Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

この研究はケルン大学ケルン・フォーチュン・プログラム/医学部の支援を受けた。Susanne Neiss、Michaela Heitmann、Anke Wienand-Dorweilerの技術支援に感謝します。寧波ファンは広州エリート奨学金評議会(GESC)から財政的支援を受けました。著者らは、言語編集におけるジョシュア・ドロザリオ博士の協力に感謝する。

確立され、よく成長しているPDO培養は、このプロトコルに記載されている継代培養と凍結保存を成功させるための基礎を表しています。ここで、EAC PDOは、Karakasheva T. A. et al17によって記載されたプロトコールを用いて、EAC患者の原発性腫瘍組織から生成された。EAC組織は、BioMaSOTA(ケルン大学倫理委員会、ID:13-091によって承認)の承認の下でバイオバンクから収集された。
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<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. 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R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

このプロトコルでは、EAC PDOの2つの異なる継代培養および凍結保存方法、すなわち単一細胞消化の有無にかかわらず記載されている。いくつかの研究では、単一細胞消化15,17によるEAC PDOの継代を推奨しており、これは細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験にとって有益である。しかしながら...

食道がん(EC)は、世界のがんによる死亡原因の第10位および第6位の死因1位です。食道腺癌(EAC)は、ECの主要な組織学的サブタイプの1つであり、主に西洋諸国で発生する2。ここ10年間で、EACの発生率はドイツを含む多くの先進国で大幅に増加しています3。がんの攻撃性および腫瘍発生の初期段階における症状の欠如のために、EAC患者の全体的な予後は悪く、約20%の5年生存率を示す2、4、5。
20世紀後半以来、EACの生物医学研究のためにいくつかのモデルが確立されてきました。1990年代に確立された古典的なヒトEAC細胞株6は、EAC腫瘍生物学、腫瘍遺伝学、抗腫瘍戦略に関する知識を拡張し、EAC研究で一般的に使用されています。その上、いくつかの研究グループは、外科的または炎症的アプローチを介して胃食道逆流などの既知の危険因子に動物を曝露することによって、EACまたはバレット食道の動物モデルの開発に成功している7,8,9。加えて、EAC原発性癌組織を皮下または同所性に免疫不全マウスに生着させる患者由来異種移植片(PDX)モデルが、ヒトEAC腫瘍の生物学的挙動および腫瘍環境をシミュレートするために開発された10、11、12。しかし、これらのモデルが臨床応用を改善し、EACの腫瘍形成と進行の背後にある分子メカニズムの理解を向上させているにもかかわらず、これらの研究モデルからヒトに結果を推定することは依然として大きな課題があります。
患者由来の腫瘍オルガノイド(PDO)は、インビトロでヒトの発達および臓器再生を模倣する3D培養系で増殖される。患者の原発組織から生成されるPDOは、ヒト腫瘍の分子的および表現型的特徴を再現し、医薬品開発および個別化がん治療における有望な用途を示している13,14。EAC PDOの10例を対になった腫瘍組織と比較することにより、EAC PDOは原発腫瘍と同様の組織病理学的特徴およびゲノムランドスケープを共有し、腫瘍内の不均一性を保持し、インビトロでの効率的な薬物スクリーニングを促進することが報告されている15。EAC PDOは、EAC腫瘍細胞と患者由来の癌関連線維芽細胞(CAF)との相互作用の研究にも使用され、腫瘍微小環境研究の分野における強力な応用を示している16。残念ながら、EAC PDO の開発と伝達に使用できるプロトコルは限られていました。ここでは、EAC PDOの継代培養と保存について、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法を詳細に説明します。EAC PDOとそのアプリケーションのメンテナンスのための標準化された方法は、研究者がEAC PDO研究におけるさまざまな目的に適した方法を選択するのを支援することができます。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

腫瘍形成および治療戦略を探求するための原疾患を反映する適切なトランスレーショナルリサーチモデルの欠如は、食道腺癌(EAC)における大きな障害である。患者由来のオルガノイド(PDO)は、最近、様々な癌における顕著な前臨床モデルとして浮上している。ただし、EAC PDO の開発に使用できるプロトコルはまだ限られています。PDO が確立されると、伝播と凍結保存は、さらに下流の解析に不可欠です。ここでは、EAC PDOの継代培養および凍結保存のために、すなわち、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法が標準化されている。どちらの方法も、適切な細胞生存率を確実に得ることができ、多様な実験セットアップに適用可能である。現在の研究は、単一細胞消化によるEAC PDOの継代培養が、細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験に適していることを実証した。しかしながら、単一細胞ベースの方法は、培養中および凍結ストックからの再培養後に遅い成長を示す。また、単一細胞消化による継代培養は、中空コアで中空構造を形成することを特徴とする。対照的に、単一細胞消化なしでEAC PDOを処理することは、凍結保存、拡張、および組織学的特徴付けに有利である。このプロトコルでは、単一細胞消化の有無にかかわらずEAC PDOの継代培養および凍結保存の長所と短所が説明されており、研究者はオルガノイドを処理および調査するための適切な方法を選択できます。

このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず、EAC PDOの継代培養および凍結保存を含む手順を提示する。
図1は 、2つの異なる継代培養戦略の代表的な位相差写真を示す。EAC PDOは継代培養に適した密度に達しました(図1、左)。単一細胞消化なしで継代培養すると、同等の密度に達するまでの時間が短縮され、主にコンパ...

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Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず食道腺癌オルガノイドの継代培養および凍結保存の方法を記述し、研究者が実験計画に基づいて適切な戦略を選択できるようにする。

食道腺癌オルガノイドの継代培養と凍結保存:単一細胞消化の長所と短所

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

これは、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる継代培養プロセスにおける食道腺癌オルガノイドの取り扱いを実証する、簡単で視覚化されたプロトコルです。EACオルガノイドを2つの異なる方法で再培養するための標準化されたプロトコルは、研究者がEAC PDOベースの実験において異なる下流アプリケーションに適した技術を選択するのを支援することができます。PDOを扱う際には、各ステップの詳細に注意を払うことが不可欠です。チームベースのSOPは、PODの品質にとって非常に重要です。手順を実演するのは、博士課程の学生であるNing Bo Fanと研究室の技術アシスタントであるLisa Raatzの1人です。二酸化炭素を用いて摂氏37度で一晩インキュベートすることにより、12ウェルプレートを予温する。利用可能な場合は、患者由来のオルガノイド培養物を含むプレートから空のウェルを使用してください。適量のECMゲルを氷上で1時間インキュベートして液化させる。細胞回収溶液を氷の上に置きます。成長しているPDOを含むプレートをインキュベーターから取り外します。真空ポンプを用いて古い媒体を吸引する。氷冷細胞回収溶液のドームあたり500マイクロリットルをウェルに加える。ECMゲルを数回上下にピペッティングして崩壊させ、広いオリフィスを備えた1,000マイクロリットルの先端を使用してECMゲルドームを小片に断片化します。最大 2 つのウェルから PDO、ECM ゲル、および細胞回収溶液を結合し、5 ミリリットルの低結合チューブに移します。このチューブを氷上で20分間インキュベートする。チューブを反転させて5分ごとに混合する。チューブを500倍のGの速度で摂氏4度で4分間遠心分離する。目に見えるペレットがない場合は、ECMゲルPDO溶液を含む相に達するまで真空ポンプで上清を慎重に除去し、3ミリリットルの氷冷細胞回収溶液を加える。チューブを数回反転させ、さらに10分間氷上でインキュベートする。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。上清は、真空ポンプまたは1,000マイクロリットルのピペットを使用して慎重に廃棄します。上澄み液はできるだけ取り除くようにしてください。PDOペレットを氷上に保管する。マイナス20°Cの冷凍庫から広いオリフィスで事前に冷却された201,000マイクロリットルの先端を取り出し、クリーンベンチに置きます。播種予定のドームあたり50マイクロリットルのECMゲルと、さらに50マイクロリットルのエキストラを計算します。次いで、予め冷却された1,000マイクロリットルの先端を用いてペレットをECMゲルに再懸濁し、約10回上下にピペッティングして混合する。ドームを播種する前に、予め温めた12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。50マイクロリットルのECMゲルを含むドームを温かいプレートに播種する。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で20〜30分間インキュベートし、ECMゲルを固化させた。ドームを乱すことなく、事前に温めたPDO培地を慎重に加えます。播種されたPDOを顕微鏡下で監視する。必要な密度と形態が起こるまでPDOを7〜14日間培養する。2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAと20マイクロリットルのDNAase Iを混合して消化培地を調製し、2つのウェルから採取したPDOを消化する。予め調製したペレットを適量に予め加温した0.25%トリプシンEDTAおよびDNAase Iに再懸濁し、1,000マイクロリットルのピペットを用いて上下にピペッティングすることによって約10回混合する。最低28RPMの回転速度を有する回転インキュベーター中で摂氏37度で10分間インキュベートする。6ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤溶液を含む15ミリリットルのチューブを準備する。消化後、消化したPDOを1,000マイクロリットルのピペットで数回徹底的に混合してPDOを崩壊させます。消化されたPDOをSDI溶液を含む15ミリリットルのチューブに移し、消化を停止します。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。上清は、真空ポンプまたは1,000マイクロリットルのピペットを使用して慎重に廃棄します。ペレットを1ミリリットルの基礎培地に再懸濁する。自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用して細胞濃度と生存率を決定します。播種のために計画されたドームと1つの余分なドームに従って細胞数を計算し、それらを新鮮な1.5ミリリットルの低結合チューブに移す。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。1,000マイクロリットルのピペットを使用して上清を慎重に廃棄する。適量のECMゲルを、予め冷却された1,000マイクロリットル幅のオリフィス先端を用いてペレットに加える。上下約10回ピペッティングして混ぜる。消化したPDOを12ウェルプレートに播種する。未消化PDOの凍結保存プロセスを、予め調製したペレットで開始する。500マイクロリットルの低温凍結培地を使用して、ペレットを2つのドームから再懸濁し、極低温バイアルに移す。適切な細胞凍結容器を使用して、冷凍庫でPDOを一晩凍結する。凍結したPDOをマイナス150°Cの冷凍庫に移します。消化されたPDOの凍結保存のために、細胞を新鮮な1.5ミリリットルの低結合チューブに移す。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。上清は1,000マイクロリットルのピペットを使用して慎重に廃棄してください。ペレットを500マイクロリットルの凍結培地に再懸濁し、極低温バイアルに移す。適切な細胞凍結容器を使用して、PDOをマイナス80°Cの冷凍庫で一晩凍結し、長期保存のためにマイナス150°Cの冷凍庫に移します。単一細胞消化なしで継代培養すると、同等の密度に達するのにかかる時間が短くなり、主にコンパクトな構造につながります。対照的に、単一細胞消化PDOは、中空コアを有する構造を示す。図は、コンパクトで中空構造のパラフィン包埋EAC PDOのヘマトキシリンエオジン染色および免疫組織化学染色を示しています。パンサイトケラチンは、上皮腫瘍細胞の同定を可能にする。サイトケラチン7は腺分化腫瘍細胞を強調する。コンパクトな構造は主に未消化培養物に存在し、中空構造は単一細胞消化を受けた培養物において優勢である。Ki67は、より高い細胞増殖を有する細胞集団を強調する。赤色のKi67と緑色のPanCKとは、EAC一次組織、EAC PDOコンパクト構造およびEAC PDO中空構造の間に同様に分布していた。この図は、単一細胞ベースの凍結保存と未消化のPDOベースの凍結保存による凍結ストックからの回収初日におけるEAC PDOの形態学的特徴を示しています。事前に明確なサブカルチャー計画を立てることをお勧めします。温度制御と穏やかなピペッティングは、PDOを継代培養する際のECMゲルの正しい取り扱いに不可欠です。当社のプロトコルは、薬物スクリーニングアッセイ、フローサイトメトリー、組織学的分析などの下流分析のために、研究目的に応じてEAC PDOを維持するための実質的なものを研究者に提供します。私たちの研究が、オルガノイドの研究者がオルガノイドの貯蔵と継代培養、特にトランスレーショナル研究における患者由来の材料の堅牢な結果について、迅速かつ容易な決定を下すのに役立つことを願っています。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

アファチニブ耐性肺腺癌PC-9細胞株の確立と特徴付けは、アファチニブの用量の増加とともに開発された

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

単一セル材料特性を決定するためのせん断アッセイプロトコル

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...