Name: spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles
Uploaded: 2021-12-10T14:45:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Detta arbete finansierades av forskningsbidrag från: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Detta protokoll ger tillräckligt med information för att framgångsrikt utföra ryggmärgstranssektion. Observera att det finns utmärkta detaljerade protokoll för dessa tekniker som publiceras någon annanstans14, som kan komplettera den som presenteras här. Alla djurförsök har godkänts av kommittén för bioetik och biosäkerhet från fakulteten för biologiska vetenskaper, Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Naturlig parning av grodor
<ol><li>Tre till fem dagar före parning injicerar subkutant manliga och kvinnliga grodor med 50 enheter humant korionisk gonadotropin (hCG). Använd "järnklo" -tekniken för att begränsa grodorna; eftersom grodorna är hala, använd ett nät för att omge grodan om det behövs. Sätt in spetsen på en 26 G x 1/2 "nål bakom sidolinjen och tryck den dorsalt till ett djup av 1 cm, mellan huden och muskeln.</li>
	<li>Innan parning, injicera hanen med 300 enheter och honan med 700 enheter hCG.</li>
	<li>För att parning ska ske, placera hanen och honan i 2 liter 0,1x Barth-lösning omedelbart efter kylning av lösningen vid 4 °C i 15 minuter för att likna vårförhållandena och låt stå över natten vid 18 °C.</li>
	<li>Sexton timmar senare, samla försiktigt embryon med hjälp av en pasteurpipett av plast, med spetsen avskuren, och placera dem i petriskålar med en diameter på 10 cm. Ta bort den embryonala gelébeläggningen genom att inkubera embryona med 25 ml 2% cystein i destillerat vatten (pH 7,8; se till att lösningen täcker embryona) i 5 minuter med lätt omrörning. Tvätta 3 gånger med destillerat vatten och 3 gånger med 0,1x Barth-lösning (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hydroxietyl)-1-piperazin etansulfonsyra (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).</li>
	<li>Välj friska embryon som har en brunaktig färg och symmetriskt delande blastomerer. Placera embryon i petriskålar med en diameter på 10 cm med 50 ml 0,1x Barth-lösning med en densitet av högst 100 embryon per skål.</li>
</ol>2. Djurhållning
<ol><li>Under den första veckan, behåll embryon vid 18 ° C tills de kommer av vitellinsäcken. Under denna tid, byt Barth-lösningen varje dag och ta bort vitaktiga döda embryon och tadpoles som presenterar någon synlig anatomisk förändring eller tadpoles utan någon simrörelse.</li>
	<li>Efter den första veckan, överför tadpoles till klorfritt vatten i plasttankar med en densitet av 10 djur per liter. Odla grodyngel vid 20-21 ° C med en 12-timmars ljus / 12-timmars mörk cykel, med syrestenar tillgängliga i varje tank för att lufta vattnet och matas en gång om dagen med 0,5 mg per djur. Byt ut vatten en gång i veckan och kontrollera om det finns ackumulerat avfall och döda djur dagligen24.</li>
</ol>3. Iscensättning
<ol><li>Tre till fyra veckor efter befruktningen, placera djuren i en petriskål; sedan, en efter en, kontrollera morfologin och utseendet på framben och bakben. Bedöva vid behov djuren genom att placera djuren i en petriskål med 50 ml 0,02% trikain-mesylat i 0,1x Barth-lösning för bättre manipulation. Efter högst 2 minuter, placera djuren i 0,1x Barth-lösning för återhämtning från anestesi.</li>
	<li>Leta efter följande anatomiska egenskaper hos djur i steg 5025: framben som bara dyker upp och är sfäriska (Figur 1); bakben som sticker ut och är sfäriska (Figur 1). OBS: Djur från steg 49 till 51 kan användas för detta förfarande (figur 1). För mer information om etapper, se Nieuwkoop och Fabers normala tabell över Xenopus laevis25.</li>
</ol>4. Kirurgi: ryggmärgstranssektion och skamdrivna djur
<ol><li>Bedöva steg 50 tadpoles genom att placera dem i en petriskål med 50 ml 0,02% trikain mesylat i 0,1x Barth-lösning i 2 min.</li>
	<li>Med hjälp av en matsked och pincett, placera tadpole, dorsal side-up, på en våt bit gasväv i den övre halvan av en glas petriskål.</li>
	<li>Utför ett snitt av huden och dorsala muskler på mitten av bröstkorgen (figur 2A, B) med hjälp av mikrodissektionsfjädersax.<ol>
<li>För kontroll av skendjur, se till att snittstorleken endast är ~ 0,2 mm (figur 2C); skada inte ryggmärgen (figur 2D,D').</li>
		<li>För transekterade djur, utför ett andra snitt på ~ 0,2 mm (figur 2C) för att helt transektera ryggmärgen (figur 2E,E').</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vård efter operation
<ol><li>Efter operationen överför tadpolesna till en tank innehållande 0,5 liter 0,1x Barth-lösning med 1x Penicillin-streptomycin, vid en densitet av 10-12 djur per tank. Behåll de transekterade och kontrollera skendjur i separata tankar. OBS: Tadpoles kommer att återhämta sig från anestesin på ett par minuter.</li>
	<li>Håll grodynglarna med aering vid en temperatur av 20-21 °C.</li>
	<li>Byt Barth-lösningen med antibiotika varannan dag till slutet av experimentet.</li>
	<li>Börja mata djuren en dag efter operationen, en gång per dag.</li>
	<li>Eliminera döda djur.</li>
</ol>6. Simning analys
<ol><li>Skaffa en låda med LED-belysning från insidan, täckt med ett transparent polystyrenark, vilket gör att ljuset kan passera igenom.</li>
	<li>Installera en kamera över LED-rutan.</li>
	<li>Placera en petriskål med en diameter på 15 cm ovanpå lådan, fylld med 100 ml 0,1x Barth-lösning.</li>
	<li>En dag efter transsektion, lägg en grodyngel i petriskålen och låt stå i en 5 minuters anpassningsperiod.</li>
	<li>Efter anpassning, börja videospåra det frisimande beteendet med hjälp av den refererade programvaran (se materialförteckningen) i 5 minuter.</li>
	<li>När videon är klar, överför tadpole tillbaka till tanken.</li>
	<li>Upprepa videospårningen 5, 10, 15 och 20 dagar efter transsektion (figur 3).</li>
</ol>7. Bioetiska överväganden
OBS: Dödligheten hos djur efter bluffkirurgi och transektion är 13% respektive 30%. Dessutom är minst 15-20 djur per grupp nödvändigt för statistisk analys. Börja därför med 23 sham och 26 transected djur.
<ol><li>Bedöva djuren med 0,02% trikain mesylat i 2 min för att säkerställa minskning av neuronal och motorisk aktivitet och smärta före operationen.</li>
	<li>Efter operationen, kontrollera djuren för återhämtning från anestesi. Dessutom mata och kontrollera djuren dagligen.</li>
	<li>Efter avslutad simningsanalys, offra djuren med en överdos av trikainmetylat (1% trikainmetsylat framställt i 30 mM natriumbikarbonatlösning).</li>
</ol>

<ol>
	<li>International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury">https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury</a> (2013)</li><li>Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Where+fish,+frogs+and+salamanders+lead+the+way,+can+we+follow.">Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow.</a> Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).</li><li>Lee-Liu, D., M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+African+clawed+frog+Xenopus+laevis:+A+model+organism+to+study+regeneration+of+the+central+nervous+system.">The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system.</a> Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).</li><li>Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+Xenopus.">Model systems for regeneration: Xenopus.</a> Development. 147 (6), (2020).</li><li>Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+Lessons+for+mammals+from+non-mammalian+vertebrates.">Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates.</a> Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).</li><li>Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+needed+for+regeneration+of+spinal+cord+and+muscle+in+a+vertebrate.">Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate.</a> Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+gene+expression+during+Xenopus+tropicalis+tadpole+tail+regeneration.">Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Gargiolo, C., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+tracing+during+Xenopus+tail+regeneration.">Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration.</a> Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).</li><li>Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+neural+crest+derivatives+in+the+Xenopus+tadpole+tail.">Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail.</a> BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).</li><li>Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+spinal+cord+after+ablation+in+larval+Xenopus+laevistle.">Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle.</a> Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).</li><li>Gaete, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+tadpoles+proceeds+through+activation+of+Sox2-positive+cells.">Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells.</a> Neural Development. 7, 13 (2012).</li><li>Mu&#241;oz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+laevis.">Spinal cord regeneration in Xenopus laevis.</a> Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+as+a+method+to+investigate+spinal+cord+regeneration+in+regenerative+and+nonregenerative+xenopus+stages.">Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).</li><li>M&#233;ndez-Olivos, E. E., Mu&#241;oz, R., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+cells+from+pre-metamorphic+stages+differentiate+into+neurons+and+promote+axon+growth+and+regeneration+after+transplantation+into+the+injured+spinal+cord+of+non-regenerative+Xenopus+laevis+froglets.">Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).</li><li>de Vidts, S., M&#233;ndez-Olivos, E., Palacios, M., Larra&#305;n, J., Mery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spinal+cord+damage+based+on+automatic+video+analysis+of+froglet+swimming.">Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming.</a> Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).</li><li>Slater, P. G., Palacios, M., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus,+a+model+to+study+wound+healing+and+regeneration:+Experimental+approaches.">Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).</li><li>Lee-Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profile+of+the+response+to+spinal+cord+injury+in+Xenopus+laevis+reveals+extensive+differences+between+regenerative+and+non-regenerative+stages.">Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages.</a> Neural Development. 9, 12 (2014).</li><li>Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larra&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+after+spinal+cord+injury+(SCI)+in+a+regenerative+and+a+nonregenerative+stage+in+the+frog+Xenopus+laevis.">Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).</li><li>Pe&#241;ailillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+response+to+spinal+cord+injury+identi+fi+ed+a+key+role+for+mTORC1+signaling+in+the+activation+of+neural+stem+progenitor+cells.">Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).</li><li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+in+Xenopus+laevis.">Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis.</a> Neural Development. 16 (1), 2 (2021).</li><li>Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK-STAT+pathway+activation+in+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+of+Xenopus+laevis.">JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis.</a> Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).</li><li>Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+Xenopus+laevis+tadpole+stages+to+adult.">How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+availability+contributes+to+a+graded+refractory+period+for+regeneration+in+Xenopus+tropicalis.">Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).</li><li>Vleminckx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: Methods and protocols. , (2018).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Protokollet som beskrivs här är en utmärkt metod för att utföra SCI och utvärdera funktionell återhämtning. För reproducerbarhet är det viktigt att odla friska tadpoles och välja djur som är lika stora. Brist på korrekt utfodring genererar näringsstress, vilket resulterar i dålig regenerativ kapacitet26. Därför bör särskild uppmärksamhet ägnas åt tadpole utfodring. När grodyngel når steg 50 efter 3-4 veckor kan de födas upp vid högre temperaturer för att påskynda tillväxtprocessen, 18-25 ° C är optimal27. Vattenkvaliteten är viktig, eftersom djur är känsliga för vattenförhållanden och kemiska produkter. De optimala vattenförhållandena inkluderar användning av kolfiltrerat, klorfritt vatten med följande parametrar: pH (6,5-7,5), klorid (<0,02 mg / L), konduktivitet hos vatten (1,0 mS / cm ± 0,1 enheter), koppar (<0,3 mg / L); karbonathårdhet (KH: 5-10 dKH); allmän hårdhet (GH: 6-16 dGH); nitrat (NO3: <20 mg/l); och nitrit (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. För att undvika kontaminering bör plasttankar rengöras en gång i veckan för uppfödning av djur eller varannan dag efter operationen genom att tvätta noggrant med kloridfritt vatten och en svamp. tvättmedel måste undvikas.
För en bättre överlevnad efter operationen får grodyngel inte utsättas för anestesi under långa perioder (högst 2 minuter). Dessutom rekommenderas att bedöva en tadpole i taget. Eftersom djuren behöver hålla sig hydratiserade, håll djuren nedsänkta i lösning hela tiden före och efter operationen och häll lösningen med en sked ovanpå tadpole innan operationen påbörjas. Se till att skadan är tillräckligt omfattande för att täcka hela ryggmärgen men inte för omfattande eftersom det kan inducera dålig funktionell återhämtning eller död. Om notokordet är skadat kommer djuret att böjas och den funktionella återhämtningen påverkas. Om skadan sträcker sig bortom notokordet ökar sannolikheten för dödsfall14. Under simningsanalysen anses registreringen vara korrekt om programvaran identifierar varje djur med en blå skugga; annars bör inspelningen upprepas. Det är viktigt att undvika rörelse och luft- eller ljusförändringar under inspelningsprocessen för att förhindra inspelningsfel.
Det finns fortfarande många öppna frågor om de cellulära och molekylära mekanismerna bakom ryggmärgsskador och regenerering. Protokollet som beskrivs i detta arbete kan användas för att studera bidraget från olika cellulära händelser, genuttryck och behandlingar på funktionell återhämtning, bestämd genom att mäta simkapacitet. Dessutom kan många andra tekniker tillämpas på de opererade djuren. Ryggmärgen kan isoleras för att utföra protein- och/eller mRNA-extraktion14 för att studera protein- och genuttrycksprofiler efter skada och behandling19,20. Denna operation har också legat till grund för att studera ryggmärgscellulära svar22 och beteendet hos neurala stamstamceller12,13,22 efter ryggmärgsskada. Signalkaskader som är involverade i ryggmärgsregenerering har också studerats med hjälp av ryggmärgsskadeparadigmet som beskrivs häri23. Sammanfattningsvis är protokollet som beskrivs här en utmärkt modell för att studera ryggmärgsskada och regenerering och har använts för många studier som har bidragit till den befintliga kunskapen om ämnet.

Ryggmärgsskada (SCI) är ett lidande som drabbar cirka 250 000-500 000 människor världen över varje år1. Förutom denna höga prevalens påverkar SCI sensoriska och motoriska nerver, vilket genererar förlamning under skadestället och frånkoppling av vissa inre organ från CNS: s kontroll. Ryggmärgen, en del av CNS, kan inte regenerera, och på grund av lidandets komplexitet och bristen på fullständig förståelse för alla involverade processer finns det fortfarande inga effektiva terapier som möjliggör funktionell återhämtning.
Icke-däggdjursorganismer, såsom teleostfiskar, urodele-amfibier och larvstadier av anuranamfibier, som kan regenerera ryggmärgen efter svår SCI2,3,4, är utmärkta modellorganismer för att studera de processer som styr en framgångsrik regenerativ händelse och förstå misslyckandet med däggdjursregenerering. Denna förståelse är av stort intresse eftersom den kan ge originella insikter för att utveckla nya terapeutiska mål och möjliga terapier för SCI.
Anurangrodan, Xenopus laevis, är en utmärkt modellorganism för att studera SCI. Den har utmärkt regenerativ kapacitet under grodyngelstadierna, som gradvis går förlorade under metamorfos, vilket möjliggör experiment i de regenerativa och icke-regenerativa stadierna3,5. Den etablerade skademetoden för att studera SCI i Xenopus laevis tadpoles består av svansamputation, där hela svansen avlägsnas, inklusive vävnader som muskler, notokord och ryggmärg6. Detta tillvägagångssätt har varit avgörande för förståelsen av allmänna mekanismer för regenerativa processer4,7,8,9,10.
Eftersom svansamputation involverar flera vävnader utöver ryggmärgen, vilket skiljer sig från vad som händer efter mänsklig SCI, behövs ett mer relevant skadeparadigm för studier av SCI. Vi har förlitat oss på studier som använts tidigare11 för att generera omfattande beskrivningar av skadeparadigmer5,12,13,14 och olika metoder för studier av SCI12,13,14,15,16,17,18 . Efter ryggmärgstranssektion kan den kaudala delen av ryggmärgen isoleras för RNA- och proteinuttryck och analyser med hög genomströmning14,19,20,21. Dessutom tillåter intracelomiska injektioner av läkemedel och små molekyler, liksom elektroporering av cDNA, RNA eller morfolinos, före eller efter ryggmärgstranssektion, studier av effekterna av dessa molekyler vid förebyggande eller behandling av SCI eller av specifika händelser som inträffar efter SCI och ryggmärgsregenerering13,14 . Vidare kan skadeutveckling och de regenerativa processerna studeras vid olika tidpunkter efter skada med hjälp av biokemiska, molekylära, histologiska och funktionella metoder12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Slutligen kan alla ovannämnda tekniker användas i icke-regenerativa stadier, vilket belyser en av de viktigaste fördelarna med att använda Xenopus laevis som modellorganism för att studera SCI, de jämförande studierna av regenerativa och icke-regenerativa mekanismer hos samma art13,19,20,21,22. Detta dokument presenterar ett protokoll för Xenopus laevis tadpole ryggmärgstranssektion, som börjar med iscensättning och urval av regenerativa Nieuwkoop och Faber (NF) steg 50 grodyngel. Detta följs av beskrivningen av förfarandena för ryggmärgskirurgi för att producera falska och transekterade djur, postkirurgisk vård och slutligen analysen av funktionell återhämtning genom mätning av fritt tadpole-simavstånd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Regent CALM</td>
			<td>RC-006</td>
			<td>For oxygen diffuser stones function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANY-maze software</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#183;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60528</td>
			<td>Swimming behavior test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 
			1 available USB port, 1,366 &#215; 768 monitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>Surgery / staging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be found in different formats in the pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light box</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors for transection</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>Spring Scissors for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Anesthetic; tricaine mesylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>SB09480(LM)MX</td>
			<td>Food for Xenopus tadpoles stage&#160; 44 to 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen diffuser stones</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>AA1</td>
			<td>Mantainance of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont n&#176; 5 SF forceps</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z331740</td>
			<td>For collecting embryos after mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tank/box with lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.5 liter capacity; 20 cm &#215; 17 cm &#215; 15 cm or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablespoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis 
			specialized strains and lines</td>
			<td>National Xenopus Resource 
			European Xenopus Resource Centre 
			Xenopus laevis Research Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>http://www.mbl.edu/xenopus 
			https://xenopusresource.org/ 
			https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis wild type</td>
			<td>Xenopus 1 
			Xenopus Express</td>
			<td></td>
			<td>https://xenopus1.com 
			http://www.xenopus.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord transection in xenopus laevis tadpoles

Ryggmärgsskada (SCI) är en permanent åkomma som påverkar centrala nervsystemet (CNS) motoriska och sensoriska nerver, vilket resulterar i förlamning under skadestället. Hittills finns det ingen funktionell återhämtningsterapi för SCI, och det finns en brist på klarhet när det gäller de många komplex och dynamiska händelser som inträffar efter SCI. Många icke-däggdjursorganismer kan regenerera efter svår SCI, såsom teleostfiskar, urodele-amfibier och larvstadier av anuranamfibier, inklusive Xenopus laevis tadpoles. Dessa är bona fide modellorganismer för att studera och förstå svaret på SCI och mekanismerna bakom framgångsrika regenerativa processer. Denna typ av forskning kan leda till identifiering av potentiella mål för SCI-terapeutisk intervention. Denna artikel beskriver hur man utför Xenopus laevis tadpole ryggmärgstranssektion, inklusive djurhållning, kirurgi, postkirurgisk vård och funktionell testutvärdering. Denna skademetod kan tillämpas för att belysa de olika stegen i ryggmärgsregenerering genom att studera de cellulära, molekylära och genetiska mekanismerna, såväl som histologisk och funktionell utveckling efter SCI och under ryggmärgsregenerering.

Protokollet som beskrivs häri möjliggör studier av ryggmärgsregenerering i Xenopus laevis. Effekterna av specifika farmakologiska behandlingar och bidraget från specifikt genuttryck vid regenerering av ryggmärg kan utvärderas genom att mäta deras effekter på simningens återhämtning. Den totala simsträckan ritas mot dagarna efter skadan för att jämföra kontroll och behandlade djur vid en viss tidpunkt eller under en viss period. Återhämtningen av motorisk funktion genom tiden exemplifieras i figur 3, som visar simsträckan vid 5, 10, 15 och 20 dagar efter transsektion. Vid 5 dagar efter transsektion simmade djuren i genomsnitt 0,7 m på 5 minuter, vilket visar en minskad simkapacitet. Denna kapacitet ökade med de dagar som gick, eftersom i genomsnitt 2,1 och 3,1 m/5 min observerades efter 10 respektive 15 dagar efter transsektion, och fullständig återhämtning av simkapaciteten observerades vid 20 dagar efter transsektion, med ett genomsnitt på 5,7 m/5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig01.jpg"> Figur 1: Xenopus grodyngel iscensättning. Representativa bilder av steg 49-51, som visar fram- och bakben för djur iscensättningsreferens. Skalstänger = 2 mm. Förstoringar av det boxade området visas längst ned till höger på varje bild. Skalstänger = 1 mm. I steg 49 observeras inte framben, medan bakben bara visas och visar en sfärisk form. Steg 50 presenterar framben som just dyker upp, visar en sfärisk form och bakben som sticker ut med en sfärisk form. I steg 51 presenterar frambenen en utskjutande sfärisk form och bakbenen en utskjutande långsträckt form. Streckade konturer visar fram- och bakben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig02.jpg"> Figur 2: Ryggmärgstranssektion. (A) Representativ bild som visar korrekt positionering av djuret, med ryggsidan uppåt, för att utföra operationen. Skalstång = 2 mm. (B) Förstoring av A visar skadans placering och omfattning. Det röda korset visar den exakta platsen för skadestället vid ryggmärgens bröstkorgsnivå, och den streckade linjen visar skadans omfattning. Skalstång = 1 mm. (C) Representativ bild som visar en sidovy av ryggmärgens bröstkorgsnivå. Förlängningen av skamsnittet och transektionen visas. Streckade linjer avgränsar ryggmärgsgränserna. Skalstång = 1 mm. (D) Representativ bild som visar ett skendjur med intakt ryggmärg. Skalstänger = 1 mm. (E) Representativ bild som visar ett transekterat djur med en avbruten ryggmärg. Skalstänger = 1 mm. Förstoringar av det boxade området visas längst ned till höger på varje bild (D' och E'). Skalstänger = 1 mm. Förkortningar: S = sham snitt; T = transektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig03.jpg"> Figur 3: Återhämtning av simfunktionen över tid. Representativ prickplottning av simsträckan som täcks av transekterade djur på 5 minuter vid 5, 10, 15 och 20 dagar efter transsektion. Prover av simbanor visas ovanpå. Data som presenteras som medelvärde ± SEM från 10 tadpoles. Förkortningar: dpT = dagar efter transsektion; SEM = standardfel i medelvärdet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles at JoVE.com

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole ryggmärgstranssektion är en relevant skademetod för att studera ryggmärgsskada och regenerering genom att göra ett tvärgående snitt som helt skär av ryggmärgen på bröstnivå.

Ryggmärgstranssektion i Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

Detta protokoll möjliggör studier av ryggmärgsregenerering hos grodor. Den kunskap som förvärvats kan ge nya insikter för att förstå hur människor svarar på ryggmärgsskada. Den största fördelen med detta protokoll är lättheten att utföra skadan, och även att jämfört med paradigmet för svansamputation efterliknar denna teknik bättre vad som händer hos människor.Denna teknik gör det möjligt att utmana den regenerativa processen för att bättre förstå deltagandet av olika gener, proteiner, molekyler och signalvägar och därigenom identifiera nya terapeutiska mål, Att hitta rätt plats för att generera skadan, liksom dess förlängning, är svårt. Att kunna se dessa steg är avgörande för att göra denna procedur enkel och reproducerbar. Tre till fyra veckor efter befruktningen, placera tadpoles i en petriskål och kontrollera morfologin och utseendet på frambenen och bakbenen.Leta efter följande anatomiska egenskaper hos djur i steg 50, främre extremiteter som bara uppträder och är sfäriska och bakben som sticker ut och är sfäriska. Före operationen, bedöva tadpoles genom att placera dem i 0,02% trikain mesylat i 0,1 gånger Barth-lösningen och kontrollera att djuren inte svarar genom att vända dem upp och ner. För att utföra ryggmärgstransektionsoperationen, använd en matsked och pincett för att placera en sövd stadium-50 tadpole dorsal sida upp på en våt bit gasväv i den övre halvan av en glas petriskål.Sedan, med hjälp av mikrodissektion vårsax, gör ett snitt av huden och dorsala muskler på midthoracic nivå. För kontroll av skendjur, se till att snittstorleken bara är 0,2 millimeter och inte skadar ryggmärgen. I de transekterade djuren, gör ett andra snitt på 0,2 millimeter för att helt transektera ryggmärgen.Efter operationen överför tadpolesna till en tank innehållande 500 ml 0,1 gånger Barth-lösning med en gång penicillin och streptomycin vid en densitet av 10 till 12 tadpoles per tank. Behåll de transekterade och kontrollera sham tadpoles i separata tankar. Håll tadpoles med aeration vid en temperatur av 20 till 21 grader Celsius.Byt Barth-lösningen med antibiotika varannan dag till slutet av experimentet. Börja mata tadpoles en dag efter operationen och eliminera de döda djuren. För simningsanalysen, skaffa en låda med LED-belysning från insidan, täckt med ett transparent polystyrenark som tillåter ljus att passera igenom, och installera en kamera över LED-lådan.Lägg sedan en petriskål med en diameter på 15 centimeter ovanpå lådan fylld med 100 ml 0,1 gånger Barth-lösningen. En dag efter transsektion, placera en grodyngel i petriskålen och lämna den i en fem minuters anpassningsperiod. Efter anpassningen börjar du videospåra det frisimande beteendet med hjälp av referensprogramvaran i fem minuter.När videon är klar, överför tadpole tillbaka till tanken. Denna representativa prickplot visar återhämtningen av motorfunktionen genom tiden. Fem dagar efter transsektion simmade grodyngel i genomsnitt 0,7 meter på fem minuter, vilket visar en minskad simkapacitet.Denna kapacitet ökade med passerande dagar och visade i genomsnitt 2,1 meter på fem minuter efter 10 dagar och 3,1 meter på fem minuter efter 15 dagar efter transsektion. Fullständig återhämtning av simkapacitet observerades vid 20 dagar efter transsektion, med i genomsnitt 5,7 meter på fem minuter. Simningsgenomsnittet kan variera beroende på varje sats djur.Således bör experimentgruppen alltid jämföras med respektive kontroller och inte tidigare erhållna data. Efter operationen kan djur användas för global analys, inklusive transkriptomik, proteomik och metabolomik, och för att screena för föreningar som hämmar eller främjar ryggmärgsregenerering, i syfte att utveckla nya terapeutiska metoder.

Research

JoVE Journal

Biology

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plast inbäddning och Sektionering av Xenopus laevis embryon

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Skaffa Ägg från Xenopus laevis Kvinnor

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Upprättande och fraktionering av Xenopus laevis Egg Utdrag

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Spinal Cord Electrophysiology

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Tissue Fastställande Använda Transplant Animal Cap (ACT) analys i Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Produktion av Transgena Xenopus laevis Genom begränsning enzymmedierad Integration och Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Ansikts Transplantationer i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...