Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Köln Fortune Program/Medizinische Fakultät der Universität zu Köln unterstützt. Wir danken der technischen Unterstützung von Susanne Neiss, Michaela Heitmann und Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan wurde vom Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC) finanziell unterstützt. Die Autoren danken Dr. Joshua D'Rozario für seine Unterstützung bei der linguistischen Bearbeitung.

Eine etablierte und gut wachsende DOP-Kultur stellt die Grundlage für eine erfolgreiche Subkultur und Kryokonservierung dar, die in diesem Protokoll beschrieben wird. Hier wurden EAC-PDOs aus dem primären Tumorgewebe von EAC-Patienten unter Verwendung des von Karakasheva T. A. et al17 beschriebenen Protokolls erzeugt. EAC-Gewebe wurden aus der Biobank unter der Genehmigung von BioMaSOTA (genehmigt von der Ethikkommission der Universität zu Köln, ID: 13-091) gesammelt.
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<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. 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In diesem Protokoll werden zwei verschiedene Subkultur- und Kryokonservierungsmethoden von EAC-PDOs beschrieben, d.h. mit und ohne Einzelzellverdauung. Mehrere Studien empfahlen, EAC-PDOs mit Einzelzellverdauung15,17 zu passieren, was für die meisten Experimente von Vorteil ist, die eine Kontrolle der Zellzahl, eine gleichmäßige Dichte und eine hohle Struktur erfordern, die die Größenverfolgung erleichtert. Die Einzelzellmethode zeichnet sich jedoch durch ei...

Speiseröhrenkrebs (EC) ist die zehnthäufigste und die sechsthäufigste Todesursache durch Krebsweltweit 1. Das Ösophagus-Adenokarzinom (EAC) ist einer der wichtigsten histologischen Subtypen von EC und tritt hauptsächlich in westlichen Ländern auf2. In den letzten zehn Jahren hat die EAC-Inzidenz in vielen Industrieländern, einschließlich Deutschland, deutlich zugenommen3. Aufgrund der Aggressivität von Krebs und des Fehlens von Symptomen im frühen Stadium der Tumorentwicklung ist die Gesamtprognose bei EAC-Patienten schlecht und zeigt eine 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 20%2,4,5.
Seit dem späten zwanzigsten Jahrhundert haben sich mehrere Modelle für die biomedizinische Forschung der EAC etabliert. Die klassischen humanen EAC-Zelllinien, die in den 1990er Jahren etabliert wurden6, erweitern unser Wissen über EAC-Tumorbiologie, Tumorgenetik sowie Anti-Tumor-Strategien und werden häufig in der EAC-Forschung eingesetzt. Außerdem haben einige Forschungsgruppen erfolgreich Tiermodelle der EAC oder Barrett-Speiseröhre entwickelt, indem sie die Tiere bekannten Risikofaktoren wie gastroösophagealen Reflux durch chirurgische oder entzündliche Ansätze ausgesetzt haben 7,8,9. Darüber hinaus wurden patientenabgeleitete Xenotransplantat-Modelle (PDX) entwickelt, die EAC-Primärkrebsgewebe subkutan oder orthotopisch in immundefiziente Mäuse transplantieren, um das biologische Verhalten des menschlichen EAC-Tumors und die Tumorumgebung zu simulieren10,11,12. Obwohl diese Modelle die klinischen Anwendungen und unser Verständnis der molekularen Mechanismen hinter der EAC-Tumorentstehung und -progression verbessern, besteht immer noch eine große Herausforderung, die Ergebnisse dieser Forschungsmodelle auf den Menschen zu extrapolieren.
Patientenabgeleitete Tumororganoide (PDOs) werden in einem 3D-Kultursystem gezüchtet, das die menschliche Entwicklung und Organregeneration in vitro nachahmt. Aus dem Primärgewebe der Patienten gewonnen, rekapitulieren PDOs die molekularen und phänotypischen Eigenschaften des menschlichen Tumors und haben vielversprechende Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und personalisierten Krebsbehandlunggezeigt 13,14. Durch den Vergleich von zehn Fällen von EAC-PDOs mit ihrem gepaarten Tumorgewebe wird berichtet, dass EAC-PDOs ähnliche histopathologische Merkmale und eine genomische Landschaft mit dem Primärtumor teilen, die Heterogenität innerhalb des Tumors beibehalten und ein effizientes Arzneimittelscreening in vitroermöglichen 15. EAC-PDOs wurden auch bei der Untersuchung der Interaktion von EAC-Tumorzellen mit patientenabgeleiteten Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) verwendet, was auf eine leistungsstarke Anwendung im Bereich der Tumormikroumgebungsforschunghinweist 16. Leider gibt es nur begrenzte Protokolle für die Entwicklung und Verbreitung von EAC-PDOs. Hier werden zwei verschiedene Methoden zur Subkulturation und Konservierung von EAC-PDOs im Detail beschrieben: mit und ohne Einzelzellverdauung. Die standardisierten Methoden zur Aufrechterhaltung von EAC-PDOs und deren Anwendungen können Forscher dabei unterstützen, geeignete Methoden für verschiedene Zwecke in ihrer EAC-PDO-Forschung zu wählen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

Der Mangel an geeigneten translationalen Forschungsmodellen, die Primärerkrankungen widerspiegeln, um die Tumorentstehung und therapeutische Strategien zu erforschen, ist ein großes Hindernis beim Ösophagus-Adenokarzinom (EAC). Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) haben sich kürzlich als bemerkenswertes präklinisches Modell bei einer Vielzahl von Krebsarten herausgestellt. Für die Entwicklung von EAC-PDOs stehen jedoch noch begrenzte Protokolle zur Verfügung. Sobald die g.U. etabliert sind, sind die Vermehrung und Kryokonservierung für weitere nachgelagerte Analysen unerlässlich. Hier wurden zwei verschiedene Methoden für EAC-PDOs Subkultur und Kryokonservierung standardisiert, d.h. mit und ohne Einzelzellaufschluss. Beide Methoden können zuverlässig eine geeignete Zelllebensfähigkeit erreichen und sind für einen vielfältigen Versuchsaufbau geeignet. Die aktuelle Studie zeigte, dass die Subkulturierung von EAC-PDOs mit Einzelzellaufschluss für die meisten Experimente geeignet ist, die eine Kontrolle der Zellzahl, eine gleichmäßige Dichte und eine hohle Struktur erfordern, die die Größenverfolgung erleichtert. Die Einzelzell-basierte Methode zeigt jedoch ein langsameres Wachstum sowohl in der Kultur als auch nach der Rekultivierung aus gefrorenen Beständen. Außerdem ist die Subkulturation mit einzelliger Verdauung durch die Bildung von Hohlstrukturen mit einem hohlen Kern gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu ist die Verarbeitung von EAC-PDOs ohne Einzelzellverdauung günstig für die Kryokonservierung, Expansion und histologische Charakterisierung. In diesem Protokoll werden die Vor- und Nachteile der Subkulturierung und Kryokonservierung von EAC-PDOs mit und ohne Einzelzellaufschluss beschrieben, um es den Forschern zu ermöglichen, eine geeignete Methode zur Verarbeitung und Untersuchung ihrer Organoide zu wählen.

Dieses Protokoll stellt die Verfahren einschließlich Subkultur und Kryokonservierung von EAC-PDOs mit und ohne Einzelzellaufschluss vor.
Abbildung 1 zeigt repräsentative Phasenkontrastbilder der beiden unterschiedlichen Subkulturstrategien. EAC-PDOs erreichten eine angemessene Dichte für die Subkulturation (Abbildung 1, links). Die Subkulturation ohne Einzelzellverdauung benötigt weniger Zeit, um eine vergleichbare Dichte zu errei...

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Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden der Subkultur und Kryokonservierung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden mit und ohne Einzelzellaufschluss, um es den Forschern zu ermöglichen, geeignete Strategien auf der Grundlage ihres experimentellen Designs auszuwählen.

Subkultur und Kryokonservierung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden: Vor- und Nachteile für die Einzelzellverdauung

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Es ist ein einfaches und visualisiertes Protokoll, das die Handhabung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden in zwei verschiedenen Subkulturprozessen mit und ohne Einzelzellverdauung demonstriert. Das standardisierte Protokoll zur Subkulturation von EAC-Organoiden in zwei verschiedenen Methoden kann Forscher bei der Auswahl geeigneter Techniken für verschiedene nachgelagerte Anwendungen in ihren EAC-PDO-basierten Experimenten unterstützen. Beim Umgang mit PDOs ist es wichtig, bei jedem Schritt auf die Details zu achten.Eine teambasierte SOP ist entscheidend für die Qualität von PODs. Eines unserer Doktoranden Ning Bo Fan und Lisa Raatz, die Technikassistentin des Labors, werden das Verfahren demonstrieren. Vorwärmen Sie eine 12-Well-Platte durch Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Kohlendioxid.Falls verfügbar, verwenden Sie leere Vertiefungen aus einer Platte mit der vom Patienten abgeleiteten Organoidkultur. Inkubieren Sie ein angemessenes Volumen ECM-Gel für eine Stunde auf Eis, um sich zu verflüssigen. Legen Sie die Zellwiederherstellungslösung auf Eis.Entfernen Sie die Platte mit wachsenden PDOs aus dem Inkubator. Natives Medium mit einer Vakuumpumpe abpumpen. Geben Sie 500 Mikroliter pro Kuppel Eiskaltzellen-Rückgewinnungslösung in den Brunnen.Zerlegen Sie das ECM-Gel, indem Sie mehrmals nach oben und unten pipettieren, um ECM-Gel-Kuppeln mit 1.000 Mikroliterspitzen mit einer breiten Öffnung in kleine Stücke zu fragmentieren. Kombinieren Sie die PDO-, ECM-Gel- und Zellrückgewinnungslösung aus maximal zwei Vertiefungen und übertragen Sie sie in ein fünf Milliliter niedriges Binderöhrchen. Inkubieren Sie diese Röhre 20 Minuten lang auf Eis.Mischen Sie alle fünf Minuten, indem Sie die Röhre umkehren. Zentrifugieren Sie das Rohr mit einer Geschwindigkeit von 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Wenn kein sichtbares Pellet vorhanden ist, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe, bis die Phase mit ECM-Gel-PDO-Lösung erreicht ist, und fügen Sie drei Milliliter Eiskaltzellen-Rückgewinnungslösung hinzu.Drehen Sie die Röhre einige Male um und inkubieren Sie sie weitere 10 Minuten auf Eis. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe oder einer 1.000-Mikroliter-Pipette.Versuchen Sie, den Überstand so weit wie möglich zu entfernen. Lagern Sie das DOP-Pellet auf Eis. Vorgekühlte 201.000 Mikroliter Spitzen mit breiter Öffnung aus dem minus 20 Grad Celsius Gefrierschrank nehmen und auf eine saubere Bank stellen.Berechnen Sie 50 Mikroliter ECM-Gel pro Dome, die für die Aussaat geplant sind, plus 50 Mikroliter extra. Dann suspendieren Sie das Pellet in ECM-Gel mit einer vorgekühlten 1.000-Mikroliter-Spitze und mischen Sie es durch Pipettieren auf und ab etwa 10 Mal. Entfernen Sie die vorgewärmte 12-Well-Platte aus dem Inkubator, bevor Sie die Kuppeln säen.Samen Sie die Kuppeln mit 50 Mikrolitern ECM-Gel in die warme Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 20 bis 30 Minuten, um das ECM-Gel zu verfestigen. Vorgewärmtes DOP-Medium vorsichtig hinzufügen, ohne die Kuppeln zu stören.Überwachen Sie gesetzte PDOs unter dem Mikroskop. Kultur der PDOs für 7 bis 14 Tage, bis die erforderliche Dichte und Morphologie auftreten. Bereiten Sie das Verdauungsmedium vor, indem Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA und 20 Mikroliter DNAase I mischen, um PDOs aus zwei Vertiefungen zu verdauen.Resuspendiert das zuvor vorbereitete Pellet in einem geeigneten Volumen von vorerwärmten 0,25% Trypsin EDTA und DNAase I und mischen Sie es etwa 10 Mal, indem Sie es mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem rotierenden Inkubator mit einer Drehzahl von mindestens 28 U / min. Bereiten Sie ein 15-Milliliter-Röhrchen mit sechs Millilitern Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Lösung vor.Mischen Sie die verdauten PDOs nach der Verdauung einige Male gründlich mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, um die PDOs zu stören. Übertragen Sie die verdauten PDOs in das 15-Milliliter-Röhrchen mit SDI-Lösung, um die Verdauung zu stoppen. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe oder einer 1.000-Mikroliter-Pipette. Resuspendiert das Pellet in einem Milliliter Basalmedium. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer.Berechnen Sie die Zellzahl entsprechend den für die Aussaat geplanten Kuppeln plus einer Kuppel extra und übertragen Sie sie auf ein frisches 1,5-Milliliter-Low-Bind-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette.Fügen Sie dem Pellet mit einer vorgekühlten 1.000 Mikroliter breiten Öffnungsspitze ein geeignetes Volumen ECM-Gel hinzu. Mischen Sie, indem Sie etwa 10 Mal auf und ab pipettieren. Samen Sie die verdauten PDOs in eine 12-Well-Platte, wie zuvor gezeigt.Starten Sie den Kryokonservierungsprozess von unverdauten PDOs mit zuvor vorbereiteten Pellets. Verwenden Sie 500 Mikroliter kaltes Gefriermedium, um das Pellet aus zwei Kuppeln zu resuspendieren und in eine kryogene Durchstechflasche zu überführen. Einfrieren Sie PDOs über Nacht im Gefrierschrank mit einem geeigneten Zellgefrierbehälter.Die eingefrorenen PDOs in einen Gefrierschrank von minus 150 Grad Celsius geben. Zur Kryokonservierung von verdauten PDOs werden die Zellen in ein frisches 1,5-Milliliter-Low-Bind-Röhrchen übertragen. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1.000 Mikroliter Pipette. Resuspendiert das Pellet in 500 Mikroliter Gefriermedium und überträgt es auf ein kryogenes Fläschchen. Einfrieren Sie PDOs über Nacht in einem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank mit einem geeigneten Zellgefrierbehälter ein und geben Sie sie zur Langzeitlagerung in einen minus 150 Grad Celsius Gefrierschrank.Subkulturen ohne Einzelzellverdauung benötigen weniger Zeit, um eine vergleichbare Dichte zu erreichen, und führen hauptsächlich zu kompakten Strukturen. Im Gegensatz dazu zeigen die einzelligen verdauten PDOs Strukturen mit einem hohlen Kern. Die Abbildung zeigt die Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Immunhistochemie-Färbung von paraffineingebetteten EAC-PDOs mit kompakten und hohlen Strukturen.Das Pancytokeratin ermöglicht die Identifizierung von epithelialen Tumorzellen. Das Cytokeratin 7 hebt die drüsendifferenzierten Tumorzellen hervor. Die kompakte Struktur existiert überwiegend in der unverdauten Kultur, während die hohle Struktur in der Kultur, die einer Einzelzellverdauung unterzogen wurde, dominant ist.Der Ki67 hebt die Zellpopulationen mit höherer zellulärer Proliferation hervor. Die Ki67 in Rot und PanCK in Grün waren ähnlich auf EAC-Primärgewebe, EAC-PDO-Kompaktstruktur und EAC-PDO-Hohlstruktur verteilt. Die Abbildung zeigt morphologische Merkmale von EAC-PDOs am ersten Tag der Erholung aus gefrorenen Beständen mit einzelliger Kryokonservierung und unverdauter PDO-basierter Kryokonservierung.Wir empfehlen, im Voraus einen klaren Subkulturplan zu erstellen. Temperaturregelung und schonendes Pipettieren sind für die korrekte Handhabung von ECM-Gelen bei der Subkulturation von PDOs unerlässlich. Unser Protokoll bietet Forschern die Möglichkeit, ihre EAC-PDOs entsprechend ihrem Studienzweck für nachgelagerte Analysen wie Arzneimittel-Screening-Assay, Durchflusszytometrie oder histologische Analyse aufrechtzuerhalten.Wir hoffen, dass unsere Arbeit Organoidforschern helfen könnte, schnelle und einfache Entscheidungen für die Speicherung und Subkultur von Organoiden zu treffen, insbesondere für robuste Ergebnisse von patientenabgeleiteten Materialien in der translationalen Forschung.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Forschung

Krebsforschung

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zelle Barcoding für einzelne Zelle Signalisierung Analyse und Entdeckung von Biomarkern

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom PC-9 Zelllinien entwickelt mit zunehmenden Dosen von Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolierung proximaler Flüssigkeiten zur Untersuchung der Tumormikroumgebung des Pankreas-Adenokarzinoms

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Scherprobenprotokoll zur Bestimmung von Einzelzell-Materialeigenschaften

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

Optimizing HCC Organoid Formation for Target Identification and Drug Development

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids (Video) | JoVE

Entwicklung und Optimierung eines humanen hepatozellulären Karzinom-Patienten-abgeleiteten Organoidmodells zur Identifizierung potenzieller Zielmoleküle und zur Wirkstoffforschung

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics-Analyse von TMEM200A als Pan-Cancer-Biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...