Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Köln Fortune Program/Det medisinske fakultet, Universitetet i Köln. Vi takker teknisk assistanse fra Susanne Neiss, Michaela Heitmann og Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan ble økonomisk støttet av Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Forfatterne takker Dr. Joshua D'Rozario for hans hjelp til språklig redigering.

En etablert og velvoksende PUD-kultur representerer grunnlaget for en vellykket subkultur og kryopreservering beskrevet i denne protokollen. Her ble EAC-PUD generert fra EAC-pasienters primære tumorvev ved hjelp av protokollen beskrevet av Karakasheva T. A. et al17. EAC vev ble samlet inn fra biobank under godkjenning av BioMaSOTA (godkjent av Etikkkomiteen ved Universitetet i Köln, ID: 13-091).
MERK: EAC-PUD-er har blitt dyrket i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 %...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

I denne protokollen beskrives to forskjellige subkultur- og kryopreserveringsmetoder for EAC-PUD-er, det vil si med og uten fordøyelse av enkeltceller. Flere studier anbefalte å passere EAC-PUD-er med encellet fordøyelse15,17, noe som er gunstig for de fleste eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og en hul struktur som letter størrelsessporing. Imidlertid er den encellebaserte metoden preget av langsommere vekst etter fordring fra frosne ...

Esophageal cancer (EC) er den tiende vanligste og den sjette ledende dødsårsaken fra kreft over hele verden1. Esophageal adenocarcinoma (EAC) er en av de viktigste histologiske undertypene av EC og forekommer hovedsakelig i vestlige land2. I løpet av det siste tiåret har EAC-forekomsten økt betydelig i mange utviklede land, inkludert Tyskland3. På grunn av aggressiviteten til kreft og mangel på symptomer i den tidlige fasen av tumorutviklingen, er den generelle prognosen hos EAC-pasienter dårlig, og viser en 5-års overlevelsesrate på ca. 20%2,4,5.
Siden slutten av det tjuende århundre har det blitt etablert flere modeller for biomedisinsk forskning av EAC. De klassiske menneskelige EAC-cellelinjene som ble etablert på 1990-tallet6, utvider vår kunnskap om EAC tumorbiologi, tumorgenetikk samt anti-tumorstrategier, og brukes ofte i EAC-forskning. Dessuten har noen forskningsgrupper vellykket utviklet dyremodeller av EAC eller Barretts spiserøret ved å utsette dyrene for kjente risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gjennom kirurgiske eller inflammatoriske tilnærminger 7,8,9. I tillegg ble pasientavledede xenograft (PDX) modeller som engraft EAC primærkreftvev subkutant eller ortopisk til immunodeficient mus, utviklet for å simulere menneskelig EAC tumor biologisk oppførsel og tumormiljø 10,11,12. Til tross for at disse modellene forbedrer kliniske anvendelser og vår forståelse av molekylære mekanismer bak EAC tumorigenesis og progresjon, er det imidlertid fortsatt en stor utfordring å ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodellene til mennesker.
Pasientavledede tumororganoider (PUD) dyrkes i et 3D-kultursystem som etterligner menneskelig utvikling og organregenerering in vitro. Pdoer er generert fra pasientenes primærvev, og rekapitulerer de molekylære og fenotypiske egenskapene til den menneskelige svulsten og har vist lovende anvendelser innen legemiddelutvikling og personlig kreftbehandling13,14. Ved å sammenligne ti tilfeller av EAC-PUD-er med deres parrede tumorvev, rapporteres EAC-PUD-er å dele lignende histopatologiske egenskaper og genomisk landskap med den primære svulsten, beholde intrasvulst heterogenitet og legge til rette for effektiv legemiddelscreening in vitro15. EAC-PUD-er ble også brukt til å studere samspillet mellom EAC-tumorceller og pasientavledede kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er), noe som indikerer en kraftig anvendelse innen tumormikromiljøforskning16. Dessverre har det vært begrensede protokoller tilgjengelig for utvikling og forplantning av EAC-P PUD-er. Her er to forskjellige metoder beskrevet for subkulturering og bevaring av EAC-PUD i detalj: med og uten enkeltcelle fordøyelse. Standardiserte metoder for vedlikehold av EAC-PUD-er og deres anvendelser kan støtte forskere til å velge passende metoder for ulike formål i sin EAC PUD-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

Mangelen på egnede translasjonelle forskningsmodeller som reflekterer primærsykdom for å utforske tumorigenese og terapeutiske strategier er et stort hinder i esophageal adenokarsinom (EAC). Pasientavledede organoider (PUD) har nylig dukket opp som en bemerkelsesverdig preklinisk modell i en rekke kreftformer. Det er imidlertid fortsatt begrensede protokoller tilgjengelig for utvikling av EAC-PDA-er. Når PUD-ene er etablert, er forplantning og kryopreservering avgjørende for ytterligere nedstrømsanalyser. Her har to forskjellige metoder blitt standardisert for EAC PDOer subkultur og kryopreservering, det vil si med og uten enkeltcelle fordøyelse. Begge metodene kan på en pålitelig måte oppnå passende celle levedyktighet og gjelder for et mangfoldig eksperimentelt oppsett. Den nåværende studien viste at subkulturerende EAC-PUD-er med enkeltcellet fordøyelse er egnet for de fleste eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og en hul struktur som letter størrelsessporing. Den encellede metoden viser imidlertid lavere vekst i kulturen så vel som etter re-dyrking fra frosne aksjer. Dessuten er subkulturering med encellet fordøyelse preget av å danne hule strukturer med en hul kjerne. I motsetning er behandling av EAC-PUD-er uten enkeltcelle fordøyelse gunstig for kryopreservering, ekspansjon og histologisk karakterisering. I denne protokollen beskrives fordelene og ulempene ved subkulturering og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten enkeltcellet fordøyelse for å gjøre det mulig for forskere å velge en passende metode for å behandle og undersøke organoidene sine.

Denne protokollen presenterer prosedyrene inkludert subkultur og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten fordøyelse av enkeltceller.
Figur 1 viser representative fasekontrastbilder av de to ulike subkulturstrategiene. EAC-PDI-er nådde riktig tetthet for subkulturering (figur 1, venstre). Subkulturering uten enkeltcellet fordøyelse tar mindre tid å nå sammenlignbar tetthet og fører hovedsakelig til kompakte strukturer (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Denne protokollen beskriver metodene for subkultur og kryopreservering av esophageal adenokarcinoma organoider med og uten enkeltcellet fordøyelse for å gjøre det mulig for forskere å velge passende strategier basert på deres eksperimentelle design.

Subkultur og kryopreservering av Esophageal Adenocarcinoma Organoider: Fordeler og ulemper for fordøyelsen med én celle

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Det er en enkel og visualisert protokoll som demonstrerer håndtering av esophageal adenokarcinoma organoider i to forskjellige subkulturprosess med og uten encellet fordøyelse. Den standardiserte protokollen for subkulturering av EAC-organoider i to forskjellige metoder kan støtte forskere i å velge passende teknikker for ulike nedstrømsapplikasjoner i deres EAC PUD-baserte eksperimenter. Mens du arbeider med PUD-er, er det viktig å være oppmerksom på detaljene i hvert trinn.En teambasert SOP er avgjørende for kvaliteten på POD-er. Å demonstrere prosedyren vil være en av våre ph.d.-studenter Ning Bo Fan og Lisa Raatz, laboratoriets teknikkassistent. Prewarm en 12-brønns plate ved overnatting inkubasjon ved 37 grader Celsius ved hjelp av karbondioksid.Bruk eventuelt tomme brønner fra en tallerken med den pasientavledede organoidkulturen. Inkuber et passende volum av ECM gel i en time på is for å flytende. Plasser cellegjenvinningsløsning på is.Fjern platen med voksende PUD-er fra inkubatoren. Aspirer gammelt medium ved hjelp av en vakuumpumpe. Tilsett 500 mikroliter per kuppel av is kaldcellegjenvinningsløsning i brønnen.Oppløs ECM-gelen ved å pipettere opp og ned flere ganger for å fragmentere ECM gelkupler i små biter ved hjelp av 1000 mikroliterspisser med et bredt byggverk. Kombiner PUD, ECM gel og cellegjenvinningsløsning fra maksimalt to brønner og overfør den til et fem milliliter lavt bindingsrør. Inkuber dette røret på is i 20 minutter.Bland hvert femte minutt ved å snu røret. Sentrifuger røret med en hastighet på 500 ganger G i fire minutter ved fire grader Celsius. Hvis det ikke er synlig pellets, fjern forsiktig supernatanten med en vakuumpumpe til fasen som inneholder ECM gel PUD-løsning er nådd og tilsett tre milliliter iskald cellegjenvinningsløsning.Snu røret et par ganger og inkuber på is i ytterligere 10 minutter. Sentrifuge ved 500 ganger G i fire minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten forsiktig med en vakuumpumpe eller en 1000 mikroliterpipette.Prøv å fjerne supernatanten så mye som mulig. Oppbevar PUD-pelletsen på is. Fjern forhåndskjølte 201 000 mikroliterspisser med en bred åpning fra minus 20 grader Celsius fryser og legg dem på en ren benk.Beregn 50 mikroliter ECM gel per kuppel planlagt for såing, pluss 50 mikroliter ekstra. Deretter resuspenderer du pelletsen i ECM gel ved hjelp av en forhåndskjølt 1000 mikroliterspiss og blander ved å pipettere opp og ned ca. 10 ganger. Fjern den forvarmede 12-brønnsplaten fra inkubatoren før du sår kuplene.Frø kuplene som inneholder 50 mikroliter ECM gel inn i den varme platen. Inkuber platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 20 til 30 minutter for å størkne ECM gel. Tilsett forvarmet PUD-medium forsiktig uten å forstyrre kuplene.Overvåk frø-PUD-er under mikroskopet. Kultur PUD-ene i 7 til 14 dager til den nødvendige tettheten og morfologien oppstår. Forbered fordøyelsesmediet ved å blande to milliliter på 0,25% trypsin EDTA og 20 mikroliter DNAase I for å fordøye PUD-er høstet fra to brønner.Resuspend den tidligere forberedte pellet i et passende volum av forhåndsvarmet 0,25% trypsin EDTA og DNAase I og bland den ca 10 ganger ved å pipettere opp og ned ved hjelp av en 1000 mikroliter pipette. Inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius i en roterende inkubator med en rotasjonshastighet på minst 28 RPM. Forbered et 15 milliliter rør som inneholder seks milliliter soyabønner trypsinhemmerløsning.Etter fordøyelsen blander du de fordøyde PUD-ene grundig noen ganger med en 1000 mikroliterpipette for å forstyrre PUD-ene. Overfør de fordøyde PUD-ene til 15 milliliterrøret som inneholder SDI-løsning for å stoppe fordøyelsen. Sentrifuge ved 500 ganger G i fire minutter ved fire grader Celsius.Kast supernatanten forsiktig med en vakuumpumpe eller en 1000 mikroliterpipette. Resuspend pellet i en milliliter basal medium. Bestemme cellekonsentrasjon og levedyktighet ved hjelp av en automatisert celleteller eller et hemocytometer.Beregn cellenummeret i henhold til kuplene som er planlagt for såing, pluss en kuppel ekstra, og overfør dem til et friskt 1,5 milliliter lavt bindingsrør. Sentrifuge ved 500 ganger G i fire minutter ved fire grader Celsius. Kast forsiktig supernatanten med en 1000 mikroliterpipette.Tilsett riktig volum ECM gel til pelletsen ved hjelp av en forhåndskjølt 1000 mikroliter bred åpningspiss. Bland ved å pipettere opp og ned ca 10 ganger. Frø de fordøyde PUD-ene i en 12-brønnsplate som vist tidligere.Start kryopreserveringsprosess av ufordøyde PUD-er med tidligere forberedt pellets. Bruk 500 mikroliter kaldt frysemedium for å gjenopplive pellet fra to kupler og overføre det til et kryogent hetteglass. Frys PUD-er over natten i fryseren ved hjelp av en passende cellefrysingsbeholder.Overfør de frosne PUD-ene til en minus 150 grader Celsius fryser. For kryopreservering av fordøyde PUD-er, overfør celler til et friskt 1,5 milliliter lavt bindingsrør. Sentrifuge ved 500 ganger G i fire minutter ved fire grader Celsius.Kast supernatanten forsiktig med en 1000 mikroliterpipette. Resuspend pellet i 500 mikroliter frysemiddel og overføre det til et kryogent hetteglass. Frys PUD-er over natten i en minus 80 grader Celsius fryser ved hjelp av en passende cellefrysingsbeholder og overfør dem til en minus 150 grader Celsius fryser for langsiktig lagring.Subkulturering uten encellet fordøyelse tar mindre tid å nå sammenlignbar tetthet og fører hovedsakelig til kompakte strukturer. I motsetning til dette viser de encellede fordøyde PUD-ene strukturer med en hul kjerne. Figuren viser hematoksylin eosinfarging og immunhiistokjemi farging av parafin-innebygd EAC PUD med kompakte og hule strukturer.Pancytokeratin muliggjør identifisering av epitel tumorceller. Cytokeratin 7 fremhever kjerteldifferensierte tumorceller. Den kompakte strukturen eksisterer hovedsakelig i den ufordøyde kulturen, mens den hule strukturen er dominerende i kulturen som gjennomgikk encellet fordøyelse.Ki67 fremhever cellepopulasjonene med høyere cellulær spredning. Ki67 i rødt og PanCK i grønt ble tilsvarende fordelt på EAC primærvev, EAC PUD kompakt struktur og EAC PUD hul struktur. Figuren viser morfologiske egenskaper ved EAC-PUD på den første dagen av utvinning fra frossen bestand med encellet kryopreservering og ufordøyd PUD-basert kryopreservering.Vi anbefaler å lage en klar subkulturplan på forhånd. Temperaturkontroll og skånsom pipettering er avgjørende for riktig håndtering av ECM geler ved subkulturerende PUD. Vår protokoll gir forskere det betydelige for å opprettholde sine EAC-PUD-er i henhold til deres studieformål for nedstrømsanalyser som legemiddelscreeningsanalyse, strømningscytometri eller histologisk analyse.Vi håper at vårt arbeid kan hjelpe organoidforskere til å ta raske og enkle beslutninger for lagring og subkultur av organoider, spesielt for robuste resultater av pasientavledede materialer i translasjonell forskning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantasjon av Syngeneic lunge Adenocarcinoma celler å studere PD-L1 uttrykk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flowcytometri med fluorescerende celle Barcoding for enkelt celle signalisering analyse og biomarkør oppdagelsen

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering og karakterisering av tre Afatinib-resistente Lung Adenokarsinom PC-9 Cell Lines utviklet med økende doser av Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering av pasient-avledet bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proksimale væsker for å undersøke tumormikromiljøet i bukspyttkjerteladenokarsinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generering og avbildning av mus og humane epitelorganoider fra normalt og tumorbrystvev uten å passere

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

modellering av oral-esophageal plateepitelkarsinom i 3D-organoider

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Skjæranalyseprotokoll for bestemmelse av encellede materialegenskaper

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics analyse av TMEM200A som en pan-kreft biomarkør

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...