Name: spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles
Uploaded: 2021-12-10T14:45:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av forskningsstipend fra: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Denne protokollen gir nok informasjon til å kunne utføre ryggmargstranseksjon. Vær oppmerksom på at det er gode detaljerte protokoller av disse teknikkene publisert andre steder14, som kan utfylle den som presenteres her. Alle dyreprosedyrer er godkjent av Komiteen for bioetikk og biosikkerhet fra Fakultet for biovitenskap, Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Naturlig parring av frosker
<ol><li>Tre til fem dager før parring, prekutant preinject mannlige og kvinnelige frosker med 50 enheter av human chorion gonadotropin (hCG). Bruk "jernklo" -teknikken for å begrense froskene; siden froskene er glatte, bruk et nett for å omgi frosken om nødvendig. Sett spissen av en 26 G x 1/2" nål bakre til sidelinjen, skyv den dorsalt til en dybde på 1 cm, mellom huden og muskelen.</li>
	<li>Før parring, injiser hannen med 300 enheter og kvinnen med 700 enheter hCG.</li>
	<li>For parring, plasser hannen og kvinnen i 2 L 0,1x Barth-oppløsning umiddelbart etter avkjøling av løsningen ved 4 °C i 15 minutter for å ligne vårforholdene og la den stå over natten ved 18 °C.</li>
	<li>Seksten timer senere samler du forsiktig embryoene ved hjelp av en plast pasteurpipette, med spissen avskåret, og legg dem i 10 cm diameter Petri-retter. Fjern den embryonale geléjakken ved å inkubere embryoene med 25 ml 2% cystein i destillert vann (pH 7,8; sørg for at løsningen dekker embryoene) i 5 minutter med liten agitasjon. Vask 3 ganger med destillert vann og 3 ganger med 0,1x Barth-oppløsning (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hydroksyetyl)-1-piperazin etanesulfonsyre (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).</li>
	<li>Velg sunne embryoer som har en brunaktig farge og symmetrisk dele blastomerer. Legg embryoene i 10 cm diameter Petri retter med 50 ml 0,1x Barth-oppløsning med en tetthet på ikke mer enn 100 embryoer per tallerken.</li>
</ol>2. Husdyrhold
<ol><li>I løpet av den første uken, opprettholde embryoer ved 18 °C til de går av vitelline sac. I løpet av denne tiden, endre Barth-løsningen hver dag, og fjern hvite døde embryoer og tadpoles som presenterer enhver synlig anatomisk endring eller tadpoles uten svømmebevegelse.</li>
	<li>Etter den første uken, overfør tadpoles til klorfritt vann i plasttanker med en tetthet på 10 dyr per liter. Vokse tadpoles ved 20-21 °C med en 12-timers lys/12-timers mørk syklus, med oksygenstein tilgjengelig i hver tank for å vanne vannet og mates en gang om dagen med 0,5 mg per dyr. Skift ut vann en gang i uken og se etter akkumulert avfall og døde dyr daglig24.</li>
</ol>3. Iscenesettelse
<ol><li>Tre til fire uker etter befruktning, legg dyrene i en Petri-tallerken; Deretter, en etter en, sjekk morfologien og utseendet på forben og bakben. Om nødvendig bedøv dyrene ved å plassere dyrene i en Petri-tallerken med 50 ml 0,02% trikainmesylat i 0,1x Barth-løsning for bedre manipulering. Etter ikke mer enn 2 min, plasser dyrene i 0,1x Barth-løsning for utvinning fra anestesi.</li>
	<li>Se etter følgende anatomiske egenskaper ved trinn 50 dyr25: forben som bare vises og er sfæriske (figur 1); bakben som stikker ut og er sfæriske (figur 1). MERK: Dyr fra trinn 49 til 51 kan brukes til denne prosedyren (figur 1); Hvis du vil ha mer informasjon om stadier, kan du se Nieuwkoop og Fabers normaltabell over Xenopus laevis25.</li>
</ol>4. Kirurgi: ryggmargstranseksjon og sham-opererte dyr
<ol><li>Bedøv trinn 50 tadpoles ved å plassere dem i en Petri-tallerken med 50 ml 0,02% trikain mesylat i 0,1x Barth-oppløsning i 2 min.</li>
	<li>Ved hjelp av en spiseskje og tang, plasser tadpole, dorsal side-up, på et vått stykke gasbind i øvre halvdel av en glass Petri-tallerken.</li>
	<li>Utfør et snitt av hud- og dorsale muskler på midten av thoraxnivået (figur 2A, B) ved hjelp av mikrodeseksjonskildesaks.<ol>
<li>For kontroll sham dyr, sørg for at snittstørrelsen bare er ~ 0,2 mm (figur 2C); ryggmargen må ikke skades (figur 2D,D').</li>
		<li>For transekterte dyr, utfør et nytt snitt på ~ 0,2 mm (figur 2C) for å fullstendig transektere ryggmargen (figur 2E,E').</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Postsurgery omsorg
<ol><li>Etter operasjonen, overfør tadpoles til en tank som inneholder 0,5 L 0,1x Barth-løsning med 1x Penicillin-streptomycin, med en tetthet på 10-12 dyr per tank. Vedlikehold de transekterte og kontroller sham dyr i separate tanker. MERK: Tadpoles vil komme seg fra anestesi om et par minutter.</li>
	<li>Oppretthold tadpoles med lufting ved en temperatur på 20-21 °C.</li>
	<li>Endre Barth-løsningen med antibiotika annenhver dag til slutten av eksperimentet.</li>
	<li>Begynn å mate dyrene en dag etter operasjonen, en gang per dag.</li>
	<li>Eliminer døde dyr.</li>
</ol>6. Svømmeanalyse
<ol><li>Få en boks med LED-belysning fra innsiden, dekket med et gjennomsiktig polystyrenark, som gjør at lyset kan passere gjennom.</li>
	<li>Monter et kamera over LED-boksen.</li>
	<li>Legg en Petri-tallerken med en diameter på 15 cm på toppen av esken, fylt med 100 ml 0,1x barthoppløsning.</li>
	<li>En dag etter transeksjon, legg en tadpole i Petri-parabolen og la det stå i en 5 min tilpasningsperiode.</li>
	<li>Etter tilpasning, start videosporing av frisvømmingsatferden ved hjelp av den refererte programvaren (se materialtabellen) i 5 min.</li>
	<li>Etter at videoen er fullført, overfør tadpole tilbake til tanken.</li>
	<li>Gjenta videosporingen 5, 10, 15 og 20 dager etter transeksjon (figur 3).</li>
</ol>7. Bioetiske hensyn
MERK: Dødeligheten av dyr etter skamkirurgi og transeksjon er henholdsvis 13% og 30%. I tillegg er minimum 15-20 dyr per gruppe nødvendig for statistisk analyse. Start derfor med 23 sham og 26 transekterte dyr.
<ol><li>Bedøv dyrene med 0,02% trikain mesylat i 2 min for å sikre reduksjon i nevronal og motorisk aktivitet og smerte før operasjonen.</li>
	<li>Etter operasjonen, sjekk dyrene for utvinning fra anestesi. I tillegg, mate og sjekke dyrene daglig.</li>
	<li>Etter å ha fullført svømmeanalysen, ofre dyrene med en overdose trikain mesylat (1% trikain mesylat tilberedt i 30 mM natriumbikarbonatoppløsning).</li>
</ol>

<ol>
	<li>International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury">https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury</a> (2013)</li><li>Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Where+fish,+frogs+and+salamanders+lead+the+way,+can+we+follow.">Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow.</a> Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).</li><li>Lee-Liu, D., M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+African+clawed+frog+Xenopus+laevis:+A+model+organism+to+study+regeneration+of+the+central+nervous+system.">The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system.</a> Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).</li><li>Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+Xenopus.">Model systems for regeneration: Xenopus.</a> Development. 147 (6), (2020).</li><li>Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Lessons+for+mammals+from+non-mammalian+vertebrates.">Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates.</a> Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).</li><li>Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+needed+for+regeneration+of+spinal+cord+and+muscle+in+a+vertebrate.">Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate.</a> Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+gene+expression+during+Xenopus+tropicalis+tadpole+tail+regeneration.">Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Gargiolo, C., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+tracing+during+Xenopus+tail+regeneration.">Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration.</a> Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).</li><li>Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+neural+crest+derivatives+in+the+Xenopus+tadpole+tail.">Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail.</a> BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).</li><li>Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+spinal+cord+after+ablation+in+larval+Xenopus+laevistle.">Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle.</a> Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).</li><li>Gaete, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+tadpoles+proceeds+through+activation+of+Sox2-positive+cells.">Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells.</a> Neural Development. 7, 13 (2012).</li><li>Mu&#241;oz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+laevis.">Spinal cord regeneration in Xenopus laevis.</a> Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+as+a+method+to+investigate+spinal+cord+regeneration+in+regenerative+and+nonregenerative+xenopus+stages.">Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+cells+from+pre-metamorphic+stages+differentiate+into+neurons+and+promote+axon+growth+and+regeneration+after+transplantation+into+the+injured+spinal+cord+of+non-regenerative+Xenopus+laevis+froglets.">Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).</li><li>de Vidts, S., M&#233;ndez-Olivos, E., Palacios, M., Larra&#305;n, J., Mery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spinal+cord+damage+based+on+automatic+video+analysis+of+froglet+swimming.">Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming.</a> Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).</li><li>Slater, P. G., Palacios, M., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus,+a+model+to+study+wound+healing+and+regeneration:+Experimental+approaches.">Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).</li><li>Lee-Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profile+of+the+response+to+spinal+cord+injury+in+Xenopus+laevis+reveals+extensive+differences+between+regenerative+and+non-regenerative+stages.">Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages.</a> Neural Development. 9, 12 (2014).</li><li>Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+after+spinal+cord+injury+(SCI)+in+a+regenerative+and+a+nonregenerative+stage+in+the+frog+Xenopus+laevis.">Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).</li><li>Pe&#241;ailillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+response+to+spinal+cord+injury+identi+fi+ed+a+key+role+for+mTORC1+signaling+in+the+activation+of+neural+stem+progenitor+cells.">Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+in+Xenopus+laevis.">Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis.</a> Neural Development. 16 (1), 2 (2021).</li><li>Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK-STAT+pathway+activation+in+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+of+Xenopus+laevis.">JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis.</a> Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).</li><li>Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+Xenopus+laevis+tadpole+stages+to+adult.">How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+availability+contributes+to+a+graded+refractory+period+for+regeneration+in+Xenopus+tropicalis.">Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).</li><li>Vleminckx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: Methods and protocols. , (2018).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Protokollen som er beskrevet her, er en utmerket metode for å utføre SCI og evaluere funksjonell gjenoppretting. For reproduserbarhet er det viktig å dyrke sunne tadpoles og velge dyr som er like i størrelse. Mangel på riktig fôring genererer næringsstress, noe som resulterer i dårlig regenerativ kapasitet26; Derfor bør det tas særlig hensyn til tadpole fôring. Når tadpoles når trinn 50 etter 3-4 uker, kan de oppdrettes ved høyere temperaturer for å akselerere vekstprosessen, 18-25 °C er optimal27. Vannkvalitet er viktig, da dyr er følsomme for vannforhold og kjemiske produkter. De optimale vannforholdene inkluderer bruk av karbonfiltrert, klorfritt vann med følgende parametere: pH (6,5-7,5), klorid (<0,02 mg/l), ledningsevne av vann (1,0 mS/cm ± 0,1 enheter), kobber (<0,3 mg/l); karbonathardhet (KH: 5-10 dKH); generell hardhet (GH: 6-16 dGH); nitrat (NO3: <20 mg/l); og nitritt (NO2: <0,1 mg/l)14,27,28. I tillegg, for å unngå forurensning, bør plasttanker rengjøres en gang i uken for oppdrett av dyr eller annenhver dag etter operasjonen ved å vaske grundig med kloridfritt vann og en svamp; rengjøringsmiddel må unngås.
For en bedre overlevelsesrate etter operasjonen må tadpoles ikke utsettes for anestesi i lange perioder (ikke lenger enn 2 min). Videre anbefales det å bedøve en tadpole om gangen. Ettersom dyrene trenger å holde seg hydrert, hold dyrene nedsenket i løsning hele tiden før og etter operasjonen, og hell løsningen med en skje på toppen av tadpole før du begynner operasjonen. Forsikre deg om at skaden er omfattende nok til å dekke hele ryggmargen, men ikke for omfattende, da den kan indusere dårlig funksjonell utvinning eller død. Hvis notokordet er skadet, vil dyret bli bøyd, og den funksjonelle utvinningen vil bli påvirket. Hvis skaden strekker seg utover notokordet, øker sannsynligheten for død14. Under svømmeanalysen anses opptak som riktig hvis programvaren identifiserer hvert dyr med en blå skygge; Ellers bør opptaket gjentas. Det er viktig å unngå bevegelses- og luft- eller lysendringer under opptaksprosessen for å forhindre opptaksfeil.
Det er fortsatt mange åpne spørsmål om de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for ryggmargsskader og regenerering. Protokollen beskrevet i dette arbeidet kan brukes til å studere bidraget fra ulike cellulære hendelser, genuttrykk og behandlinger på funksjonell utvinning, bestemt ved å måle svømmekapasitet. I tillegg kan mange andre teknikker brukes på de opererte dyrene. Ryggmargen kan isoleres for å utføre protein- og/eller mRNA-ekstraksjon14 for å studere protein- og genuttrykksprofiler etter skade og behandling19,20. Denne operasjonen har også vært grunnlaget for å studere ryggmargen cellulær respons22 og oppførselen til nevrale stamceller 12,13,22 etter ryggmargsskade. Signalerende kaskader involvert i ryggmargsregenerering har også blitt studert ved hjelp av ryggmargsskadeparadigmet beskrevet heri23. Oppsummert er protokollen beskrevet her en utmerket modell for å studere ryggmargsskade og regenerering og har blitt brukt til mange studier som har bidratt til eksisterende kunnskap om emnet.

Ryggmargsskade (SCI) er en lidelse som rammer omtrent 250.000-500.000 mennesker over hele verden hvert år1. I tillegg til denne høye utbredelsen påvirker SCI sensoriske og motoriske nerver, og genererer lammelse under skadestedet og frakobling av noen indre organer fra kontrollen av CNS. Ryggmargen, en del av CNS, kan ikke regenerere, og på grunn av kompleksiteten i lidelsen og mangelen på fullstendig forståelse av alle involverte prosesser, er det fortsatt ingen effektive terapier som tillater funksjonell gjenoppretting.
Ikke-pattedyrorganismer, som teleostfisk, urodele amfibier og larvestadier av anuran amfibier, som kan regenerere ryggmargen etter alvorlig SCI2,3,4, er gode modellorganismer for å studere prosessene som styrer en vellykket regenerativ hendelse og forstå svikt i pattedyrregenerering. Denne forståelsen er av stor interesse, da den kan gi original innsikt for å utvikle nye terapeutiske mål og mulige terapier for SCI.
Den anuriske frosken, Xenopus laevis, er en utmerket modellorganisme for å studere SCI. Den har utmerket regenerativ kapasitet i tadpole-stadier, som gradvis går tapt under metamorfose, slik at eksperimentering i regenerative og ikke-regenerative stadier3,5. Den etablerte skademetoden for å studere SCI i Xenopus laevis tadpoles består av hale amputasjon, hvor hele halen fjernes, inkludert vev som muskel, notokord og ryggmarg6. Denne tilnærmingen har vært medvirkende i forståelsen av generelle mekanismer for regenerative prosesser4,7,8,9,10.
Ettersom hale amputasjon innebærer flere vev i tillegg til ryggmargen, som er forskjellig fra hva som skjer etter menneskelig SCI, er det nødvendig med et mer relevant skadeparadigme for studiet av SCI. Vi har stolt på studier brukt i det siste11 for å generere omfattende beskrivelser av skadeparadigmer5,12,13,14 og forskjellige metoder for studiet av SCI12,13,14,15,16,17,18 . Etter ryggmargstranseksjon kan den kaudale delen av ryggmargen isoleres for RNA og proteinuttrykk og høygjennomstrømningsanalyser14,19,20,21. I tillegg tillater intracelomiske injeksjoner av legemidler og små molekyler, samt elektroporasjon av cDNA, RNA eller morpholinos, før eller etter ryggmargstranseksjon, studiet av effekten av disse molekylene i forebygging eller behandling av SCI eller av spesifikke hendelser som oppstår etter SCI og ryggmargsregenerering13,14 . Videre kan skadeutvikling og regenerative prosesser studeres på forskjellige tidspunkter etter skade ved hjelp av biokjemiske, molekylære, histologiske og funksjonelle tilnærminger12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Til slutt kan alle de nevnte teknikkene brukes i ikke-regenerative stadier, og fremhever en av de viktigste fordelene ved å bruke Xenopus laevis som modellorganisme for å studere SCI, de komparative studiene av regenerative og ikke-regenerative mekanismer i samme art13,19,20,21,22. Dette papiret presenterer en protokoll for Xenopus laevis tadpole ryggmargstranseksjon, som starter med iscenesettelse og valg av regenerative Nieuwkoop og Faber (NF) trinn 50 tadpoles. Dette etterfølges av beskrivelsen av prosedyrene for ryggmargskirurgi for å produsere skam og transekterte dyr, postsurgisk omsorg, og til slutt analysen av funksjonell utvinning ved måling av fri tadpole svømmeavstand.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Regent CALM</td>
			<td>RC-006</td>
			<td>For oxygen diffuser stones function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANY-maze software</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#183;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60528</td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 
			1 available USB port, 1,366 &#215; 768 monitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>Surgery / staging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be found in different formats in the pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light box</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors for transection</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>Spring Scissors for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Anesthetic; tricaine mesylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>SB09480(LM)MX</td>
			<td>Food for Xenopus tadpoles stage&#160; 44 to 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen diffuser stones</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>AA1</td>
			<td>Mantainance of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont n&#176; 5 SF forceps</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z331740</td>
			<td>For collecting embryos after mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tank/box with lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.5 liter capacity; 20 cm &#215; 17 cm &#215; 15 cm or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablespoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis 
			specialized strains and lines</td>
			<td>National Xenopus Resource 
			European Xenopus Resource Centre 
			Xenopus laevis Research Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>http://www.mbl.edu/xenopus 
			https://xenopusresource.org/ 
			https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis wild type</td>
			<td>Xenopus 1 
			Xenopus Express</td>
			<td></td>
			<td>https://xenopus1.com 
			http://www.xenopus.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles

Ryggmargsskade (SCI) er en permanent lidelse, som påvirker sentralnervesystemet (CNS) motor og sensoriske nerver, noe som resulterer i lammelse under skadestedet. Til dags dato er det ingen funksjonell gjenopprettingsterapi for SCI, og det er mangel på klarhet angående de mange kompleksene og dynamiske hendelsene som oppstår etter SCI. Mange ikke-pattedyrorganismer kan regenerere etter alvorlig SCI, som teleostfisk, urodele amfibier og larvestadier av anuran amfibier, inkludert Xenopus laevis tadpoles. Dette er bona fide modellorganismer for å studere og forstå responsen på SCI og mekanismene som ligger til grunn for vellykkede regenerative prosesser. Denne typen forskning kan føre til identifisering av potensielle mål for SCI terapeutisk intervensjon. Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører Xenopus laevis tadpole ryggmargstranseksjon, inkludert husdyrhold, kirurgi, postsurgery omsorg og funksjonell testevaluering. Denne skademetoden kan brukes til å belyse de forskjellige trinnene i ryggmargsregenerering ved å studere cellulære, molekylære og genetiske mekanismer, samt histologisk og funksjonell evolusjon etter SCI og under regenerering av ryggmargen.

Protokollen beskrevet heri tillater studiet av ryggmargsregenerering i Xenopus laevis. Effektene av spesifikke farmakologiske behandlinger og bidraget av spesifikt genuttrykk i ryggmargsregenerering kan evalueres ved å måle effekten på svømmegjenvinning. Den totale svømmeavstanden plottes mot dagene etter skade for å sammenligne kontroll og behandlede dyr på et bestemt tidspunkt eller over en bestemt periode. Gjenvinningen av motorisk funksjon gjennom tiden er eksemplifisert i figur 3, og viser svømmeavstanden ved 5, 10, 15 og 20 dager etter transeksjon. På 5 dager etter transeksjon svømte dyrene i gjennomsnitt 0,7 m på 5 min, og viste redusert svømmekapasitet. Denne kapasiteten økte med de passerende dagene, da et gjennomsnitt på henholdsvis 2,1 og 3,1 m/5 min ble observert etter 10 og 15 dager etter transeksjon, og fullstendig gjenoppretting av svømmekapasitet ble observert ved 20 dager etter transeksjon, med et gjennomsnitt på 5,7 m / 5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig01.jpg"> Figur 1: Xenopus tadpole iscenesettelse. Representative bilder av trinn 49-51, som viser for- og bakben for dyreoppsamlingsreferanse. Skalastenger = 2 mm. Forstørrelser av det innrammede området vises nederst til høyre i hvert bilde. Skalastenger = 1 mm. I trinn 49 observeres ikke forben, mens bakben bare vises, og viser en sfærisk form. Trinn 50 presenterer forben som bare vises, og viser en sfærisk form og bakben som stikker ut med en sfærisk form. I trinn 51 presenterer forbenene en utstikkende sfærisk form og bakben en fremspringende langstrakt form. Stiplede konturer viser for- og bakben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig02.jpg"> Figur 2: Ryggmargstranseksjon. (A) Representativt bilde som viser riktig posisjonering av dyret, dorsal side opp, for å utføre operasjonen. Skalastang = 2 mm. (B) Forstørrelse av A viser plassering og skadeomfang. Røde kors viser den nøyaktige plasseringen av skadestedet på ryggmargens thoraxnivå, og den stiplede linjen viser skadeomfanget. Skalalinje = 1 mm. (C) Representativt bilde som viser en lateral visning av ryggmargens thoraxnivå. Utvidelsen av sham-snittet og transeksjonen vises. Stiplede linjer avgrenser grensene for ryggmargen. Skalastang = 1 mm. (D) Representativt bilde som viser et skamdyr med intakt ryggmarg. Skalastenger = 1 mm. (E) Representativt bilde som viser et transektert dyr med en avbrutt ryggmarg. Skalastenger = 1 mm. Forstørrelser av det innrammede området vises nederst til høyre i hvert bilde (D' og E'). Skalastenger = 1 mm. Forkortelser: S = sham snitt; T = transeksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig03.jpg"> Figur 3: Gjenoppretting av svømmefunksjon over tid. Representativ prikkplott av svømmeavstanden dekket av transekterte dyr i 5 min ved 5, 10, 15 og 20 dager etter transeksjon. Prøver av svømmebaner vises på toppen. Data presentert som gjennomsnittlig ± SEM fra 10 tadpoles. Forkortelser: dpT = dager etter transeksjon; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole ryggmargstranseksjon er en relevant skademetode for å studere ryggmargsskade og regenerering ved å lage et tverrsnitt som helt kutter ryggmargen på thoraxnivå.

Ryggmargstranseksjon i Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

Denne protokollen tillater studiet av ryggmargsregenerering hos frosker. Kunnskapen som er tilegnet kan gi ny innsikt for å forstå hvordan mennesker reagerer på ryggmargsskade. Den største fordelen med denne protokollen er lettheten i å utføre skaden, og også at sammenlignet med paradigmet med hale amputasjon, etterligner denne teknikken bedre hva som skjer hos mennesker.Denne teknikken gjør det mulig å utfordre den regenerative prosessen for å bedre forstå deltakelsen av forskjellige gener, proteiner, molekyler og signalveier, og dermed identifisere nye terapeutiske mål, Finne det rette stedet for å generere skaden, så vel som utvidelsen, er vanskelig. Å kunne se disse trinnene er avgjørende for å gjøre denne prosedyren enkel og reproduserbar. Tre til fire uker etter befruktning, plasser tadpoles i en Petri-tallerken og kontroller morfologien og utseendet til forbenene og bakre lemmer.Se etter følgende anatomiske egenskaper ved scene-50 dyr, fore lemmer som bare vises og er sfæriske, og bakre lemmer som stikker ut og er sfæriske. Før operasjonen bedøves tadpoles ved å plassere dem i 0,02% trikain mesylat i 0,1 ganger Barth-løsningen, og kontroller at dyrene ikke er responsive ved å snu dem opp ned. For å utføre ryggmargstranseksjonsoperasjonen, bruk en spiseskje og tang for å plassere en bedøvet stadium-50 tadpole dorsal side opp på et vått stykke gasbind i øvre halvdel av en glass Petri-tallerken.Deretter, ved hjelp av mikrodisseksjon vår saks, gjør et snitt av huden og dorsale muskler på midthoracic nivå. For kontroll sham dyr, sørg for at snittstørrelsen er bare 0,2 millimeter og ikke skader ryggmargen. I de transekterte dyrene, gjør et nytt snitt på 0,2 millimeter for å fullstendig transektere ryggmargen.Etter operasjonen, overfør tadpoles til en tank som inneholder 500 milliliter av 0,1 ganger Barth løsning med en ganger penicillin og streptomycin med en tetthet på 10 til 12 tadpoles per tank. Vedlikehold de transekterte og kontroller sham tadpoles i separate tanker. Oppretthold tadpoles med lufting ved en temperatur på 20 til 21 grader Celsius.Endre Barth-løsningen med antibiotika annenhver dag til slutten av eksperimentet. Begynn å mate tadpoles en dag etter operasjonen og eliminere de døde dyrene. For svømmeanalysen, få en boks med LED-belysning fra innsiden, dekket med et gjennomsiktig polystyrenark som gjør at lyset kan passere gjennom, og installer et kamera over LED-boksen.Legg deretter en Petri-tallerken med 15 centimeter diameter på toppen av esken fylt med 100 milliliter 0,1 ganger Barth-løsning. En dag etter transeksjon, legg en tadpole i Petri-parabolen og la den stå i en fem minutters tilpasningsperiode. Etter tilpasning, start videosporing av frisvømmingsatferden ved hjelp av referanseprogramvaren i fem minutter.Etter at videoen er fullført, overfør tadpole tilbake til tanken. Denne representative prikkplottet viser utvinning av motorisk funksjon gjennom tidene. Fem dager etter transeksjon svømte tadpoles i gjennomsnitt 0,7 meter på fem minutter, noe som viser redusert svømmekapasitet.Denne kapasiteten økte med passerende dager, og viste et gjennomsnitt på 2,1 meter på fem minutter etter 10 dager, og 3,1 meter på fem minutter etter 15 dager etter transeksjon. Fullstendig utvinning av svømmekapasitet ble observert ved 20 dager etter transeksjon, med et gjennomsnitt på 5,7 meter på fem minutter. Svømmegjennomsnittet kan variere avhengig av hvert parti dyr.Dermed bør den eksperimentelle gruppen alltid sammenlignes med de respektive kontrollene og ikke tidligere innhentede data. Etter operasjonen kan dyr brukes til global analyse, inkludert transkripsjon, proteomikk og metabolomikk, og til å screene for forbindelser som hemmer eller fremmer regenerering av ryggmargen, med sikte på å utvikle nye terapeutiske tilnærminger.

Research

JoVE Journal

Biology

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Ansikts transplantasjoner i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...