarvstranssektion kan den kaudale del af rygmarven isoleres for RNA- og proteinekspression og analyser med høj gennemstrømning14,19,20,21. Derudover tillader intracelomiske injektioner af lægemidler og små molekyler samt elektroporation af cDNA, RNA eller morpholinos før eller efter rygmarvstransektion undersøgelse af virkningerne af disse molekyler til forebyggelse eller behandling af SCI eller af specifikke hændelser, der forekommer efter SCI og rygmarvsregenerering13,14 . Endvidere kan skadesudvikling og de regenerative processer studeres på forskellige tidspunkter efter skade ved hjælp af biokemiske, molekylære, histologiske og funktionelle tilgange12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Endelig kan alle ovennævnte teknikker anvendes i ikke-regenerative stadier, hvilket fremhæver en af de vigtigste fordele ved at anvende Xenopus laevis som en modelorganisme til at studere SCI, de komparative undersøgelser af regenerative og ikke-regenerative mekanismer i samme art13,19,20,21,22. Dette papir præsenterer en protokol for Xenopus laevis tadpole rygmarvstranssektion, begyndende med iscenesættelse og udvælgelse af regenerative Nieuwkoop og Faber (NF) fase 50 haletudser. Dette efterfølges af beskrivelsen af procedurerne for rygmarvskirurgi for at producere falske og transekterede dyr, postkirurgisk pleje og endelig analysen af funktionel genopretning ved måling af fri haletudse svømmeafstand.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Regent CALM</td>
			<td>RC-006</td>
			<td>For oxygen diffuser stones function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANY-maze software</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#183;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60528</td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 
			1 available USB port, 1,366 &#215; 768 monitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>Surgery / staging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be found in different formats in the pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light box</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors for transection</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>Spring Scissors for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Anesthetic; tricaine mesylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>SB09480(LM)MX</td>
			<td>Food for Xenopus tadpoles stage&#160; 44 to 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen diffuser stones</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>AA1</td>
			<td>Mantainance of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont n&#176; 5 SF forceps</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z331740</td>
			<td>For collecting embryos after mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tank/box with lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.5 liter capacity; 20 cm &#215; 17 cm &#215; 15 cm or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablespoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis 
			specialized strains and lines</td>
			<td>National Xenopus Resource 
			European Xenopus Resource Centre 
			Xenopus laevis Research Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>http://www.mbl.edu/xenopus 
			https://xenopusresource.org/ 
			https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis wild type</td>
			<td>Xenopus 1 
			Xenopus Express</td>
			<td></td>
			<td>https://xenopus1.com 
			http://www.xenopus.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles

Rygmarvsskade (SCI) er en permanent lidelse, som påvirker centralnervesystemet (CNS) motoriske og sensoriske nerver, hvilket resulterer i lammelse under skadestedet. Til dato er der ingen funktionel genopretningsterapi til SCI, og der mangler klarhed over de mange komplekser og dynamiske begivenheder, der opstår efter SCI. Mange organismer uden pattedyr kan regenerere efter svær SCI, såsom teleostfisk, urodele amfibier og larvestadier af anuran amfibier, herunder Xenopus laevis tadpoles. Disse er bona fide modelorganismer til at studere og forstå reaktionen på SCI og de mekanismer, der ligger til grund for vellykkede regenerative processer. Denne type forskning kan føre til identifikation af potentielle mål for SCI terapeutisk intervention. Denne artikel beskriver, hvordan man udfører Xenopus laevis tadpole rygmarvstranssektion, herunder husdyrhold, kirurgi, postkirurgisk pleje og funktionel testevaluering. Denne skadesmetode kan anvendes til at belyse de forskellige trin i rygmarvsregenerering ved at studere de cellulære, molekylære og genetiske mekanismer samt histologisk og funktionel udvikling efter SCI og under rygmarvsregenerering.

Protokollen beskrevet heri tillader undersøgelse af rygmarvsregenerering i Xenopus laevis. Virkningerne af specifikke farmakologiske behandlinger og bidraget fra specifik genekspression i rygmarvsregenerering kan evalueres ved at måle deres virkninger på svømmegendannelse. Den samlede svømmedistance plotes op mod dagene efter skaden for at sammenligne kontroldyr og behandlede dyr på et bestemt tidspunkt eller over en bestemt periode. Genopretningen af motorisk funktion gennem tiden er eksemplificeret i figur 3, der viser svømmeafstanden ved 5, 10, 15 og 20 dage efter transektion. 5 dage efter transektion svømmede dyrene i gennemsnit 0,7 m på 5 minutter, hvilket viser en reduceret svømmekapacitet. Denne kapacitet steg med de dage, der gik, da der i gennemsnit blev observeret 2,1 og 3,1 m/5 min efter henholdsvis 10 og 15 dage efter transektion, og der blev observeret fuldstændig genopretning af svømmekapaciteten 20 dage efter transektion med et gennemsnit på 5,7 m/5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig01.jpg"> Figur 1: Xenopus tadpole iscenesættelse. Repræsentative billeder af trin 49-51, der viser for- og bagben til reference til dyrs iscenesættelse. Vægtstænger = 2 mm. Forstørrelser af det indrammede område vises nederst til højre på hvert billede. Vægtstænger = 1 mm. I trin 49 observeres forbenene ikke, mens bagbenene bare vises og viser en sfærisk form. Trin 50 præsenterer forben, der lige vises, viser en sfærisk form og bagben, der stikker ud med en sfærisk form. I trin 51 præsenterer forbenene en fremspringende sfærisk form og bagbenene en fremspringende langstrakt form. Stiplede konturer viser for- og bagben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig02.jpg"> Figur 2: Rygmarvstranssektion. (A) Repræsentativt billede, der viser den korrekte placering af dyret, dorsal side op, til udførelse af operationen. Skalabjælke = 2 mm. (B) Forstørrelse af A viser skadens placering og omfang. Det røde kors viser den nøjagtige placering af skadestedet på rygmarvens brystniveau, og den stiplede linje viser omfanget af skaden. Skalastang = 1 mm. (C) Repræsentativt billede, der viser et lateralt billede af rygmarvens thoraxniveau. Udvidelsen af sham-snittet og transektionen er vist. Stiplede linjer afgrænser rygmarvens grænser. Skalastang = 1 mm. (D) Repræsentativt billede, der viser et fupdyr med en intakt rygmarv. Skalastænger = 1 mm. (E) Repræsentativt billede, der viser et transekteret dyr med en afbrudt rygmarv. Vægtstænger = 1 mm. Forstørrelser af det indrammede område vises nederst til højre i hvert billede (D' og E'). Skalastænger = 1 mm. Forkortelser: S = sham-snit; T = transektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig03.jpg"> Figur 3: Genopretning af svømmefunktionen over tid. Repræsentativt prisk plot af svømmeafstanden dækket af transekterede dyr på 5 minutter ved 5, 10, 15 og 20 dage efter transektion. Prøver af svømmebaner er vist øverst. Data præsenteret som gennemsnitlige ± SEM fra 10 haletudser. Forkortelser: dpT = dage efter transektion; SEM = standardfejl i middelværdien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole rygmarvstranssektion er en relevant skademetode til at studere rygmarvsskade og regenerering ved at lave et tværgående snit, der fuldstændigt skærer rygmarven på thoraxniveau.

Rygmarvstranssektion i Xenopus laevis tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

Denne protokol tillader undersøgelse af rygmarvsregenerering hos frøer. Den erhvervede viden kunne give ny indsigt i at forstå, hvordan mennesker reagerer på rygmarvsskade. Den største fordel ved denne protokol er letheden ved at udføre skaden, og også at sammenlignet med paradigmet for hale amputation efterligner denne teknik bedre, hvad der sker hos mennesker.Denne teknik gør det muligt at udfordre den regenerative proces for bedre at forstå deltagelsen af forskellige gener, proteiner, molekyler og signalveje og derved identificere nye terapeutiske mål, Det er vanskeligt at finde det rigtige sted at generere skaden såvel som dens forlængelse. At være i stand til at se disse trin er afgørende for at gøre denne procedure ligetil og reproducerbar. Tre til fire uger efter befrugtning skal du placere haletudserne i en petriskål og kontrollere morfologien og udseendet af forbenene og bagbenene.Se efter følgende anatomiske egenskaber ved trin-50 dyr, forben, der lige vises og er sfæriske, og bagben, der stikker ud og er sfæriske. Før operationen skal du anæstesiere haletudserne ved at placere dem i 0,02% tricainmesylat i 0,1 gange Barth-opløsning og kontrollere, at dyrene ikke reagerer ved at vende dem på hovedet. For at udføre rygmarvstranssektionsoperationen skal du bruge en spiseskefuld og tang til at placere enbedøvende fase-50 tadpole dorsal side op på et vådt stykke gasbind i den øverste halvdel af en glas petriskål.Derefter skal du ved hjælp af mikrodissektionsfjedersaks lave et snit af huden og dorsale muskler på det midthoraciske niveau. Til kontrol af falske dyr skal du sørge for, at snitstørrelsen kun er 0,2 millimeter og ikke beskadiger rygmarven. I de transekterede dyr skal du lave et andet snit på 0,2 millimeter for fuldt ud at transektere rygmarven.Efter operationen overføres haletudserne til en tank, der indeholder 500 ml 0,1 gange Barth-opløsning med en gang penicillin og streptomycin med en densitet på 10 til 12 haletudser pr. Tank. Vedligehold de transekterede og kontroller sham tadpoles i separate tanke. Vedligehold haletudserne med beluftning ved en temperatur på 20 til 21 grader Celsius.Skift Barth-opløsningen med antibiotika hver anden dag indtil forsøgets afslutning. Begynd at fodre haletudserne en dag efter operationen og fjern de døde dyr. Til svømmeanalysen skal du få en kasse med LED-belysning indefra, dækket af et gennemsigtigt polystyrenark, der tillader lys at passere igennem, og installer et kamera over LED-boksen.Anbring derefter en petriskål med en diameter på 15 centimeter oven på kassen fyldt med 100 ml 0,1 gange Barth-opløsning. En dag efter transsektion skal du placere en haletudse i petriskålen og lade den stå i en fem minutters tilpasningsperiode. Efter tilpasning skal du starte videosporing af frisvømningsadfærd ved hjælp af referencesoftwaren i fem minutter.Når videoen er afsluttet, skal du overføre haletudsen tilbage til dens tank. Dette repræsentative dot plot viser genopretningen af motorfunktionen gennem tiden. Fem dage efter transsektion svømmede haletudser i gennemsnit 0,7 meter på fem minutter, hvilket viste en reduceret svømmekapacitet.Denne kapacitet steg med de dage, der gik, og viste i gennemsnit 2,1 meter på fem minutter efter 10 dage og 3,1 meter på fem minutter efter 15 dage efter transektion. Fuldstændig genopretning af svømmekapaciteten blev observeret 20 dage efter transektion, med et gennemsnit på 5,7 meter på fem minutter. Svømmegennemsnittet kan variere afhængigt af hvert parti dyr.Forsøgsgruppen bør således altid sammenlignes med de respektive kontroller og ikke tidligere opnåede data. Efter operationen kan dyr bruges til global analyse, herunder transkriptomik, proteomik og metabolomics, og til at screene for forbindelser, der hæmmer eller fremmer rygmarvsregenerering med det formål at udvikle nye terapeutiske tilgange.

Research

JoVE Journal

Biology

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplantation i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryoner

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...