Name: spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles
Uploaded: 2021-12-10T14:45:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door onderzoeksbeurzen van: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Dit protocol biedt voldoende informatie om met succes een dwarslaesie uit te voeren. Van belang is dat er uitstekende gedetailleerde protocollen van deze technieken elders zijn gepubliceerd14, die een aanvulling kunnen vormen op de hier gepresenteerde. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Comité voor Bio-ethiek en Bioveiligheid van de Faculteit biologische Wetenschappen, Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Natuurlijke paring van kikkers
<ol><li>Drie tot vijf dagen voorafgaand aan de paring, subcutaan preïnjecteren mannelijke en vrouwelijke kikkers met 50 eenheden van menselijke choriongonadotrofine (hCG). Gebruik de "ijzeren klauw" -techniek om de kikkers in bedwang te houden; omdat de kikkers glad zijn, gebruik dan een net om de kikker te omringen indien nodig. Breng de punt van een naald van 26 G x 1/2" achteraan in de zijlijn en duw deze dorsaal tot een diepte van 1 cm, tussen de huid en de spier.</li>
	<li>Injecteer vóór de paring het mannetje met 300 eenheden en het vrouwtje met 700 eenheden hCG.</li>
	<li>Om paring te laten plaatsvinden, plaatst u het mannetje en het vrouwtje in 2 l van 0,1x Barth-oplossing onmiddellijk na het koelen van de oplossing bij 4 °C gedurende 15 minuten om op de lenteomstandigheden te lijken en laat u 's nachts bij 18 °C.</li>
	<li>Verzamel zestien uur later zorgvuldig de embryo's met behulp van een plastic Pasteur-pipet, met de punt afgesneden, en plaats ze in petrischalen met een diameter van 10 cm. Verwijder de embryonale geleilaag door de embryo's te incuberen met 25 ml 2% cysteïne in gedestilleerd water (pH 7,8; zorg ervoor dat de oplossing de embryo's bedekt) gedurende 5 minuten met lichte agitatie. Wassen 3 keer met gedestilleerd water en 3 keer met 0,1x Barth-oplossing (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazine ethaansulfonzuur (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).</li>
	<li>Selecteer gezonde embryo's met een bruinachtige kleur en symmetrisch verdelende blastomeren. Plaats de embryo's in petrischalen met een diameter van 10 cm met 50 ml 0,1x Barth-oplossing bij een dichtheid van niet meer dan 100 embryo's per schaal.</li>
</ol>2. Houderij
<ol><li>Houd de embryo's gedurende de eerste week op 18 °C totdat ze van de vitellinezak afkomen. Verander gedurende deze tijd de Barth-oplossing elke dag en verwijder witachtige dode embryo's en kikkervisjes die zichtbare anatomische verandering of kikkervisjes vertonen zonder enige zwembeweging.</li>
	<li>Breng na de eerste week kikkervisjes over naar chloorvrij water in plastic tanks met een dichtheid van 10 dieren per liter. Kweek kikkervisjes bij 20-21 °C met een 12-uurs licht/12-uur donkere cyclus, met zuurstofstenen beschikbaar in elke tank om het water te beluchten en eenmaal per dag gevoed met 0,5 mg per dier. Vervang eenmaal per week water en controleer dagelijks op opgehoopt afval en dode dieren24.</li>
</ol>3. Enscenering
<ol><li>Plaats de dieren drie tot vier weken na de bevruchting in een petrischaaltje; controleer vervolgens één voor één de morfologie en het uiterlijk van voorpoten en achterpoten. Verdoof indien nodig de dieren door de dieren in een petrischaal met 50 ml 0,02% tricainemesylaat in 0,1x Barth-oplossing te plaatsen voor betere manipulatie. Plaats de dieren na niet meer dan 2 minuten in 0,1x Barth-oplossing voor herstel van de anesthesie.</li>
	<li>Zoek naar de volgende anatomische kenmerken van dieren in stadium 5025: voorpoten die net verschijnen en bolvormig zijn (figuur 1); achterpoten die uitsteken en bolvormig zijn (figuur 1). OPMERKING: Dieren uit de stadia 49 tot en met 51 kunnen voor deze procedure worden gebruikt (figuur 1); voor meer informatie over etappes verwijzen wij u naar Nieuwkoop en Faber's Normale Tafel van Xenopus laevis25.</li>
</ol>4. Chirurgie: ruggenmergtranssectie en schijndieren
<ol><li>Verdoof stadium 50 kikkervisjes door ze gedurende 2 minuten in een petrischaaltje met 50 ml 0,02% tricaïnemesylaat in 0,1x Barth-oplossing te plaatsen.</li>
	<li>Plaats met behulp van een eetlepel en een tang het kikkervisje, dorsale zijde-omhoog, op een nat stuk gaas in de bovenste helft van een glazen petrischaal.</li>
	<li>Voer een incisie uit van de huid en de dorsale spieren op het midden-thoracale niveau (figuur 2A, B) met behulp van een microdissectieveerschaar.<ol>
<li>Voor controle schijndieren, zorg ervoor dat de incisiegrootte slechts ~ 0,2 mm is (figuur 2C); het ruggenmerg niet beschadigen (figuur 2D,D').</li>
		<li>Voer voor getransecteerde dieren een tweede incisie uit van ~0,2 mm (figuur 2C) om het ruggenmerg volledig te transecteren (figuur 2E,E').</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Postsurgische zorg
<ol><li>Breng na de operatie de kikkervisjes over naar een tank met 0,5 l 0,1x Barth-oplossing met 1x penicilline-streptomycine, met een dichtheid van 10-12 dieren per tank. Onderhoud de getransceerde en controleer schijndieren in afzonderlijke tanks. OPMERKING: Kikkervisjes zullen binnen een paar minuten herstellen van de anesthesie.</li>
	<li>Houd de kikkervisjes met beluchting op een temperatuur van 20-21 °C.</li>
	<li>Vervang de Barth-oplossing om de andere dag met antibiotica tot het einde van het experiment.</li>
	<li>Begin met het voeren van de dieren een dag na de operatie, eenmaal per dag.</li>
	<li>Elimineer dode dieren.</li>
</ol>6. Zwemtest
<ol><li>Verkrijg een doos met LED-verlichting van binnenuit, bedekt met een transparant polystyreenvel, waardoor het licht doorlaat.</li>
	<li>Installeer een camera over de LED-box.</li>
	<li>Plaats een petrischaaltje met een diameter van 15 cm bovenop de doos, gevuld met 100 ml 0,1x Barth-oplossing.</li>
	<li>Plaats een dag na de transsectie een kikkervisje in de petrischaal en laat een aanpassingsperiode van 5 minuten achter.</li>
	<li>Na aanpassing begint u met het video-volgen van het vrije zwemgedrag met behulp van de software waarnaar wordt verwezen (zie de tabel met materialen) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Nadat de video is voltooid, brengt u het kikkervisje terug naar de tank.</li>
	<li>Herhaal de videotracking 5, 10, 15 en 20 dagen na de transsectie (afbeelding 3).</li>
</ol>7. Bio-ethische overwegingen
OPMERKING: De sterfte van dieren na schijnoperaties en transsectie is respectievelijk 13% en 30%. Bovendien is een minimum van 15-20 dieren per groep nodig voor statistische analyse. Begin daarom met 23 schijn- en 26 getransceerde dieren.
<ol><li>Verdoof de dieren met 0,02% tricaïnemesylaat gedurende 2 minuten om te zorgen voor vermindering van neuronale en motorische activiteit en pijn vóór de operatie.</li>
	<li>Controleer na de operatie de dieren op herstel van anesthesie. Voer en controleer de dieren bovendien dagelijks.</li>
	<li>Offer na het beëindigen van de zwemtest de dieren met een overdosis tricaïnemesylaat (1% tricaïnemesylaat bereid in 30 mM natriumbicarbonaatoplossing).</li>
</ol>

<ol>
	<li>International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury">https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury</a> (2013)</li><li>Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Where+fish,+frogs+and+salamanders+lead+the+way,+can+we+follow.">Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow.</a> Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).</li><li>Lee-Liu, D., M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+African+clawed+frog+Xenopus+laevis:+A+model+organism+to+study+regeneration+of+the+central+nervous+system.">The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system.</a> Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).</li><li>Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+Xenopus.">Model systems for regeneration: Xenopus.</a> Development. 147 (6), (2020).</li><li>Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Lessons+for+mammals+from+non-mammalian+vertebrates.">Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates.</a> Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).</li><li>Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+needed+for+regeneration+of+spinal+cord+and+muscle+in+a+vertebrate.">Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate.</a> Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+gene+expression+during+Xenopus+tropicalis+tadpole+tail+regeneration.">Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Gargiolo, C., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+tracing+during+Xenopus+tail+regeneration.">Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration.</a> Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).</li><li>Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+neural+crest+derivatives+in+the+Xenopus+tadpole+tail.">Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail.</a> BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).</li><li>Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+spinal+cord+after+ablation+in+larval+Xenopus+laevistle.">Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle.</a> Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).</li><li>Gaete, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+tadpoles+proceeds+through+activation+of+Sox2-positive+cells.">Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells.</a> Neural Development. 7, 13 (2012).</li><li>Mu&#241;oz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+laevis.">Spinal cord regeneration in Xenopus laevis.</a> Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+as+a+method+to+investigate+spinal+cord+regeneration+in+regenerative+and+nonregenerative+xenopus+stages.">Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+cells+from+pre-metamorphic+stages+differentiate+into+neurons+and+promote+axon+growth+and+regeneration+after+transplantation+into+the+injured+spinal+cord+of+non-regenerative+Xenopus+laevis+froglets.">Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).</li><li>de Vidts, S., M&#233;ndez-Olivos, E., Palacios, M., Larra&#305;n, J., Mery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spinal+cord+damage+based+on+automatic+video+analysis+of+froglet+swimming.">Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming.</a> Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).</li><li>Slater, P. G., Palacios, M., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus,+a+model+to+study+wound+healing+and+regeneration:+Experimental+approaches.">Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).</li><li>Lee-Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profile+of+the+response+to+spinal+cord+injury+in+Xenopus+laevis+reveals+extensive+differences+between+regenerative+and+non-regenerative+stages.">Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages.</a> Neural Development. 9, 12 (2014).</li><li>Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+after+spinal+cord+injury+(SCI)+in+a+regenerative+and+a+nonregenerative+stage+in+the+frog+Xenopus+laevis.">Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).</li><li>Pe&#241;ailillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+response+to+spinal+cord+injury+identi+fi+ed+a+key+role+for+mTORC1+signaling+in+the+activation+of+neural+stem+progenitor+cells.">Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+in+Xenopus+laevis.">Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis.</a> Neural Development. 16 (1), 2 (2021).</li><li>Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK-STAT+pathway+activation+in+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+of+Xenopus+laevis.">JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis.</a> Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).</li><li>Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+Xenopus+laevis+tadpole+stages+to+adult.">How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+availability+contributes+to+a+graded+refractory+period+for+regeneration+in+Xenopus+tropicalis.">Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).</li><li>Vleminckx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: Methods and protocols. , (2018).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Het hierin beschreven protocol is een uitstekende methode om dwarslaesie uit te voeren en functioneel herstel te evalueren. Voor reproduceerbaarheid is het essentieel om gezonde kikkervisjes te kweken en dieren te kiezen die qua grootte vergelijkbaar zijn. Gebrek aan goede voeding genereert voedingsstress, wat resulteert in slechte regeneratieve capaciteiten26; daarom moet speciale aandacht worden besteed aan het voeren van kikkervisjes. Als kikkervisjes na 3-4 weken stadium 50 bereiken, kunnen ze bij hogere temperaturen worden gekweekt om het groeiproces te versnellen, waarbij 18-25 ° C optimaal is27. Waterkwaliteit is belangrijk, omdat dieren gevoelig zijn voor wateromstandigheden en chemische producten. De optimale watercondities omvatten het gebruik van koolstofgefilterd, chloorvrij water met de volgende parameters: pH (6,5-7,5), chloride (<0,02 mg / L), geleidbaarheid van water (1,0 mS / cm ± 0,1 eenheden), koper (<0,3 mg / L); carbonaathardheid (KH: 5-10 dKH); algemene hardheid (GH: 6-16 dGH); nitraat (NO3: <20 mg/L); en nitriet (NO2: <0,1 mg/l)14,27,28. Bovendien, om besmetting te voorkomen, moeten plastic tanks eenmaal per week worden gereinigd voor het fokken van dieren of om de andere dag na de operatie door grondig te wassen met chloridevrij water en een spons; wasmiddel moet worden vermeden.
Voor een betere overlevingskans na de operatie mogen kikkervisjes niet gedurende lange perioden (niet langer dan 2 minuten) aan anesthesie worden blootgesteld. Bovendien wordt aanbevolen om één kikkervisje tegelijk te verdoven. Omdat de dieren gehydrateerd moeten blijven, houdt u de dieren de hele tijd voor en na de operatie ondergedompeld in de oplossing en giet u de oplossing met een lepel op het kikkervisje voordat u aan de operatie begint. Zorg ervoor dat de schade uitgebreid genoeg is om het hele ruggenmerg te bedekken, maar niet te uitgebreid, omdat dit een slecht functioneel herstel of de dood kan veroorzaken. Als het notochord beschadigd is, zal het dier worden gebogen en zal het functionele herstel worden beïnvloed. Als de schade verder reikt dan het notochord, neemt de kans op overlijden toe14. Tijdens de zwemtest wordt de opname als correct beschouwd als de software elk dier identificeert met een blauwe schaduw; anders moet de opname worden herhaald. Het is belangrijk om beweging en lucht- of lichtveranderingen tijdens het opnameproces te vermijden om opnamefouten te voorkomen.
Er zijn nog veel open vragen over de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ruggenmergschade en regeneratie. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, kan worden gebruikt om de bijdrage van verschillende cellulaire gebeurtenissen, genexpressie en behandelingen op functioneel herstel te bestuderen, bepaald door het meten van zwemcapaciteiten. Daarnaast kunnen vele andere technieken worden toegepast op de geopereerde dieren. Het ruggenmerg kan worden geïsoleerd om eiwit- en/of mRNA-extractie14 uit te voeren om eiwit- en genexpressieprofielen na beschadiging en behandeling te bestuderen19,20. Deze operatie is ook de basis geweest voor het bestuderen van de cellulaire respons van het ruggenmerg22 en het gedrag van neurale stamvoorlopercellen12,13,22 na dwarslaesie. Signaleringscascades die betrokken zijn bij de regeneratie van het ruggenmerg zijn ook bestudeerd met behulp van het paradigma voor ruggenmergschade dat hierin wordt beschreven23. Samenvattend is het hier beschreven protocol een uitstekend model om dwarslaesie en regeneratie te bestuderen en is het gebruikt voor vele studies die hebben bijgedragen aan de bestaande kennis over het onderwerp.

Dwarslaesie (SCI) is een aandoening die elk jaar wereldwijd ongeveer 250.000-500.000 mensen treft1. Naast deze hoge prevalentie beïnvloedt SCI sensorische en motorische zenuwen, waardoor verlamming onder de verwondingsplaats wordt gegenereerd en sommige interne organen worden losgekoppeld van de controle van het CZS. Het ruggenmerg, een deel van het CZS, kan niet regenereren en vanwege de complexiteit van de aandoening en het gebrek aan volledig begrip van alle betrokken processen, zijn er nog steeds geen efficiënte therapieën die functioneel herstel mogelijk maken.
Niet-zoogdierorganismen, zoals teleostvissen, amfibieën en larvale stadia van anuran amfibieën, die het ruggenmerg kunnen regenereren na ernstige SCI2,3,4, zijn uitstekende modelorganismen voor het bestuderen van de processen die een succesvolle regeneratieve gebeurtenis beheersen en het begrijpen van het falen van zoogdierregeneratie. Dit begrip is van groot belang omdat het originele inzichten kan bieden om nieuwe therapeutische doelen en mogelijke therapieën voor dwarslaesie te ontwikkelen.
De anurankikker, Xenopus laevis, is een uitstekend modelorganisme om dwarslaesie te bestuderen. Het heeft uitstekende regeneratieve capaciteiten tijdens de kikkervisstadia, die geleidelijk verloren gaan tijdens metamorfose, waardoor experimenten in de regeneratieve en niet-regeneratieve stadia mogelijk zijn3,5. De gevestigde verwondingsmethode voor het bestuderen van dwarslaesie bij Xenopus laevis kikkervisjes bestaat uit staartamputatie, waarbij de hele staart wordt verwijderd, inclusief weefsels zoals spieren, notochord en ruggenmerg6. Deze benadering heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van algemene mechanismen van regeneratieve processen4,7,8,9,10.
Omdat staartamputatie naast het ruggenmerg meerdere weefsels omvat, wat anders is dan wat er gebeurt na menselijke dwarslaesie, is een relevanter letselparadigma nodig voor de studie van dwarslaesie. We hebben vertrouwd op studies die in het verleden11 zijn gebruikt voor het genereren van uitgebreide beschrijvingen van letselparadigma's5,12,13,14 en verschillende methoden voor de studie van SCI12,13,14,15,16,17,18 . Na ruggenmergtranssectie kan het caudale deel van het ruggenmerg worden geïsoleerd voor RNA- en eiwitexpressie en high-throughput analyses14,19,20,21. Bovendien maken intracelomic injecties van geneesmiddelen en kleine moleculen, evenals elektroporatie van cDNA, RNA of morfolineos, vóór of na ruggenmergtranssectie, de studie mogelijk van de effecten van deze moleculen bij de preventie of behandeling van dwarslaesie of van specifieke gebeurtenissen die optreden na dwarslaesie en regeneratie van het ruggenmerg13,14 . Verder kunnen de evolutie van de verwonding en de regeneratieve processen op verschillende tijdstippen na het letsel worden bestudeerd met behulp van biochemische, moleculaire, histologische en functionele benaderingen12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Ten slotte kunnen alle bovengenoemde technieken worden gebruikt in niet-regeneratieve stadia, wat een van de belangrijkste voordelen benadrukt van het gebruik van Xenopus laevis als een modelorganisme om SCI te bestuderen, de vergelijkende studies van regeneratieve en niet-regeneratieve mechanismen in dezelfde soort13,19,20,21,22. Dit artikel presenteert een protocol voor Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie, te beginnen met de stadiëring en selectie van regeneratieve Nieuwkoop en Faber (NF) stadium 50 kikkervisjes. Dit wordt gevolgd door de beschrijving van de procedures voor ruggenmergchirurgie om schijn- en transected dieren te produceren, postoperatieve zorg en ten slotte de analyse van functioneel herstel door het meten van vrije kikkervisjes zwemafstand.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Regent CALM</td>
			<td>RC-006</td>
			<td>For oxygen diffuser stones function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANY-maze software</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#183;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60528</td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 
			1 available USB port, 1,366 &#215; 768 monitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>Surgery / staging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be found in different formats in the pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light box</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors for transection</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>Spring Scissors for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Anesthetic; tricaine mesylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>SB09480(LM)MX</td>
			<td>Food for Xenopus tadpoles stage&#160; 44 to 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen diffuser stones</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>AA1</td>
			<td>Mantainance of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont n&#176; 5 SF forceps</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z331740</td>
			<td>For collecting embryos after mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tank/box with lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.5 liter capacity; 20 cm &#215; 17 cm &#215; 15 cm or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablespoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis 
			specialized strains and lines</td>
			<td>National Xenopus Resource 
			European Xenopus Resource Centre 
			Xenopus laevis Research Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>http://www.mbl.edu/xenopus 
			https://xenopusresource.org/ 
			https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis wild type</td>
			<td>Xenopus 1 
			Xenopus Express</td>
			<td></td>
			<td>https://xenopus1.com 
			http://www.xenopus.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles

Dwarslaesie (SCI) is een permanente aandoening, die de motorische en sensorische zenuwen van het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast, wat resulteert in verlamming onder de plaats van het letsel. Tot op heden is er geen functionele hersteltherapie voor dwarslaesie en is er een gebrek aan duidelijkheid over de vele complexen en dynamische gebeurtenissen die zich voordoen na dwarslaesie. Veel niet-zoogdierorganismen kunnen regenereren na ernstige dwarslaesie, zoals teleostvissen, ongeroerde amfibieën en larvale stadia van anuran amfibieën, waaronder Xenopus laevis kikkervisjes. Dit zijn bonafide modelorganismen om de reactie op dwarslaesie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan succesvolle regeneratieve processen te bestuderen en te begrijpen. Dit type onderzoek kan leiden tot de identificatie van potentiële doelwitten voor sci-therapeutische interventie. In dit artikel wordt beschreven hoe u Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie uitvoert, inclusief houderij, chirurgie, postoperatieve zorg en functionele testevaluatie. Deze verwondingsmethode kan worden toegepast voor het ophelderen van de verschillende stappen van spinale regeneratie door het bestuderen van de cellulaire, moleculaire en genetische mechanismen, evenals histologische en functionele evolutie na dwarslaesie en tijdens regeneratie van het ruggenmerg.

Het hierin beschreven protocol maakt de studie van spinale regeneratie in Xenopus laevis mogelijk. De effecten van specifieke farmacologische behandelingen en de bijdrage van specifieke genexpressie aan de regeneratie van het ruggenmerg kunnen worden geëvalueerd door hun effecten op het zwemherstel te meten. De totale zwemafstand wordt uitgezet tegen de dagen na het letsel om de controle- en behandelde dieren op een bepaald tijdstip of over een bepaalde periode te vergelijken. Het herstel van de motorische functie door de tijd heen wordt geïllustreerd in figuur 3, die de zwemafstand toont op 5, 10, 15 en 20 dagen na de transsectie. 5 dagen na de transsectie zwommen dieren gemiddeld 0,7 m in 5 minuten, wat een verminderde zwemcapaciteit liet zien. Deze capaciteit nam toe met de voorbijgaande dagen, omdat een gemiddelde van 2,1 en 3,1 m / 5 min werd waargenomen na respectievelijk 10 en 15 dagen na transsectie, en volledig herstel van zwemcapaciteiten werd waargenomen op 20 dagen na transsectie, met een gemiddelde van 5,7 m / 5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig01.jpg"> Figuur 1: Xenopus kikkervisje enscenering. Representatieve beelden van stadia 49-51, met voor- en achterpoten voor dieren ensceneringsreferentie. Schaalbalken = 2 mm. Vergrotingen van het gebied in de doos worden rechtsonder in elke afbeelding weergegeven. Schaalbalken = 1 mm. In stadium 49 worden voorpoten niet waargenomen, terwijl achterpoten net verschijnen en een bolvorm vertonen. Stadium 50 presenteert voorpoten die net verschijnen, met een bolvorm en achterpoten die uitsteken met een bolvorm. In stadium 51 vertonen voorpoten een uitstekende bolvorm en achterpoten een uitstekende langwerpige vorm. Stippelvormige contouren tonen voor- en achterpoten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig02.jpg"> Figuur 2: Ruggenmergtranssectie. (A) Representatieve afbeelding met de juiste positionering van het dier, dorsale zijde naar boven, voor het uitvoeren van de operatie. Schaalbalk = 2 mm. (B) Vergroting van A toont de locatie en omvang van het letsel. Het rode kruis toont de exacte locatie van de verwondingsplaats op het thoracale niveau van het ruggenmerg en de stippellijn toont de omvang van het letsel. Schaalbalk = 1 mm. (C) Representatieve afbeelding met een zijdelings beeld van het thoracale niveau van het ruggenmerg. De uitbreiding van de schijnincisie en transsectie worden getoond. Stippellijnen bakenen de grenzen van het ruggenmerg af. Schaalbalk = 1 mm. (D) Representatieve afbeelding van een schijndier met een intact ruggenmerg. Schaalbalken = 1 mm. (E) Representatieve afbeelding van een getranscteerd dier met een onderbroken ruggenmerg. Schaalbalken = 1 mm. Vergrotingen van het gebied in de doos worden rechtsonder in elke afbeelding weergegeven (D' en E'). Schaalstaven = 1 mm. Afkortingen: S = schijnincisie; T = transsectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig03.jpg"> Figuur 3: Herstel van de zwemfunctie na verloop van tijd. Representatieve dot plot van de zwemafstand afgelegd door getransceerde dieren in 5 min op 5, 10, 15 en 20 dagen na transsectie. Voorbeelden van zwemtrajecten worden bovenaan weergegeven. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van 10 kikkervisjes. Afkortingen: dpT = dagen na transsectie; SEM = standaardfout van het gemiddelde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie is een relevante letselmethode om dwarslaesie en regeneratie te bestuderen door een dwarse snede te maken die het ruggenmerg volledig doorsnijdt op thoracale niveau.

Ruggenmerg transsectie in Xenopus laevis Kikkervis

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

Dit protocol maakt de studie van spinale regeneratie bij kikkers mogelijk. De opgedane kennis kan nieuwe inzichten opleveren om te begrijpen hoe mensen reageren op dwarslaesie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gemak bij het uitvoeren van de verwonding, en ook dat in vergelijking met het paradigma van staartamputatie, deze techniek beter nabootst wat er bij mensen gebeurt.Deze techniek maakt het mogelijk om het regeneratieve proces uit te dagen om de deelname van verschillende genen, eiwitten, moleculen en signaalroutes beter te begrijpen, waardoor nieuwe therapeutische doelen worden geïdentificeerd, Het vinden van de juiste plaats voor het genereren van de verwonding, evenals de uitbreiding ervan, is moeilijk. Het kunnen zien van die stappen is cruciaal om deze procedure eenvoudig en reproduceerbaar te maken. Plaats de kikkervisjes drie tot vier weken na de bevruchting in een petrischaaltje en controleer de morfologie en het uiterlijk van de voorpoten en achterpoten.Zoek naar de volgende anatomische kenmerken van stadium-50-dieren, voorpoten die net verschijnen en bolvormig zijn, en achterpoten die uitsteken en bolvormig zijn. Verdoof de kikkervisjes vóór de operatie door ze in 0,02% tricainemesylaat in 0,1 keer Barth-oplossing te plaatsen en controleer of de dieren niet reageren door ze ondersteboven te draaien. Om de ruggenmergtranssectieoperatie uit te voeren, gebruikt u een eetlepel en een tang om een verdoofde stadium-50 kikkervis dorsale kant omhoog te plaatsen op een nat stuk gaas in de bovenste helft van een glazen petrischaal.Maak vervolgens met behulp van een microdissectieveerschaar een incisie van de huid en dorsale spieren op midthoracaal niveau. Voor controle schijndieren, zorg ervoor dat de incisiegrootte slechts 0,2 millimeter is en het ruggenmerg niet beschadigt. Maak bij de getransecteerde dieren een tweede incisie van 0,2 millimeter om het ruggenmerg volledig te transecteren.Breng na de operatie de kikkervisjes over naar een tank met 500 milliliter 0,1 keer Barth-oplossing met één keer penicilline en streptomycine met een dichtheid van 10 tot 12 kikkervisjes per tank. Onderhoud de getransceerde en controleer schijnvisjes in afzonderlijke tanks. Houd de kikkervisjes met beluchting op een temperatuur van 20 tot 21 graden Celsius.Vervang de Barth-oplossing om de andere dag met antibiotica tot het einde van het experiment. Begin de kikkervisjes een dag na de operatie te voeren en elimineer de dode dieren. Koop voor de zwemtest een doos met LED-verlichting van binnenuit, bedekt met een transparant polystyreenvel waardoor licht doorlaat, en installeer een camera over de LED-doos.Plaats vervolgens een petrischaaltje met een diameter van 15 centimeter bovenop de doos gevuld met 100 milliliter 0,1 keer Barth-oplossing. Plaats een dag na de transsectie een kikkervisje in de petrischaal en laat het gedurende een aanpassingsperiode van vijf minuten staan. Start na de aanpassing met het volgen van het vrije zwemgedrag gedurende vijf minuten met behulp van de referentiesoftware.Nadat de video is voltooid, brengt u het kikkervisje terug naar de tank. Deze representatieve dot plot toont het herstel van de motorische functie door de tijd heen. Vijf dagen na de transsectie zwommen kikkervisjes gemiddeld 0,7 meter in vijf minuten, wat een verminderde zwemcapaciteit liet zien.Deze capaciteit nam toe met het verstrijken van de dagen, met een gemiddelde van 2,1 meter in vijf minuten na 10 dagen en 3,1 meter in vijf minuten na 15 dagen na de transsectie. Volledig herstel van de zwemcapaciteit werd waargenomen op 20 dagen na de transsectie, met een gemiddelde van 5,7 meter in vijf minuten. Het zwemgemiddelde kan variëren, afhankelijk van elke partij dieren.De experimentele groep moet dus altijd worden vergeleken met de respectieve controles en niet eerder verkregen gegevens. Na de operatie kunnen dieren worden gebruikt voor wereldwijde analyse, waaronder transcriptomics, proteomics en metabolomics, en om te screenen op verbindingen die de regeneratie van het ruggenmerg remmen of bevorderen, met als doel nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen.

Research

JoVE Journal

Biology

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic Inbedding en snijden van Xenopus laevis embryo&#39;s

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Het verkrijgen van Eieren van Xenopus laevis Teven

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Voorbereiding en Fractionering van Xenopus laevis Egg Extracten

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrofysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...