Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Köln Fortune Program / Det Medicinske Fakultet, Köln Universitet. Vi takker for den tekniske assistance fra Susanne Neiss, Michaela Heitmann og Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan blev økonomisk støttet af Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Forfatterne takker Dr. Joshua D'Rozario for hans hjælp med sproglig redigering.

En etableret og velvoksende BOB-kultur udgør grundlaget for en vellykket subkultur og kryopræservering beskrevet i denne protokol. Her blev EAC PPO'er genereret fra EAC-patienters primære tumorvæv ved hjælp af protokollen beskrevet af Karakasheva T. A. et al17. EAC-væv blev indsamlet fra biobank under godkendelse af BioMaSOTA (godkendt af den etiske komité ved universitetet i Köln, ID: 13-091).
BEMÆRK: ØK-BOB'er er blevet dyrket i en befugtet inkubator ved 37 ...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

I denne protokol beskrives to forskellige subkultur- og kryopræserveringsmetoder for EAC PPO'er, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Flere undersøgelser anbefalede at videregive EAC PPO'er med enkeltcellefordøjelse15,17, hvilket er gavnligt for de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode er imidlertid kendetegnet ved langsommere vækst efter rek...

Spiserørkræft (EC) er den tiende mest almindelige og den sjette største dødsårsag fra kræft på verdensplan1. Esophageal adenocarcinom (EAC) er en af de vigtigste histologiske undertyper af EF og forekommer hovedsageligt i vestlige lande2. I det seneste årti er forekomsten af forhåndsræk steget betydeligt i mange udviklede lande, herunder Tyskland3. På grund af kræftens aggressivitet og manglen på symptomer i det tidlige stadium af tumorudvikling er den samlede prognose hos EAC-patienter dårlig, hvilket viser en 5-årig overlevelsesrate på ca. 20%2,4,5.
Siden slutningen af det tyvende århundrede er der etableret flere modeller for den biomedicinske forskning i EAC. De klassiske humane EAC-cellelinjer, der blev etableret i 1990'erne6, udvider vores viden om EAC-tumorbiologi, tumorgenetik samt antitumorstrategier og bruges almindeligvis i EAC-forskning. Desuden har nogle forskergrupper med succes udviklet dyremodeller af EAC eller Barretts spiserør ved at udsætte dyrene for kendte risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gennem kirurgiske eller inflammatoriske tilgange 7,8,9. Derudover blev patientafledte xenograft (PDX) modeller, der indpodet EAC primære kræftvæv subkutant eller ortotopisk i immundefekte mus, udviklet til at simulere human EAC tumor biologisk adfærd og tumormiljø 10,11,12. På trods af disse modeller, der forbedrer kliniske anvendelser og vores forståelse af molekylære mekanismer bag EAC tumorgenese og progression, er der dog stadig en stor udfordring at ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodeller til mennesker.
Patientafledte tumororganoider (PPO'er) dyrkes i et 3D-kultursystem, der efterligner menneskelig udvikling og organregenerering in vitro. Genereret fra patienternes primære væv rekapitulerer PPO'er de molekylære og fænotypiske egenskaber ved den humane tumor og har vist lovende anvendelser inden for lægemiddeludvikling og personlig kræftbehandling13,14. Ved at sammenligne ti tilfælde af EAC PDO'er med deres parrede tumorvæv rapporteres EAC PDO'er at dele lignende histopatologiske træk og genomisk landskab med den primære tumor, bevare intratumorheterogenitet og lette effektiv lægemiddelscreening in vitro15. EAC PDO'er blev også brugt til at studere interaktionen mellem EAC-tumorceller og patientafledte kræftassocierede fibroblaster (CAF'er), hvilket indikerer en stærk anvendelse inden for tumormikromiljøforskning16. Desværre har der været begrænsede protokoller til rådighed til udvikling og udbredelse af ØK PPO'er. Her beskrives to forskellige metoder til at subkulturere og bevare EAC PPO'er i detaljer: med og uden enkeltcellefordøjelse. De standardiserede metoder til vedligeholdelse af EAC PDO'er og deres anvendelser kan støtte forskere i at vælge passende metoder til forskellige formål i deres EAC BOB-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

Manglen på egnede translationelle forskningsmodeller, der afspejler primær sygdom til at udforske tumorgenese og terapeutiske strategier, er en stor hindring i esophageal adenocarcinom (EAC). Patientafledte organoider (PTO'er) har for nylig vist sig som en bemærkelsesværdig præklinisk model i en række kræftformer. Der er dog stadig begrænsede protokoller til rådighed til udvikling af ØK PPO'er. Når PPO'erne er etableret, er formering og kryopræservering afgørende for yderligere downstream-analyser. Her er to forskellige metoder blevet standardiseret for EAC PPO'er subkultur og kryopræservering, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Begge metoder kan pålideligt opnå passende cellelevedygtighed og kan anvendes til en forskelligartet forsøgsopstilling. Den nuværende undersøgelse viste, at subkulturering af EAC PPO'er med enkeltcellefordøjelse er velegnet til de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode viser imidlertid langsommere vækst i kultur såvel som efter gendyrkning fra frosne bestande. Desuden er subkulturering med enkeltcellefordøjelse karakteriseret ved at danne hule strukturer med en hul kerne. I modsætning hertil er behandling af EAC PTO'er uden enkeltcellefordøjelse gunstig for kryokonservering, ekspansion og histologisk karakterisering. I denne protokol beskrives fordele og ulemper ved subkulturering og kryopræservering af EAC PTO'er med og uden enkeltcellefordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge en passende metode til at behandle og undersøge deres organoider.

Denne protokol præsenterer procedurerne, herunder subkultur og kryopræservering af EAC PPO'er med og uden enkeltcellefordøjelse.
Figur 1 viser repræsentative fasekontrastbilleder af de to forskellige subkulturstrategier. EAC PPO'er nåede passende tæthed til subkulturering (figur 1, til venstre). Subkulturering uden fordøjelse af en enkelt celle tager mindre tid at nå sammenlignelig densitet og fører hovedsageligt til kompakte...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Denne protokol beskriver metoderne til subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider med og uden enkeltcelle fordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge passende strategier baseret på deres eksperimentelle design.

Subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider: Fordele og ulemper ved enkeltcelle fordøjelse

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Det er en nem og visualiseret protokol, der demonstrerer håndtering af spiserør adenocarcinomorganoider i to forskellige subkulturproces med og uden enkeltcellefordøjelse. Den standardiserede protokol til subkulturering af EAC-organoider i to forskellige metoder kan støtte forskere i at vælge passende teknikker til forskellige downstream-applikationer i deres EAC BOB-baserede eksperimenter. Mens du beskæftiger dig med PPO'er, er det vigtigt at være opmærksom på detaljerne i hvert trin.Et teambaseret SOP er afgørende for kvaliteten af POD'er. Proceduren skal demonstreres af en af vores ph.d.-studerende Ning Bo Fan og Lisa Raatz, laboratoriets teknikassistent. Forvarm en 12-brønds plade ved inkubation natten over ved 37 grader Celsius ved hjælp af kuldioxid.Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge tomme brønde fra en plade med den patientafledte organoidkultur. Inkuber et passende volumen ECM-gel i en time på is for at flyde. Placer cellegenvindingsopløsning på is.Fjern pladen med voksende PPO'er fra inkubatoren. Aspirer gammelt medium ved hjælp af en vakuumpumpe. Tilsæt 500 mikroliter pr. kuppel af iskold cellegenvindingsopløsning i brønden.Desintegrer ECM-gelen ved at pipettere op og ned flere gange for at fragmentere ECM-gelkupler i små stykker ved hjælp af 1.000 mikroliterspidser med en bred åbning. Kombiner BOB, ECM gel og cellegenvindingsopløsning fra maksimalt to brønde og overfør den til et fem milliliter lavt bindingsrør. Inkuber dette rør på is i 20 minutter.Bland hvert femte minut ved at vende røret. Centrifugering af røret med en hastighed på 500 gange G i fire minutter ved fire grader Celsius. Hvis der ikke er nogen synlig pellet, skal du forsigtigt fjerne supernatanten med en vakuumpumpe, indtil den fase, der indeholder ECM gel BOB-opløsning, er nået, og tilsæt tre ml iskold cellegenvindingsopløsning.Omvendt røret et par gange og inkuber på is i yderligere 10 minutter. Centrifuge ved 500 gange G i fire minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en vakuumpumpe eller en 1.000 mikroliterpipette.Prøv at fjerne supernatanten så meget som muligt. Opbevar BOB-pelleten på is. Fjern forkølede 201.000 mikroliterspidser med en bred åbning fra fryseren minus 20 grader Celsius og læg dem på en ren bænk.Beregn 50 mikroliter ECM-gel pr. kuppel, der er planlagt til såning, plus 50 mikroliter ekstra. Derefter suspenderes pelleten i ECM-gel igen ved hjælp af en forkølet 1.000 mikroliterspids og blandes ved at pipettere op og ned ca. 10 gange. Fjern den forvarmede 12-brønds plade fra inkubatoren, før du sår kuplerne.Frø kuplerne indeholdende 50 mikroliter ECM gel i den varme plade. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 20 til 30 minutter for at størkne ECM-gelen. Tilsæt forvarmet BOB-medium omhyggeligt uden at forstyrre kuplerne.Overvåg frøede PTO'er under mikroskopet. Kultur PPO'erne i 7 til 14 dage, indtil den krævede densitet og morfologi forekommer. Forbered fordøjelsesmedium ved at blande to milliliter 0,25% trypsin EDTA og 20 mikroliter DNAase I for at fordøje PDO'er høstet fra to brønde.Resuspend den tidligere fremstillede pellet i et passende volumen forvarmet 0,25% trypsin EDTA og DNAase I og bland det ca. 10 gange ved at pipettere op og ned ved hjælp af en 1.000 mikroliter pipette. Inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius i en roterende inkubator med en rotationshastighed på mindst 28 o / min. Forbered et 15 ml rør indeholdende seks ml sojabønne trypsinhæmmer opløsning.Efter fordøjelsen blandes de fordøjede PDO'er grundigt et par gange med en 1.000 mikroliterpipette for at forstyrre PDO'erne. Overfør de fordøjede PPO'er til 15 ml rør indeholdende SDI-opløsning for at stoppe fordøjelsen. Centrifuge ved 500 gange G i fire minutter ved fire grader Celsius.Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en vakuumpumpe eller en 1.000 mikroliterpipette. Resuspend pellet i en milliliter basal medium. Bestem cellekoncentration og levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celletæller eller et hæmocytometer.Beregn cellenummeret i henhold til de kupler, der er planlagt til såning, plus en kuppel ekstra, og overfør dem til et nyt 1,5 ml lavt bindingsrør. Centrifuge ved 500 gange G i fire minutter ved fire grader Celsius. Kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en 1.000 mikroliter pipette.Tilsæt passende volumen ECM-gel til pelleten ved hjælp af en forkølet 1.000 mikroliter bred åbningsspids. Bland ved at pipettere op og ned ca. 10 gange. Frø de fordøjede PTO'er i en 12-brønds plade som tidligere påvist.Start kryopræserveringsprocessen af ufordøjede PPO'er med tidligere forberedt pellet. Brug 500 mikroliter koldfrysningsmedium til at genanvende pillen fra to kupler og overføre den til et kryogent hætteglas. Frys PPO'er natten over i fryseren ved hjælp af en passende cellefrysningsbeholder.Overfør de frosne PPO'er til en fryser på minus 150 grader Celsius. Til kryopræservering af fordøjede PPO'er overføres celler til et nyt 1,5 ml lavt bindingsrør. Centrifuge ved 500 gange G i fire minutter ved fire grader Celsius.Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en 1.000 mikroliter pipette. Resuspend pelleten i 500 mikroliter frysemedium og overfør det til et kryogent hætteglas. Frys PPO'er natten over i en fryser på minus 80 grader Celsius ved hjælp af en passende cellefrysningsbeholder, og overfør dem til en fryser på minus 150 grader Celsius til langtidsopbevaring.Subkulturering uden enkeltcellefordøjelse tager mindre tid at nå sammenlignelig tæthed og fører hovedsageligt til kompakte strukturer. I modsætning hertil viser de enkeltcellefordøjede PPO'er strukturer med en hul kerne. Figuren viser hæmatoxylin eosinfarvning og immunohistokemifarvning af paraffinindlejrede EAC PDO'er med kompakte og hule strukturer.Pancytokeratin muliggør identifikation af epiteltumorceller. Cytokeratin 7 fremhæver de kirteldifferentierede tumorceller. Den kompakte struktur eksisterer overvejende i den ufordøjede kultur, mens den hule struktur er dominerende i den kultur, der gennemgik enkeltcellefordøjelsen.Ki67 fremhæver cellepopulationerne med højere cellulær proliferation. Ki67 i rød og PanCK i grøn var ligeledes fordelt på EAC primærvæv, EAC BOB kompakt struktur og EAC BOB hul struktur. Figuren viser morfologiske egenskaber ved EAC PDO'er på den første dag for genopretning fra frossen bestand med enkeltcellebaseret kryopræservering og ufordøjet BOB-baseret kryopræservering.Vi anbefaler at lave en klar subkulturplan på forhånd. Temperaturkontrol og skånsom pipettering er afgørende for korrekt håndtering af ECM-geler ved subkulturering af PTO'er. Vores protokol giver forskere det væsentlige til at opretholde deres EAC PTO'er i henhold til deres undersøgelsesformål til downstream-analyse såsom lægemiddelscreeningsassay, flowcytometri eller histologisk analyse.Vi håber, at vores arbejde kan hjælpe organoidforskere med at træffe hurtige og nemme beslutninger for opbevaring og subkultur af organoider, især for robuste resultater af patientafledte materialer i translationel forskning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flowcytometri med fluorescerende celle stregkodesystem for enkelt celle signalering analyse og biomarkør opdagelse

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering og karakterisering af tre Afatinib-resistente lunge adenokarcinom PC-9 cellelinjer udviklet med stigende doser Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering af patient-afledte bugspytkirtel ductal adenokarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellering af oral-esophageal pladecellekarcinom i 3D-organoider

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Forskydningsassayprotokol til bestemmelse af enkeltcellematerialeegenskaber

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

Optimizing HCC Organoid Formation for Target Identification and Drug Development

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids (Video) | JoVE

Udvikling og optimering af en human hepatocellulært carcinom patientafledt organoidmodel til potentiel målidentifikation og lægemiddelopdagelse

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics analyse af TMEM200A som en pan-cancer biomarkør

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...