Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج كولن فورتشن / كلية الطب ، جامعة كولونيا. ونشكر المساعدة التقنية المقدمة من سوزان نيس وميكايلا هايتمان وأنكي ويناند - دورفيلر. تم دعم Ningbo Fan ماليا من قبل مجلس قوانغتشو للمنح الدراسية للنخبة (GESC). يشكر المؤلفون الدكتور جوشوا دي روزاريو على مساعدته في التحرير اللغوي.

تمثل ثقافة شركة تنمية نفط عمان الراسخة والمتنامية جيدا الأساس لنجاح الثقافة الفرعية والحفظ بالتبريد الموصوف في هذا البروتوكول. هنا ، تم إنشاء EAC PDOs من أنسجة الورم الأولية لمرضى EAC باستخدام البروتوكول الذي وصفه Karakasheva T. A. et al17. تم جمع أنسجة EAC من البنك الحيوي بموجب موافقة BioMaSOTA (و...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. أوصت العديد من الدراسات بتمرير PDOs EAC مع هضم خلية واحدة15,17 ، وهو أمر مفيد لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، وكثافة موحدة ، وبنية مج?...

سرطان المريء (EC) هو العاشر الأكثر شيوعا والسبب الرئيسي السادس للوفاة من السرطان في جميع أنحاء العالم1. السرطان الغدي المريئي (EAC) هو أحد الأنواع الفرعية النسيجية الرئيسية لل EC ويحدث بشكل رئيسي في البلدان الغربية2. في العقد الأخير ، زاد معدل الإصابة ب EAC بشكل كبير في العديد من البلدان المتقدمة ، بما في ذلك ألمانيا3. بسبب عدوانية السرطان وعدم وجود أعراض خلال المرحلة المبكرة من تطور الورم ، فإن التشخيص العام في مرضى EAC ضعيف ، حيث يظهر معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات حوالي 20٪ 2,4,5.
منذ أواخر القرن العشرين ، تم إنشاء العديد من النماذج للبحوث الطبية الحيوية في EAC. خطوط خلايا EAC البشرية الكلاسيكية التي تم إنشاؤها في 1990s6 ، توسع معرفتنا ببيولوجيا أورام EAC ، وعلم الوراثة للورم ، بالإضافة إلى استراتيجيات مكافحة الورم ، وتستخدم عادة في أبحاث EAC. إلى جانب ذلك ، نجحت بعض المجموعات البحثية في تطوير نماذج حيوانية من EAC أو مريء باريت عن طريق تعريض الحيوانات لعوامل الخطر المعروفة مثل الارتجاع المعدي المريئي من خلال الأساليب الجراحية أو الالتهابية 7,8,9. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض والتي تغرس أنسجة السرطان الأولية EAC تحت الجلد أو بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، لمحاكاة السلوك البيولوجي البشري لورم EAC وبيئة الورم 10،11،12. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه النماذج تعمل على تحسين التطبيقات السريرية وفهمنا للآليات الجزيئية وراء تكوين الأورام وتطورها في EAC ، لا يزال هناك تحد كبير لاستقراء النتائج من هذه النماذج البحثية للبشر.
تزرع المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) في نظام ثقافة 3D الذي يحاكي التنمية البشرية وتجديد الأعضاء في المختبر. تقوم PDOs المتولدة من الأنسجة الأولية للمرضى بتلخيص الخصائص الجزيئية والمظهرية للورم البشري وأظهرت تطبيقات واعدة في تطوير الأدوية وعلاج السرطان الشخصي13,14. ومن خلال مقارنة عشر حالات من منظمات تنمية نفط أفريقيا مع أنسجة الورم المقترنة بها، تفيد التقارير بأن هذه الحالات تشترك في سمات نسيجية مرضية مماثلة ومشهد جينومي مع الورم الأساسي، وتحتفظ بعدم التجانس داخل الورم وتسهل الفحص الفعال للأدوية في المختبر15. كما تم استخدام منظمات تنمية نفط أفريقيا في دراسة تفاعل الخلايا السرطانية التابعة ل EAC مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) المشتقة من المريض ، مما يشير إلى وجود تطبيق قوي في مجال أبحاث البيئة الدقيقة للورم16. لسوء الحظ ، كانت هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير ونشر منظمات تنمية نفط EAC. هنا ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفاظ على PDOs EAC بالتفصيل: مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن للطرق الموحدة لصيانة منظمات تنمية نفط أفريقيا وتطبيقاتها أن تدعم الباحثين لاختيار الأساليب المناسبة لأغراض مختلفة في أبحاثهم الخاصة بشركة تنمية نفط أفريقيا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

يعد عدم وجود نماذج بحثية انتقالية مناسبة تعكس المرض الأولي لاستكشاف تكوين الأورام والاستراتيجيات العلاجية عقبة رئيسية في السرطان الغدي المريئي (EAC). ظهرت المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) مؤخرا كنموذج رائع قبل السريري في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان. ومع ذلك، لا تزال هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير منظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لمجموعة شرق أفريقيا. وبمجرد إنشاء مؤسسات تنمية نفط عمان، يصبح الانتشار والحفظ بالتبريد ضروريين لإجراء المزيد من التحليلات النهائية. هنا ، تم توحيد طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية وحفظ التبريد في EAC PDO ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن لكلتا الطريقتين الحصول على صلاحية مناسبة للخلية بشكل موثوق وقابلة للتطبيق على إعداد تجريبي متنوع. أظهرت الدراسة الحالية أن زراعة الباطن EAC PDOs مع هضم خلية واحدة مناسبة لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، والكثافة الموحدة ، وبنية جوفاء تسهل تتبع الحجم. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على خلية واحدة تظهر نموا أبطأ في الثقافة وكذلك بعد إعادة الزراعة من المخزونات المجمدة. إلى جانب ذلك ، يتميز التزريع الفرعي بهضم خلية واحدة بتشكيل هياكل مجوفة ذات نواة جوفاء. في المقابل ، فإن معالجة EAC PDOs دون هضم خلية واحدة مواتية للحفظ بالتبريد والتوسع والتوصيف النسيجي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف مزايا وعيوب الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار طريقة مناسبة لمعالجة والتحقيق في المواد العضوية الخاصة بهم.

يقدم هذا البروتوكول الإجراءات بما في ذلك الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة.
ويبين الشكل 1 صورا تمثيلية لتباين الطور لاستراتيجيتي الثقافة الفرعية المختلفتين. وصلت شركات تنمية نفط أفريقيا إلى الكثافة المناسبة للزراعة الفرعية (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

يصف هذا البروتوكول طرق الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للمركبات العضوية المسببة لسرطان المريء الغدي مع أو بدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار الاستراتيجيات المناسبة بناء على تصميمهم التجريبي.

الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للسرطان الغدي المريئي العضوي: إيجابيات وسلبيات لهضم الخلية الواحدة

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

إنه بروتوكول سهل ومتصور يوضح التعامل مع المواد العضوية لسرطان المريء الغدي في عمليتين مختلفتين للزراعة الفرعية مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن للبروتوكول الموحد لزراعة المواد العضوية EAC بطريقتين مختلفتين أن يدعم الباحثين في اختيار التقنيات المناسبة لتطبيقات المصب المختلفة في تجاربهم القائمة على شركة تنمية نفط عمان. أثناء التعامل مع شركات تنمية نفط عمان ، من الضروري الانتباه إلى التفاصيل في كل خطوة.يعد الإجراء التشغيلي الموحد القائم على الفريق أمرا بالغ الأهمية لجودة أصحاب الهمم. سيكون أحد طلاب الدكتوراه لدينا نينغ بو فان وليزا راتز ، مساعد التقنية في المختبر. قم بتسخين صفيحة من 12 بئرا عن طريق الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية باستخدام ثاني أكسيد الكربون.إذا كان ذلك متاحا ، استخدم الآبار الفارغة من طبق به ثقافة عضوية مشتقة من المريض. احتضان كمية مناسبة من جل ECM لمدة ساعة واحدة على الجليد لتسييله. ضع محلول استعادة الخلية على الجليد.قم بإزالة اللوحة مع منظمات تنمية نفط عمان المتنامية من الحاضنة. شفط الوسط القديم باستخدام مضخة تفريغ. أضف 500 ميكرولتر لكل قبة من محلول استعادة الخلايا الباردة الجليدية في البئر.قم بتفكيك هلام ECM عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت قباب هلام ECM إلى قطع صغيرة باستخدام 1000 طرف ميكرولتر مع فتحة واسعة. اجمع بين محلول PDO و ECM gel و cell recovery من بئرين كحد أقصى وانقله إلى أنبوب منخفض الربط بسعة خمسة ملليلترات. احتضن هذا الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.اخلط كل خمس دقائق عن طريق عكس الأنبوب. جهاز طرد مركزي للأنبوب بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. إذا لم يكن هناك حبيبات مرئية ، فقم بإزالة supernatant بعناية باستخدام مضخة تفريغ حتى يتم الوصول إلى المرحلة التي تحتوي على محلول ECM gel PDO وإضافة ثلاثة ملليلترات من محلول استعادة الخلايا الباردة الثلجية.اقلب الأنبوب عدة مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق أخرى. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر.حاول إزالة supernatant قدر الإمكان. قم بتخزين حبيبات شركة تنمية نفط عمان على الجليد. قم بإزالة أطراف 201,000 ميكرولتر المبردة مسبقا باستخدام فتحة واسعة من الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر وضعها على مقعد نظيف.احسب 50 ميكرولتر من هلام ECM لكل قبة مخطط لها للبذر ، بالإضافة إلى 50 ميكرولتر إضافي. ثم أعد تعليق الكريات في هلام ECM باستخدام طرف 1000 ميكرولتر مبرد مسبقا واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات. قم بإزالة الصفيحة ذات ال 12 بئرا المسخنة مسبقا من الحاضنة قبل بذر القباب.زرع القباب التي تحتوي على 50 ميكرولتر من هلام ECM في اللوحة الدافئة. احتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتصلب هلام ECM. أضف وسط شركة تنمية نفط عمان المسخن مسبقا بعناية دون إزعاج القباب.مراقبة منظمات تنمية نفط عمان المبذرة تحت المجهر. استزرع مكاتب تنمية نفط عمان لمدة 7 إلى 14 يوما حتى تحدث الكثافة والمورفولوجيا المطلوبة. تحضير وسط الهضم عن طريق خلط ملليلترين من 0.25٪ من التربسين EDTA و 20 ميكرولتر DNAase I لهضم PDOs التي يتم حصادها من بئرين.أعد تعليق الكريات المعدة مسبقا في حجم مناسب من 0.25٪ من التربسين EDTA و DNAase I المسخنين مسبقا واخلطها حوالي 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة دوارة بسرعة دوران لا تقل عن 28 دورة في الدقيقة. تحضير أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ستة ملليلتر من محلول مثبطات التربسين فول الصويا.بعد الهضم، امزج منظمات تنمية نفط عمان المهضومة جيدا عدة مرات مع ماصة 1000 ميكرولتر لتعطيل منظمات تنمية نفط عمان. انقل PDOs المهضومة إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على محلول SDI لوقف الهضم. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية.تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من الوسط القاعدي. تحديد تركيز الخلية وقابليتها للحياة باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس دمية.احسب رقم الخلية وفقا للقباب المخطط لها للبذر ، بالإضافة إلى قبة واحدة إضافية ، وانقلها إلى أنبوب ربط منخفض جديد 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.أضف الحجم المناسب من جل ECM إلى الكريات باستخدام طرف فتحة عريض 1000 ميكرولتر مبرد مسبقا. اخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات. زرع PDOs المهضومة في صفيحة من 12 بئرا كما هو موضح سابقا.ابدأ عملية الحفظ بالتبريد ل PDOs غير المهضومة باستخدام حبيبات معدة مسبقا. استخدم 500 ميكرولتر من وسط التجميد البارد لإعادة تعليق الكريات من قبتين ونقلها إلى قارورة مبردة. قم بتجميد منظمات تنمية نفط عمان طوال الليل في الفريزر باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة.انقل منتجات تنمية نفط عمان المجمدة إلى فريزر 150 درجة مئوية تحت الصفر. للحفظ بالتبريد ل PDOs المهضومة ، انقل الخلايا إلى أنبوب ربط منخفض جديد 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية.تخلص من السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من وسط التجميد وانقلها إلى قارورة مبردة. قم بتجميد منظمات تنمية نفط عمان طوال الليل في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة ونقلها إلى فريزر 150 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى الطويل.يستغرق التزريع الفرعي دون هضم خلية واحدة وقتا أقل للوصول إلى كثافة مماثلة ويؤدي بشكل أساسي إلى هياكل مدمجة. وعلى النقيض من ذلك، تظهر منظمات تنمية نفط عمان المهضومة ذات الخلية الواحدة هياكل ذات نواة جوفاء. يوضح الشكل تلطيخ الهيماتوكسيلين الإيوسين وتلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية ل EAC PDOs المضمنة في البارافين مع هياكل مدمجة ومجوفة.يتيح البانسيتوكيراتين تحديد الخلايا السرطانية الظهارية. يسلط السيتوكيراتين 7 الضوء على الخلايا السرطانية المتمايزة الغدية. توجد البنية المدمجة في الغالب في الثقافة غير المهضومة ، في حين أن البنية المجوفة هي المهيمنة في الثقافة التي خضعت لعملية هضم خلية واحدة.يسلط Ki67 الضوء على مجموعات الخلايا ذات الانتشار الخلوي الأعلى. تم توزيع Ki67 باللون الأحمر و PanCK باللون الأخضر بالمثل بين الأنسجة الأولية لشركة EAC والهيكل المضغوط لشركة تنمية نفط أفريقيا والهيكل المجوف لشركة EAC PDO. ويبين الشكل الخصائص المورفولوجية لمنظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لجماعة شرق أفريقيا في اليوم الأول من الاسترداد من المخزون المجمد مع الحفظ بالتبريد القائم على خلية واحدة والحفظ بالتبريد القائم على أساس شركة تنمية نفط عمان غير المهضوم.نوصي بوضع خطة واضحة للثقافة الفرعية مقدما. يعد التحكم في درجة الحرارة والسحب اللطيف ضروريين للتعامل الصحيح مع المواد الهلامية ECM عند الزراعة الفرعية لشركة تنمية نفط عمان. يوفر بروتوكولنا للباحثين القدرة على الحفاظ على نقاط PDO الخاصة بهم في EAC وفقا لغرض دراستهم للتحليل النهائي مثل فحص الأدوية أو قياس التدفق الخلوي أو التحليل النسيجي.نأمل أن يساعد عملنا الباحثين العضويين على اتخاذ قرارات سريعة وسهلة لتخزين المواد العضوية وزراعتها الفرعية ، خاصة بالنسبة للنتائج القوية للمواد المشتقة من المرضى في الأبحاث الانتقالية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

إنشاء وتوصيف ثلاثة خطوط الخلايا المضادة للأدينوسرطان الرئة مقاومة للأفاتينب PC-9 مع جرعات متزايدة من Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

عزل السوائل القريبة للتحقيق في البيئة الدقيقة للورم من سرطان البنكرياس الغدي

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

توليد وتصوير الفئران والكائنات العضوية الظهارية البشرية من الأنسجة الثديية الطبيعية والأورام دون المرور

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

نمذجة سرطان الخلايا الحرشفية الفموية المريئية في عضويات 3D

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

بروتوكول فحص القص لتحديد خصائص المواد أحادية الخلية

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

تحليل Multiomics ل TMEM200A كمؤشر حيوي شامل للسرطان

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...