Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Köln Fortune Program / Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van Keulen. Wij danken de technische assistentie van Susanne Neiss, Michaela Heitmann en Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan werd financieel ondersteund door Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). De auteurs bedanken Dr. Joshua D'Rozario voor zijn hulp bij het taalkundig bewerken.

Een gevestigde en goed groeiende BOB-cultuur vormt de basis voor een succesvolle subcultuur en cryopreservatie zoals beschreven in dit protocol. Hier werden EAC BOB's gegenereerd uit het primaire tumorweefsel van EAC-patiënten met behulp van het protocol beschreven door Karakasheva T. A. et al17. EAC-weefsels werden verzameld uit de biobank onder de goedkeuring van BioMaSOTA (goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Keulen, ID: 13-091).
OPMERKING:...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

In dit protocol worden twee verschillende subcultuur- en cryopreservatiemethoden van EAC-BOB's beschreven, namelijk met en zonder eencellige vertering. Verschillende studies adviseerden het doorgeven van EAC-BOB's met eencellige vertering15,17, wat gunstig is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode wordt echter gekenmerkt...

Slokdarmkanker (EC) is de tiende meest voorkomende en de zesde belangrijkste doodsoorzaak van kanker wereldwijd1. Oesofageaal adenocarcinoom (EAC) is een van de belangrijkste histologische subtypen van EC en komt voornamelijk voor in westerse landen2. In het afgelopen decennium is de EAC-incidentie aanzienlijk toegenomen in veel ontwikkelde landen, waaronder Duitsland3. Vanwege de agressiviteit van kanker en het ontbreken van symptomen tijdens het vroege stadium van tumorontwikkeling, is de algemene prognose bij EAC-patiënten slecht, met een 5-jaarsoverleving van ongeveer 20% 2,4,5.
Sinds het einde van de twintigste eeuw zijn er verschillende modellen opgesteld voor het biomedisch onderzoek van EAC. De klassieke menselijke EAC-cellijnen die werden opgericht in de jaren 19906, breiden onze kennis van EAC-tumorbiologie, tumorgenetica en antitumorstrategieën uit en worden vaak gebruikt in EAC-onderzoek. Bovendien hebben sommige onderzoeksgroepen met succes diermodellen van EAC of Barrett's slokdarm ontwikkeld door de dieren bloot te stellen aan bekende risicofactoren zoals gastro-oesofageale reflux door chirurgische of inflammatoire benaderingen 7,8,9. Daarnaast werden patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen die EAC primaire kankerweefsels subcutaan of orthotopisch enten in immunodeficiënte muizen, ontwikkeld om menselijk EAC tumor biologisch gedrag en tumoromgeving te simuleren 10,11,12. Ondanks dat deze modellen klinische toepassingen verbeteren en ons begrip van moleculaire mechanismen achter EAC-tumorigenese en progressie, is er nog steeds een grote uitdaging om de resultaten van deze onderzoeksmodellen naar mensen te extrapoleren.
Patiënt-afgeleide tumor organoïden (BOB's) worden gekweekt in een 3D-kweeksysteem dat de menselijke ontwikkeling en orgaanregeneratie in vitro nabootst. Gegenereerd uit het primaire weefsel van patiënten, reconstrueren PDO's de moleculaire en fenotypische kenmerken van de menselijke tumor en hebben veelbelovende toepassingen aangetoond bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en gepersonaliseerde kankerbehandeling13,14. Door tien gevallen van EAC-BOB's te vergelijken met hun gepaarde tumorweefsel, wordt gemeld dat EAC-BOB's vergelijkbare histopathologische kenmerken en genomisch landschap delen met de primaire tumor, intratumorering heterogeniteit behouden en efficiënte screening van geneesmiddelen in vitro15 vergemakkelijken. EAC PDO's werden ook gebruikt bij het bestuderen van de interactie van EAC-tumorcellen met patiënt-afgeleide kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), wat wijst op een krachtige toepassing op het gebied van tumormicro-omgevingsonderzoek16. Helaas zijn er beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen en verspreiden van EAC-BOB's. Hier worden twee verschillende methoden beschreven voor het subcultureren en conserveren van EAC-BOB's in detail: met en zonder eencellige vertering. De gestandaardiseerde methoden voor het onderhoud van EAC BOB's en hun toepassingen kunnen onderzoekers ondersteunen bij het kiezen van geschikte methoden voor verschillende doeleinden in hun EAC BOB-onderzoek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

Het gebrek aan geschikte translationele onderzoeksmodellen die primaire ziekte weerspiegelen om tumorigenese en therapeutische strategieën te onderzoeken, is een groot obstakel bij oesofageaal adenocarcinoom (EAC). Patient-derived organoids (PDOs) zijn onlangs naar voren gekomen als een opmerkelijk preklinisch model in een verscheidenheid aan kankers. Er zijn echter nog steeds beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen van OAG-BOB's. Zodra de BOB's zijn vastgesteld, zijn de vermeerdering en cryopreservatie essentieel voor verdere downstream-analyses. Hier zijn twee verschillende methoden gestandaardiseerd voor EAC PDOs subcultuur en cryopreservatie, d.w.z. met en zonder eencellige vertering. Beide methoden kunnen op betrouwbare wijze de juiste levensvatbaarheid van de cel verkrijgen en zijn toepasbaar voor een diverse experimentele opstelling. De huidige studie toonde aan dat het subcultureren van EAC-BOB's met eencellige spijsvertering geschikt is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode laat echter een langzamere groei zien in de teelt en na herkweek uit bevroren bestanden. Bovendien wordt subculturing met eencellige spijsvertering gekenmerkt door het vormen van holle structuren met een holle kern. Daarentegen is het verwerken van EAC-BOB's zonder eencellige vertering gunstig voor cryopreservatie, expansie en histologische karakterisering. In dit protocol worden de voor- en nadelen beschreven van subculturen en cryopreservatie van EAC BOB's met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen een geschikte methode te kiezen om hun organoïden te verwerken en te onderzoeken.

Dit protocol presenteert de procedures inclusief subcultuur en cryopreservatie van EAC BOB's met en zonder eencellige vertering.
Figuur 1 toont representatieve fasecontrastfoto's van de twee verschillende subcultuurstrategieën. EAC-BOB's bereikten de juiste dichtheid voor subculturing (figuur 1, links). Subculturen zonder eencellige vertering kost minder tijd om een vergelijkbare dichtheid te bereiken en leidt vooral tot compacte str...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Dit protocol beschrijft de methoden van subcultuur en cryopreservatie van oesofageale adenocarcinoom organoïden met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen geschikte strategieën te kiezen op basis van hun experimentele ontwerp.

Subcultuur en cryopreservatie van oesofageaal adenocarcinoom organoïden: voor- en nadelen voor eencellige spijsvertering

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Het is een eenvoudig en gevisualiseerd protocol dat de behandeling van oesofageale adenocarcinoom organoïden in twee verschillende subculturele processen met en zonder eencellige spijsvertering aantoont. Het gestandaardiseerde protocol voor het subcultureren van EAC-organoïden in twee verschillende methoden kan onderzoekers ondersteunen bij het kiezen van geschikte technieken voor verschillende downstream-toepassingen in hun op EAC BOB gebaseerde experimenten. Bij het omgaan met BOB's is het essentieel om aandacht te besteden aan de details in elke stap.Een teamgebaseerde SOP is cruciaal voor de kwaliteit van POD's. Een van onze promovendi Ning Bo Fan en Lisa Raatz, de techniekassistent van het laboratorium, demonstreren de procedure. Verwarm een 12-well plaat voor door 's nachts incubatie bij 37 graden Celsius met behulp van koolstofdioxide.Gebruik, indien beschikbaar, lege putten van een plaat met de van de patiënt afgeleide organoïdecultuur. Incubeer een geschikt volume ECM-gel gedurende een uur op ijs om vloeibaar te maken. Plaats de celhersteloplossing op ijs.Verwijder de plaat met groeiende BOB's uit de couveuse. Zuig oud medium op met behulp van een vacuümpomp. Voeg 500 microliter per koepel ijskoude celterugwinningsoplossing toe aan de put.Desintegreer de ECM-gel door meerdere keren op en neer te pipetteren om ECM-gelkoepels in kleine stukjes te fragmenteren met behulp van 1.000 microliter tips met een brede opening. Combineer de BOB, ECM-gel en celhersteloplossing uit maximaal twee putjes en breng deze over in een laag bindbuis van vijf milliliter. Incubeer deze buis gedurende 20 minuten op ijs.Meng elke vijf minuten door de buis om te keren. Centrifugeer de buis met een snelheid van 500 keer G gedurende vier minuten bij vier graden Celsius. Als er geen zichtbare pellet is, verwijder het supernatant voorzichtig met een vacuümpomp totdat de fase met ECM-gel BOB-oplossing is bereikt en voeg drie milliliter ijskoude celterugwinningsoplossing toe.Keer de buis een paar keer om en incubeer nog 10 minuten op ijs. Centrifugeer vier minuten lang bij 500 maal G bij vier graden Celsius. Gooi het bovennatuurlijke middel voorzichtig weg met behulp van een vacuümpomp of een pipet van 1.000 microliter.Probeer het supernatant zoveel mogelijk te verwijderen. Bewaar de BOB-pellet op ijs. Verwijder voorgekoelde 201, 000 microliter tips met een brede opening uit de min 20 graden Celsius vriezer en plaats ze op een schone bank.Bereken 50 microliter ECM-gel per geplande koepel voor zaaien, plus 50 microliter extra. Breng de pellet vervolgens opnieuw in ECM-gel met een voorgekoelde tip van 1.000 microliter en meng door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren. Verwijder de voorverwarmde 12-well plaat uit de incubator voordat je de koepels zaait.Zaai de koepels met 50 microliter ECM-gel in de warme plaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 20 tot 30 minuten om de ECM-gel te stollen. Voeg voorverwarmd BOB-medium voorzichtig toe zonder de koepels te storen.Monitor gezaaide BOB's onder de microscoop. Kweek de BOB's gedurende 7 tot 14 dagen totdat de vereiste dichtheid en morfologie optreden. Bereid het verteringsmedium door twee milliliter van 0,25% trypsine EDTA en 20 microliter DNAase I te mengen om BOB's te verteren die uit twee putten zijn geoogst.Resuspend de eerder bereide pellet in een geschikt volume voorverwarmd 0,25% trypsine EDTA en DNAase I en meng het ongeveer 10 keer door op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 microliter. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius in een roterende incubator met een rotatiesnelheid van minimaal 28 RPM. Bereid een buis van 15 milliliter met zes milliliter soja-trypsineremmeroplossing.Meng na de vertering de verteerde BOB's een paar keer grondig met een pipet van 1.000 microliter om de BOB's te verstoren. Breng de verteerde BOB's over in de buis van 15 milliliter met SDI-oplossing om de vertering te stoppen. Centrifugeer vier minuten lang bij 500 maal G bij vier graden Celsius.Gooi het bovennatuurlijke middel voorzichtig weg met behulp van een vacuümpomp of een pipet van 1.000 microliter. Resuspend de pellet in één milliliter basaal medium. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller of een hemocytometer.Bereken het celgetal volgens de koepels die gepland zijn voor zaaien, plus een koepel extra, en breng ze over naar een verse 1,5 milliliter lage bindbuis. Centrifugeer vier minuten lang bij 500 maal G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet van 1.000 microliter.Voeg het juiste volume ECM-gel toe aan de pellet met behulp van een voorgekoelde opening van 1.000 microliter brede opening. Meng door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren. Zaai de verteerde BOB's in een 12-well plaat zoals eerder aangetoond.Start het cryopreservatieproces van onverteerde BOB's met eerder bereide pellet. Gebruik 500 microliter koud vriesmedium om de pellet uit twee koepels te resuspenderen en over te brengen naar een cryogene injectieflacon. Vries BOB's een nacht in de vriezer in met behulp van een geschikte celbevriezingscontainer.Breng de bevroren BOB's over in een vriezer van min 150 graden Celsius. Breng voor cryopreservatie van verteerde BOB's cellen over in een verse 1,5 milliliter laag bindbuis. Centrifugeer vier minuten lang bij 500 maal G bij vier graden Celsius.Gooi het bovennatuurlijke middel voorzichtig weg met een pipet van 1.000 microliter. Resuspend de pellet in 500 microliter vriesmedium en breng deze over in een cryogene injectieflacon. Vries BOB's een nacht in een vriezer van min 80 graden Celsius in met behulp van een geschikte celbevriezingscontainer en breng ze over in een vriezer van min 150 graden Celsius voor langdurige opslag.Subculturen zonder eencellige vertering kost minder tijd om een vergelijkbare dichtheid te bereiken en leidt vooral tot compacte structuren. De eencellige verteerde BOB's daarentegen vertonen structuren met een holle kern. De figuur toont de hematoxyline eosinekleuring en immunohistochemische kleuring van paraffine-ingebedde EAC BOB's met compacte en holle structuren.De pancytokeratine maakt de identificatie van epitheliale tumorcellen mogelijk. Het cytokeratine 7 benadrukt de glandulaire gedifferentieerde tumorcellen. De compacte structuur bestaat voornamelijk in de onverteerde cultuur, terwijl de holle structuur dominant is in de cultuur die eencellige spijsvertering onderging.De Ki67 benadrukt de celpopulaties met een hogere cellulaire proliferatie. De Ki67 in rood en PanCK in groen waren op dezelfde manier verdeeld over EAC primair weefsel, EAC PDO compacte structuur en EAC PDO holle structuur. De figuur toont morfologische kenmerken van EAC-BOB's op de eerste dag van herstel van bevroren voorraad met cryopreservatie op basis van één cel en onverteerde cryopreservatie op basis van BOB.We raden aan om vooraf een duidelijk subcultuurplan te maken. Temperatuurregeling en zacht pipetteren zijn essentieel voor de juiste behandeling van ECM-gels bij het subcultureren van BOB's. Ons protocol biedt onderzoekers de substantiële om hun EAC BOB's te behouden volgens hun studiedoel voor downstream-analyse zoals geneesmiddelenscreeningstest, flowcytometrie of histologische analyse.We hopen dat ons werk organoïde onderzoekers kan helpen om snelle en gemakkelijke beslissingen te nemen voor de opslag en subcultuur van organoïden, met name voor robuuste resultaten van patiënt-afgeleide materialen in translationeel onderzoek.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho Stroom Cytometry met fluorescerende cel Barcoding voor eencellige signalering analyse en ontdekking van Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Oprichting en karakterisering van drie Afatinib-resistente Long adenocarcinoom PC-9 cellijnen ontwikkeld met toenemende doses van Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Shear Assay Protocol voor de bepaling van eencellige materiaaleigenschappen

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics-analyse van TMEM200A als een pan-kanker biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...