Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Köln Fortune Program / Facoltà di Medicina, Università di Colonia. Ringraziamo l'assistenza tecnica di Susanne Neiss, Michaela Heitmann e Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan è stato sostenuto finanziariamente dal Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Gli autori ringraziano il Dr. Joshua D'Rozario per la sua assistenza nell'editing linguistico.

Una cultura DOP consolidata e ben cresciuta rappresenta la base per una sottocultura e una crioconservazione di successo descritte in questo protocollo. Qui, le DOP EAC sono state generate dal tessuto tumorale primario dei pazienti EAC utilizzando il protocollo descritto da Karakasheva T. A. et al17. I tessuti EAC sono stati raccolti dalla biobanca sotto l'approvazione di BioMaSOTA (approvato dal Comitato Etico dell'Università di Colonia, ID: 13-091).
NOTA: le DOP EAC ...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. 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In questo protocollo, vengono descritti due diversi metodi di sottocoltura e crioconservazione delle DOP EAC, cioè con e senza digestione a singola cellula. Diversi studi hanno raccomandato il passaggio di EAC DOP con digestione a singola cellula15,17, che è utile per la maggior parte degli esperimenti che richiedono il controllo del numero cellulare, densità uniforme e una struttura cava che facilita il monitoraggio delle dimensioni. Tuttavia, il metodo basat...

Il cancro esofageo (EC) è la decima più comune e la sesta causa di morte per cancro in tutto il mondo1. L'adenocarcinoma esofageo (EAC) è uno dei principali sottotipi istologici della CE e si verifica principalmente nei paesi occidentali2. Nell'ultimo decennio, l'incidenza dell'EAC è aumentata significativamente in molti paesi sviluppati, tra cui la Germania3. A causa dell'aggressività del cancro e della mancanza di sintomi durante la fase iniziale dello sviluppo del tumore, la prognosi complessiva nei pazienti con EAC è scarsa, mostrando un tasso di sopravvivenza a 5 anni di circa il 20%2,4,5.
Dalla fine del XX secolo, sono stati stabiliti diversi modelli per la ricerca biomedica di EAC. Le classiche linee cellulari EAC umane che sono state stabilite nel 19906, estendono la nostra conoscenza della biologia tumorale EAC, genetica tumorale e strategie antitumorali, e sono comunemente usati nella ricerca EAC. Inoltre, alcuni gruppi di ricerca hanno sviluppato con successo modelli animali di EAC o esofago di Barrett esponendo gli animali a fattori di rischio noti come il reflusso gastroesofageo attraverso approcci chirurgici o infiammatori 7,8,9. Inoltre, sono stati sviluppati modelli di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) che innestano i tessuti tumorali primari EAC per via sottocutanea o ortotopica in topi immunodeficienti, per simulare il comportamento biologico del tumore EAC umano e l'ambiente tumorale 10,11,12. Tuttavia, nonostante questi modelli migliorino le applicazioni cliniche e la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base della tumorigenesi e della progressione dell'EAC, c'è ancora una grande sfida per estrapolare i risultati di questi modelli di ricerca agli esseri umani.
Gli organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP) vengono coltivati in un sistema di coltura 3D che imita lo sviluppo umano e la rigenerazione degli organi in vitro. Generate dal tessuto primario dei pazienti, le DOP ricapitolano le caratteristiche molecolari e fenotipiche del tumore umano e hanno mostrato applicazioni promettenti nello sviluppo di farmaci e nel trattamento personalizzato del cancro13,14. Confrontando dieci casi di EAC DOP con il loro tessuto tumorale accoppiato, le DOP EAC condividono caratteristiche istopatologiche e paesaggi genomici simili con il tumore primario, mantengono l'eterogeneità intratumorale e facilitano uno screening efficiente dei farmaci in vitro15. Le DOP EAC sono state utilizzate anche nello studio dell'interazione delle cellule tumorali EAC con i fibroblasti associati al cancro derivati dal paziente (CAF), indicando una potente applicazione nel campo della ricerca sul microambiente tumorale16. Sfortunatamente, sono stati disponibili protocolli limitati per lo sviluppo e la propagazione di DOP EAC. Qui, vengono descritti in dettaglio due diversi metodi per la subcoltura e la conservazione delle DOP EAC: con e senza digestione a singola cellula. I metodi standardizzati per il mantenimento delle DOP EAC e delle loro applicazioni possono aiutare i ricercatori a scegliere metodi appropriati per scopi diversi nella loro ricerca EAC DOP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

La mancanza di adeguati modelli di ricerca traslazionale che riflettano la malattia primaria per esplorare la tumorigenesi e le strategie terapeutiche è un grosso ostacolo nell'adenocarcinoma esofageo (EAC). Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono recentemente emersi come un notevole modello preclinico in una varietà di tumori. Tuttavia, ci sono ancora protocolli limitati disponibili per lo sviluppo di DOP EAC. Una volta stabilite le DOP, la propagazione e la crioconservazione sono essenziali per ulteriori analisi a valle. Qui, due diversi metodi sono stati standardizzati per la sottocoltura e la crioconservazione delle DOP EAC, cioè con e senza digestione a singola cellula. Entrambi i metodi possono ottenere in modo affidabile un'appropriata vitalità cellulare e sono applicabili per una diversa configurazione sperimentale. L'attuale studio ha dimostrato che la subculturazione di DOP EAC con digestione a singola cellula è adatta per la maggior parte degli esperimenti che richiedono il controllo del numero di cellule, la densità uniforme e una struttura cava che facilita il monitoraggio delle dimensioni. Tuttavia, il metodo basato su singole cellule mostra una crescita più lenta in coltura e dopo la ri-coltivazione da stock congelati. Inoltre, la subculturazione con digestione a singola cellula è caratterizzata dalla formazione di strutture cave con un nucleo cavo. Al contrario, l'elaborazione di DOP EAC senza digestione a singola cellula è favorevole per la crioconservazione, l'espansione e la caratterizzazione istologica. In questo protocollo, vengono descritti i vantaggi e gli svantaggi della sottocoltura e della crioconservazione delle DOP EAC con e senza digestione monocellulare per consentire ai ricercatori di scegliere un metodo appropriato per elaborare e studiare i loro organoidi.

Questo protocollo presenta le procedure che includono la sottocoltura e la crioconservazione delle DOP EAC con e senza digestione a singola cellula.
La Figura 1 mostra immagini rappresentative a contrasto di fase delle due diverse strategie di sottocultura. Le DOP EAC hanno raggiunto una densità appropriata per la subcoltura (Figura 1, a sinistra). La sottoculturazione senza digestione a singola cellula richiede meno tempo per raggiu...

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Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Questo protocollo descrive i metodi di sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo con e senza digestione a singola cellula per consentire ai ricercatori di scegliere strategie appropriate in base al loro disegno sperimentale.

Sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo: pro e contro per la digestione a cellula singola

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

È un protocollo facile e visualizzato che dimostra la gestione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo in due diversi processi di sottocoltura con e senza digestione a singola cellula. Il protocollo standardizzato per la sottoculturazione degli organoidi EAC in due diversi metodi può supportare i ricercatori nella scelta di tecniche appropriate per diverse applicazioni a valle nei loro esperimenti basati su EAC PDO. Quando si tratta di DOP, è essenziale prestare attenzione ai dettagli in ogni passaggio.Una SOP basata sul team è fondamentale per la qualità dei POD. A dimostrare la procedura saranno uno dei nostri dottorandi Ning Bo Fan e Lisa Raatz, assistente tecnica del laboratorio. Pre-riscaldamento una piastra a 12 pozzetti mediante incubazione notturna a 37 gradi Celsius utilizzando anidride carbonica.Se disponibili, utilizzare pozzetti vuoti da una piastra con la coltura organoide derivata dal paziente. Incubare un volume appropriato di gel ECM per un'ora sul ghiaccio per liquefare. Posizionare la soluzione di recupero cellulare sul ghiaccio.Rimuovere la piastra con DOP in crescita dall'incubatore. Aspirare il vecchio mezzo usando una pompa per vuoto. Aggiungere 500 microlitri per cupola di soluzione di recupero delle celle ghiacciate nel pozzo.Disintegrare il gel ECM pipettando su e giù più volte per frammentare le cupole in gel ECM in piccoli pezzi utilizzando 1.000 punte di microlitro con un orifizio largo. Combinare il PDO, il gel ECM e la soluzione di recupero cellulare da un massimo di due pozzetti e trasferirlo in un tubo a legatura bassa di cinque millilitri. Incubare questo tubo sul ghiaccio per 20 minuti.Mescolare ogni cinque minuti invertendo il tubo. Centrifugare il tubo ad una velocità di 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Se non c'è pellet visibile, rimuovere con attenzione il surnatante con una pompa per vuoto fino a raggiungere la fase contenente la soluzione di gel ECM DOP e aggiungere tre millilitri di soluzione di recupero delle celle ghiacciate.Capovolgere il tubo un paio di volte e incubare sul ghiaccio per altri 10 minuti. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Scartare accuratamente il surnatante utilizzando una pompa per vuoto o una pipetta da 1.000 microlitri.Cerca di rimuovere il surnatante il più possibile. Conservare il pellet DOP su ghiaccio. Rimuovere le punte pre-raffreddate a microlitri 201.000 con un orifizio largo dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e posizionarle su una panca pulita.Calcola 50 microlitri di gel ECM per cupola pianificata per la semina, più 50 microlitri extra. Quindi risospesciare il pellet in gel ECM utilizzando una punta pre-raffreddata da 1.000 microlitri e mescolare pipettando su e giù circa 10 volte. Rimuovere la piastra a 12 pozzetti preriscaldata dall'incubatrice prima di seminare le cupole.Semina le cupole contenenti 50 microlitri di gel ECM nella piastra calda. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti per solidificare il gel ECM. Aggiungere con attenzione il mezzo DOP preriscaldato senza disturbare le cupole.Monitorare le DOP seminate al microscopio. Coltivare le DOP per 7-14 giorni fino a quando non si verificano la densità e la morfologia richieste. Preparare il mezzo di digestione mescolando due millilitri di 0,25% di tripsina EDTA e 20 microlitri DNAase I per digerire le DOP raccolte da due pozzi.Risospendare il pellet precedentemente preparato in un volume appropriato di 0,25% di tripsina EDTA e DNAase I preriscaldati e mescolarlo circa 10 volte pipettando su e giù usando una pipetta da 1.000 microliti. Incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore rotante con una velocità di rotazione di almeno 28 RPM. Preparare un tubo da 15 millilitri contenente sei millilitri di soluzione di inibitore della tripsina di soia.Dopo la digestione, mescolare accuratamente le DOP digerite un paio di volte con una pipetta da 1.000 microlitri per interrompere le DOP. Trasferire le DOP digerite nel tubo da 15 millilitri contenente la soluzione SDI per interrompere la digestione. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.Scartare accuratamente il surnatante utilizzando una pompa per vuoto o una pipetta da 1.000 microlitri. Risospendare il pellet in un millilitro di mezzo basale. Determinare la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro.Calcola il numero di celle in base alle cupole pianificate per la semina, più una cupola extra, e trasferiscile in un tubo a legatura basso da 1,5 millilitri fresco. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Scartare con attenzione il surnatante usando una pipetta da 1.000 microlitri.Aggiungere un volume appropriato di gel ECM al pellet utilizzando una punta dell'orifizio pre-raffreddata larga 1.000 microlitro. Mescolare pipettando su e giù circa 10 volte. Seminare le DOP digerite in una piastra a 12 pozzetti come dimostrato in precedenza.Avviare il processo di crioconservazione delle DOP non digerite con pellet precedentemente preparato. Utilizzare 500 microlitri di mezzo di congelamento freddo per risospese il pellet da due cupole e trasferirlo in una fiala criogenica. Congelare le DOP durante la notte nel congelatore utilizzando un contenitore di congelamento delle celle appropriato.Trasferire le DOP congelate in un congelatore a meno 150 gradi Celsius. Per la crioconservazione delle DOP digerite, trasferire le cellule in un tubo fresco a bassa legatura da 1,5 millilitri. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.Scartare accuratamente il surnatante usando una pipetta da 1.000 microlitri. Risospendare il pellet in un mezzo di congelamento da 500 microlitri e trasferirlo in una fiala criogenica. Congelare le DOP durante la notte in un congelatore a meno 80 gradi Celsius utilizzando un contenitore di congelamento a celle appropriato e trasferirle in un congelatore a meno 150 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.La subculturazione senza digestione monocellulare richiede meno tempo per raggiungere una densità comparabile e porta principalmente a strutture compatte. Al contrario, le DOP digerite a cellula singola mostrano strutture con un nucleo cavo. La figura mostra la colorazione dell'ematossilina eosina e la colorazione immunoistochimica delle DOP EAC incorporate nella paraffina con strutture compatte e cave.La pancitocutina consente l'identificazione delle cellule tumorali epiteliali. La citocheratina 7 evidenzia le cellule tumorali ghiandolari differenziate. La struttura compatta esiste prevalentemente nella coltura non digerita, mentre la struttura cava è dominante nella coltura che ha subito la digestione unicellulare.Il Ki67 evidenzia le popolazioni cellulari con maggiore proliferazione cellulare. Il Ki67 in rosso e il PanCK in verde sono stati distribuiti in modo simile tra tessuto primario EAC, struttura compatta EAC DOP e struttura cava EAC DOP. La figura mostra le caratteristiche morfologiche delle DOP EAC il primo giorno di recupero da stock congelati con crioconservazione a singola cellula e crioconservazione a base di DOP non digerita.Ti consigliamo di fare un chiaro piano di sottocultura in anticipo. Il controllo della temperatura e il pipettaggio delicato sono essenziali per la corretta manipolazione dei gel ECM durante la subcoltura delle DOP. Il nostro protocollo fornisce ai ricercatori il sostanziale per mantenere le loro DOP EAC in base al loro scopo di studio per l'analisi a valle come il test di screening dei farmaci, la citometria a flusso o l'analisi istologica.Speriamo che il nostro lavoro possa aiutare i ricercatori di organoidi a prendere decisioni rapide e facili per lo stoccaggio e la sottocoltura degli organoidi, in particolare per risultati robusti di materiali derivati dal paziente nella ricerca traslazionale.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

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Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometria a flusso di phospho con codici a barre fluorescenti cella per cella singola segnalazione analisi e scoperta del biomarcatore

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Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

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Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

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Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

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Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

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