Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית קלן פורצ'ן / הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת קלן. אנו מודים על הסיוע הטכני של סוזן נייס, מיכאלה הייטמן ואנקה ויננד-דורוויילר. נינגבו פאן נתמך כספית על ידי מועצת מלגות העילית של גואנגג'ואו (GESC). המחברים מודים לד"ר יהושע ד'רוזאריו על עזרתו בעריכה לשונית.

תרבות PDO מבוססת וצומחת היטב מייצגת את הבסיס לתת-תרבות מוצלחת ולשימור בהקפאה המתוארים בפרוטוקול זה. כאן, מחשבי כף יד של EAC נוצרו מרקמת הגידול העיקרית של חולי EAC באמצעות הפרוטוקול שתואר על ידי Karakasheva T. A. et al17. רקמות EAC נאספו מביובנק באישור BioMaSOTA (אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיט?...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

בפרוטוקול זה מתוארות שתי תת-תרבויות שונות ושיטות שימור בהקפאה של PDOs EAC, כלומר, עם ובלי עיכול של תאים בודדים. מספר מחקרים המליצו על העברת PADO EAC עם עיכול של תאים בודדים15,17, מה שמועיל לרוב הניסויים הדורשים שליטה במספר התאים, צפיפות אחידה ומבנה חלול המאפשר מעקב אח?...

סרטן הוושט (EC) הוא הגורם העשירי בשכיחותו והשישי המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם1. אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) היא אחד מתתי-הסוגים ההיסטולוגיים העיקריים של EC ומתרחשת בעיקר במדינות המערב2. בעשור האחרון, שכיחות ה- EAC עלתה באופן משמעותי במדינות מפותחות רבות, כולל גרמניה3. בשל האגרסיביות של הסרטן וחוסר הסימפטומים בשלב המוקדם של התפתחות הגידול, הפרוגנוזה הכוללת בחולי EAC גרועה, ומראה שיעור הישרדות של 5 שנים של כ -20%2,4,5.
מאז סוף המאה העשרים הוקמו מספר מודלים למחקר הביו-רפואי של EAC. קווי תאי ה-EAC האנושיים הקלאסיים שהוקמו בשנות ה-90 שלהמאה ה-20, מרחיבים את הידע שלנו על ביולוגיה של גידולי EAC, גנטיקה של גידולים כמו גם אסטרטגיות נגד גידולים, ומשמשים בדרך כלל במחקר EAC. חוץ מזה, כמה קבוצות מחקר פיתחו בהצלחה מודלים של בעלי חיים של EAC או הוושט של בארט על ידי חשיפת בעלי החיים לגורמי סיכון ידועים כגון ריפלוקס גסטרו-וושט באמצעות גישות כירורגיות או דלקתיות 7,8,9. בנוסף, מודלים של xenograft (PDX) שמקורם בחולה, אשר משרים רקמות סרטן ראשוניות של EAC באופן תת עורי או אורתוטופי בעכברים אימונודיים, פותחו כדי לדמות התנהגות ביולוגית של גידול EAC אנושי וסביבת הגידול 10,11,12. עם זאת, למרות שהמודלים הללו משפרים את היישומים הקליניים ואת ההבנה שלנו את המנגנונים המולקולריים שמאחורי גידולי EAC והתקדמותם, עדיין קיים אתגר גדול להמחשת תוצאות ממודלים מחקריים אלה לבני אדם.
אורגנואידים של גידול שמקורם בחולה (PDOs) גדלים במערכת תרביות תלת-ממדית המחקה התפתחות אנושית והתחדשות איברים במבחנה. ה-PDOs, שנוצרו מהרקמה הראשונית של המטופלים, משחזרים את המאפיינים המולקולריים והפנוטיפיים של הגידול האנושי והראו יישומים מבטיחים בפיתוח תרופות ובטיפול מותאם אישית בסרטן13,14. על ידי השוואת עשרה מקרים של PDOs EAC עם רקמת הגידול הזוגית שלהם, מדווחים כי EAC PDOs חולקים תכונות היסטופתולוגיות דומות ונוף גנומי עם הגידול הראשוני, שומרים על הטרוגניות תוך גידולית ומאפשרים סינון תרופות יעיל במבחנה15. EAC PDOs שימשו גם בחקר האינטראקציה של תאי גידול EAC עם פיברובלסטים הקשורים לסרטן שמקורם בחולה (CAFs), מה שמצביע על יישום רב עוצמה בתחום המחקר של מיקרו-סביבה של הגידול16. למרבה הצער, היו פרוטוקולים מוגבלים זמינים לפיתוח והפצה של מחשבי כף יד של EAC. כאן מתוארות שתי שיטות שונות לתת-תרבות ולשימור של מחשבי כף יד מסוג EAC בפירוט: עם ובלי עיכול של תאים בודדים. השיטות הסטנדרטיות לתחזוקה של מחשבי כף יד מסוג EAC ויישומיהם יכולות לתמוך בחוקרים לבחור שיטות מתאימות למטרות שונות במחקר ה-EAC PDO שלהם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

היעדרם של מודלים מחקריים תרגומיים מתאימים המשקפים מחלה ראשונית כדי לחקור גידולים ואסטרטגיות טיפוליות הוא מכשול מרכזי באדנוקרצינומה של הוושט (EAC). אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) התגלו לאחרונה כמודל פרה-קליני יוצא דופן במגוון סוגי סרטן. עם זאת, ישנם עדיין פרוטוקולים מוגבלים הזמינים לפיתוח מחשבי כף יד מסוג EAC. לאחר התבססות ה-PDOs, ההתפשטות וההקפאה החיוניות לניתוחים נוספים במורד הזרם. כאן, שתי שיטות שונות תוקנו עבור תת-תרבות של EAC PDOs ושימור בהקפאה, כלומר עם ובלי עיכול של תאים בודדים. שתי השיטות יכולות להשיג באופן אמין את כדאיות התא המתאימה והן ישימות עבור מערך ניסויי מגוון. המחקר הנוכחי הראה כי תת-תרבות של PDOs EAC עם עיכול של תאים בודדים מתאימה לרוב הניסויים הדורשים בקרת מספר תאים, צפיפות אחידה ומבנה חלול המאפשר מעקב אחר גודל. עם זאת, השיטה המבוססת על תאים בודדים מראה צמיחה איטית יותר בתרבית, כמו גם לאחר גידול מחדש ממלאי קפוא. חוץ מזה, תת-תרבות עם עיכול של תאים בודדים מאופיינת ביצירת מבנים חלולים עם ליבה חלולה. לעומת זאת, עיבוד PDOs EAC ללא עיכול של תאים בודדים הוא חיובי עבור שימור בהקפאה, הרחבה ואפיון היסטולוגי. בפרוטוקול זה מתוארים היתרונות והחסרונות של תת-תרבות ושימור בהקפאה של PDOs EAC עם ובלי עיכול של תאים בודדים כדי לאפשר לחוקרים לבחור שיטה מתאימה לעיבוד וחקירה של האורגנואידים שלהם.

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הכוללים תת-תרבות ושימור בהקפאה של PDOs EAC עם וללא עיכול של תאים בודדים.
איור 1 מציג תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה של שתי אסטרטגיות תת-תרבות שונות. ה-EAC PDOs הגיעו לצפיפות המתאימה לתת-תרבות (איור 1, משמאל). תת-תרבות ללא עי?...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

פרוטוקול זה מתאר את השיטות של תת-תרבות ושימור בהקפאה של אורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט עם ובלי עיכול של תאים בודדים כדי לאפשר לחוקרים לבחור אסטרטגיות מתאימות על סמך התכנון הניסויי שלהם.

תת-תרבות ושימור בהקפאה של אורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט: יתרונות וחסרונות לעיכול תאים בודדים

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

זהו פרוטוקול קל ודמיוני המדגים טיפול באורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט בשני תהליכי תת-תרבות שונים עם וללא עיכול של תא יחיד. הפרוטוקול הסטנדרטי לתת-תרבויות אורגנואידים של EAC בשתי שיטות שונות יכול לתמוך בחוקרים בבחירת טכניקות מתאימות ליישומים שונים במורד הזרם בניסויים מבוססי EAC PDO שלהם. תוך כדי התמודדות עם PDOs, חיוני לשים לב לפרטים בכל שלב.SOP מבוסס צוות הוא חיוני לאיכות ה- PODs. מי שידגימו את ההליך יהיו אחת מתלמידות הדוקטורט שלנו, נינג בו פאן, וליסה רץ, עוזרת הטכניקה של המעבדה. יש לחמם מראש צלחת של 12 בארות על ידי דגירה לילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות פחמן דו-חמצני.אם זמין, השתמש בבארות ריקות מצלחת עם תרבית האורגנואידים שמקורה בחולה. דגירה בנפח מתאים של ג'ל ECM למשך שעה אחת על קרח כדי להנזיל. הניחו את תמיסת שחזור התאים על הקרח.הסר את הצלחת עם PDOs גדלים מהאינקובטור. לשאוף למדיום ישן באמצעות משאבת ואקום. הוסף 500 מיקרוליטרים לכל כיפה של תמיסת שחזור תאים קרים כקרח לתוך הבאר.פירקו את ג'ל ה-ECM על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפצל כיפות ג'ל ECM לחתיכות קטנות באמצעות 1, 000 קצות מיקרוליטר עם פתח רחב. שלבו את תמיסת ה-PDO, ג'ל ה-ECM והתאוששות התאים משתי בארות לכל היותר והעבירו אותה לצינור בעל קשירה נמוכה של חמישה מיליליטר. דגירה של צינור זה על קרח במשך 20 דקות.מערבבים כל חמש דקות על ידי היפוך הצינור. צנטריפוגה של הצינור במהירות של 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. אם אין גלולה נראית לעין, הסר בזהירות את ה-supernatant עם משאבת ואקום עד שתגיע לשלב המכיל תמיסת PDO של ג'ל ECM והוסף שלושה מיליליטרים של תמיסת שחזור תאים קרים כקרח.הופכים את הצינור כמה פעמים ודוגרים על קרח עוד 10 דקות. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את ה-supernatant בזהירות באמצעות משאבת ואקום או פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר.נסה להסיר את supernatant ככל האפשר. אחסנו את גלולת ה-PDO על קרח. הסר טיפים 201, 000 microliter מקורר מראש עם פתח רחב מהמקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס והנח אותם על ספסל נקי.חשב 50 מיקרוליטרים של ג'ל ECM לכל כיפה המתוכננת לזריעה, בתוספת 50 מיקרוליטרים נוספים. לאחר מכן יש לבצע שימוש חוזר בכדור בג'ל ECM באמצעות קצה 1, 000 מיקרוליטר מקורר מראש ולערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה כ-10 פעמים. מוציאים את צלחת 12 הבאר שחוממה מראש מהאינקובטור לפני זריעת הכיפות.זרעו את הכיפות המכילות 50 מיקרוליטרים של ג'ל ECM לתוך הצלחת החמה. דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 עד 30 דקות כדי לחזק את ג'ל ה-ECM. הוסיפו את מדיום ה-PDO המחומם מראש בזהירות מבלי להפריע לכיפות.עקוב אחר PDOs שנזרעו מתחת למיקרוסקופ. תרבית את ה-PDOs למשך 7 עד 14 יום עד להתרחשות הצפיפות והמורפולוגיה הנדרשות. הכן את מדיום העיכול על ידי ערבוב שני מיליליטרים של 0.25% טריפסין EDTA ו-20 מיקרוליטרים DNAase I לעיכול PDOs שנקטפו משתי בארות.בצעו החייאה של הכדור שהוכן בעבר בנפח מתאים של 0.25% טריפסין EDTA ו-DNAase I שחוממו מראש וערבבו אותו כ-10 פעמים על ידי פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור מסתובב עם מהירות סיבוב של מינימום של 28 סל"ד. הכינו צינור 15 מיליליטר המכיל שישה מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין סויה.לאחר העיכול, ערבבו היטב את ה-PDOs המעוכלים כמה פעמים עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לשבש את ה-PDOs. העבר את ה- PDOs המעוכלים לצינור 15 מיליליטר המכיל תמיסת SDI כדי לעצור את העיכול. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.יש להשליך את ה-supernatant בזהירות באמצעות משאבת ואקום או פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. החייאת הכדור במיליליטר אחד של מדיום בסיסי. קבעו את ריכוז התאים ואת יכולת הכדאיות שלהם באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.חישבו את מספר התא לפי הכיפות המתוכננות לזריעה, בתוספת כיפה אחת נוספת, והעבירו אותן לצינור טרי בעל קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך בזהירות את חומר העל באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר.הוסיפו נפח מתאים של ג'ל ECM לכדורית באמצעות קצה פתח רחב של 1, 000 מיקרוליטר מקורר מראש. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה בערך 10 פעמים. זרעו את ה-PDOs המעוכלים לתוך צלחת של 12 בארות כפי שהוכח בעבר.התחל בתהליך שימור בהקפאה של מחשבי כף יד לא מעוכלים עם גלולה שהוכנה בעבר. השתמשו ב-500 מיקרוליטרים של מדיום הקפאה קר כדי להחיות את הכדור משתי כיפות ולהעביר אותו לבקבוקון קריוגני. הקפיאו את ה-PDOs למשך הלילה במקפיא באמצעות מיכל הקפאת תאים מתאים.מעבירים את ה-PDOs הקפואים למקפיא של מינוס 150 מעלות צלזיוס. לצורך שימור בהקפאה של PDOs מעוכלים, העבירו תאים לצינור טרי בעל קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.יש להשליך את הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. בצעו החייאה של הכדור ב-500 מיקרוליטרים המקפיאים את מדיום והעברתו לבקבוקון קריוגני. הקפאו את ה-PDOs למשך הלילה במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס באמצעות מיכל הקפאת תאים מתאים והעבירו אותם למקפיא של מינוס 150 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.תת-תרבות ללא עיכול חד-תאי לוקחת פחות זמן להגיע לצפיפות דומה ומובילה בעיקר למבנים קומפקטיים. לעומת זאת, ה-PDOs המעוכלים של התא הבודד מראים מבנים עם ליבה חלולה. האיור מראה את צביעת האאוזין של המטוקסילין ואת הכתמת האימונוהיסטוכימיה של מחשבי כף יד EAC משובצי פרפין עם מבנים קומפקטיים וחלולים.הפנקיטוקראטין מאפשר זיהוי של תאי גידול אפיתל. הציטוקרטין 7 מדגיש את תאי הגידול המובחנים בבלוטות. המבנה הקומפקטי קיים בעיקר בתרבית הלא מעוכלת, בעוד שהמבנה החלול דומיננטי בתרבית שעברה עיכול חד-תאי.ה-Ki67 מדגיש את אוכלוסיות התאים עם התפשטות תאית גבוהה יותר. ה-Ki67 באדום וה-PanCK בירוק התפלגו באופן דומה בין הרקמה הראשונית של EAC, המבנה הקומפקטי EAC PDO והמבנה החלול של EAC PDO. האיור מראה מאפיינים מורפולוגיים של PDOs EAC ביום הראשון של ההתאוששות ממלאי קפוא עם שימור בהקפאה על בסיס תא יחיד ושימור בהקפאה מבוססת PDO לא מעוכלת.אנו ממליצים להכין מראש תוכנית ברורה של תת-תרבות. בקרת טמפרטורה ופיפטינג עדין חיוניים לטיפול נכון בג'לים של ECM בעת תת-תרבות של PDOs. הפרוטוקול שלנו מספק לחוקרים את המהות לשמירה על ה-EAC PDOs שלהם בהתאם למטרת המחקר שלהם לניתוח במורד הזרם כגון בדיקת סינון תרופות, ציטומטריית זרימה או ניתוח היסטולוגי.אנו מקווים שעבודתנו תוכל לסייע לחוקרי אורגנואידים לקבל החלטות מהירות וקלות עבור האחסון ותת-התרבות של האורגנואידים, במיוחד עבור תוצאות חזקות של חומרים שמקורם בחולה במחקר תרגומי.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

הקמה ואפיון של שלוש מנות העמידות Afatinib של ריאה אדנוקרצינומה PC-9 תאים שפותחו עם הגדלת מינונים של Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

פרוטוקול בדיקת גזירה לקביעת תכונות חומר חד-תאי

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...