Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Эта работа была поддержана программой Köln Fortune / медицинским факультетом Кельнского университета. Мы благодарим за техническую помощь Сюзанну Нейсс, Микаэлу Хайтманн и Анке Винанд-Дорвейлер. Нинбо Фань получил финансовую поддержку от Совета элитных стипендий Гуанчжоу (GESC). Авторы благодарят доктора Джошуа Д'Розарио за помощь в лингвистическом редактировании.

Устоявшаяся и хорошо развивающаяся культура PDO представляет собой основу для успешной субкультуры и криоконсервации, описанных в этом протоколе. Здесь EAC PDO были сгенерированы из первичной опухолевой ткани пациентов с EAC с использованием протокола, описанного Karakasheva T. A. et al17</su...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

В этом протоколе описаны два различных метода субкультуры и криоконсервации КПК, т.е. с одноклеточным пищеварением и без него. В нескольких исследованиях рекомендовалось пропускать EAC PDO с одноклеточным пищеварением15,17, что полезно для большинства экспе?...

Рак пищевода (ЭК) является десятой наиболее распространенной и шестой по значимости причиной смерти от рака во всем мире1. Аденокарцинома пищевода (ЭАС) является одним из основных гистологических подтипов ЭК и в основном встречается в западных странах2. В последнее десятилетие заболеваемость EAC значительно возросла во многих развитых странах, включая Германию3. Из-за агрессивности рака и отсутствия симптомов на ранней стадии развития опухоли общий прогноз у пациентов с ЭАС неблагоприятный, показывая 5-летнюю выживаемость около 20%2,4,5.
С конца двадцатого века было создано несколько моделей для биомедицинских исследований EAC. Классические клеточные линии EAC человека, которые были установлены в 1990-хгодах 6, расширяют наши знания о биологии опухолей EAC, генетике опухолей, а также противоопухолевых стратегиях и обычно используются в исследованиях EAC. Кроме того, некоторые исследовательские группы успешно разработали животные модели EAC или пищевода Барретта, подвергая животных воздействию известных факторов риска, таких как гастроэзофагеальный рефлюкс, с помощью хирургических или воспалительных подходов 7,8,9. Кроме того, модели ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, которые прививают первичные раковые ткани EAC подкожно или ортотопически в иммунодефицитных мышей, были разработаны для моделирования биологического поведения опухоли EAC человека и опухолевой среды 10,11,12. Однако, несмотря на то, что эти модели улучшают клиническое применение и наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе опухолевого генеза и прогрессирования EAC, по-прежнему существует серьезная проблема экстраполяции результатов этих исследовательских моделей на людей.
Полученные от пациента опухолевые органоиды (PDO) выращиваются в системе 3D-культур, которая имитирует развитие человека и регенерацию органов in vitro. Полученные из первичной ткани пациентов, PDO повторяют молекулярные и фенотипические характеристики опухоли человека и показали многообещающее применение в разработке лекарств и персонализированном лечении рака13,14. Сравнивая десять случаев EAC PDO с их парной опухолевой тканью, сообщается, что EAC PDO имеют сходные гистопатологические особенности и геномный ландшафт с первичной опухолью, сохраняют внутриопухолевую гетерогенность и облегчают эффективный скрининг лекарств in vitro15. EAC PDO также использовались при изучении взаимодействия опухолевых клеток EAC с полученными от пациента раковыми фибробластами (CAF), что указывает на мощное применение в области исследования микроокружения опухолей16. К сожалению, существуют ограниченные протоколы, доступные для разработки и распространения PDO EAC. Здесь подробно описаны два различных метода субкультурации и сохранения EAC PDO: с одноклеточным пищеварением и без него. Стандартизированные методы обслуживания EAC PDO и их приложений могут помочь исследователям выбрать подходящие методы для различных целей в своих исследованиях EAC PDO.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

Отсутствие подходящих трансляционных исследовательских моделей, отражающих первичное заболевание, для изучения опухолевого генеза и терапевтических стратегий является основным препятствием при аденокарциноме пищевода (EAC). Органоиды, полученные от пациентов (PDO), недавно стали замечательной доклинической моделью при различных видах рака. Тем не менее, по-прежнему существуют ограниченные протоколы, доступные для разработки EAC PDO. После того, как PDO установлены, распространение и криоконсервация имеют важное значение для дальнейшего последующего анализа. Здесь два различных метода были стандартизированы для субкультуры EAC PDO и криоконсервации, то есть с одноклеточным пищеварением и без него. Оба метода могут надежно получить соответствующую жизнеспособность клеток и применимы для разнообразной экспериментальной установки. Текущее исследование показало, что субкультурирование EAC PDO с одноклеточным пищеварением подходит для большинства экспериментов, требующих контроля количества клеток, равномерной плотности и полой структуры, которая облегчает отслеживание размера. Однако одноклеточный метод показывает более медленный рост культуры, а также после повторного культивирования из замороженных запасов. Кроме того, субкультура с одноклеточным пищеварением характеризуется образованием полых структур с полым ядром. Напротив, обработка EAC PDO без одноклеточного пищеварения благоприятна для криоконсервации, расширения и гистологической характеристики. В этом протоколе описаны преимущества и недостатки субкультуры и криоконсервации EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него, чтобы позволить исследователям выбрать подходящий метод обработки и исследования своих органоидов.

В этом протоколе представлены процедуры, включая субкультуру и криоконсервацию EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него.
На рисунке 1 показаны репрезентативные фазово-контрастные картины двух различных стратегий субкультуры. PDO EAC достигли соответст...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Этот протокол описывает методы субкультуры и криоконсервации органоидов аденокарциномы пищевода с одноклеточным пищеварением и без него, чтобы позволить исследователям выбирать соответствующие стратегии на основе их экспериментального дизайна.

Субкультура и криоконсервация органоидов аденокарциномы пищевода: плюсы и минусы одноклеточного пищеварения

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Это простой и визуализированный протокол, который демонстрирует работу с органоидами аденокарциномы пищевода в двух различных субкультурных процессах с одноклеточным пищеварением и без него. Стандартизированный протокол субкультурирования органоидов EAC двумя различными методами может помочь исследователям в выборе подходящих методов для различных последующих приложений в их экспериментах на основе EAC PDO. При работе с PDO важно обращать внимание на детали на каждом этапе.Командная СОП имеет решающее значение для качества POD. Продемонстрировать процедуру будут один из наших аспирантов Нин Бо Фан и Лиза Раатц, ассистент лаборатории. Предваряют 12-луночную плиту путем ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с использованием углекислого газа.Если доступно, используйте пустые колодцы из тарелки с органоидной культурой, полученной от пациента. Инкубируйте соответствующий объем геля ECM в течение одного часа на льду для разжижения. Поместите раствор для восстановления клеток на лед.Снимите пластину с растущими PDO из инкубатора. Аспирировать старую среду с помощью вакуумного насоса. Добавьте в скважину 500 микролитров на купол раствора для восстановления ледяных клеток.Распадайте гель ECM путем пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы раздробить купола геля ECM на небольшие кусочки, используя 1000 микролитровых наконечников с широким отверстием. Объедините PDO, гель ECM и раствор для восстановления клеток максимум из двух лунок и переложите его в пятимиллилитровую трубку с низким связующим звеном. Высиживайте эту трубку на льду в течение 20 минут.Перемешивать каждые пять минут, перевернув трубку. Центрифугируйте трубку со скоростью, в 500 раз превышающей G, в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Если видимой гранулы нет, осторожно удалите супернатант вакуумным насосом до тех пор, пока не будет достигнута фаза, содержащая раствор PDO геля ECM, и добавьте три миллилитра раствора для восстановления ледяных холодных клеток.Переверните трубку несколько раз и высиживайте на льду еще 10 минут. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно выбросьте супернатант с помощью вакуумного насоса или пипетки объемом 1000 микролитров.Постарайтесь удалить супернатант как можно больше. Храните гранулы PDO на льду. Снимите предварительно охлажденные 201 000 микролитровые наконечники с широким отверстием из морозильной камеры минус 20 градусов по Цельсию и поместите их на чистую скамейку.Рассчитайте 50 микролитров ECM-геля на купол, запланированный к посеву, плюс 50 микролитров дополнительно. Затем повторно суспендируют гранулу в геле ECM с использованием предварительно охлажденного наконечника 1000 микролитров и перемешивают, пипетируя вверх и вниз около 10 раз. Снимите предварительно нагретую 12-луночную плиту из инкубатора перед посевом куполов.Засейте купола, содержащие 50 микролитров геля ECM, в теплую тарелку. Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 20-30 минут, чтобы затвердеть гель ECM. Добавьте предварительно нагретую среду PDO осторожно, не нарушая купола.Мониторинг засеянных PDO под микроскопом. Культивируйте PDO в течение 7-14 дней до тех пор, пока не произойдет необходимая плотность и морфология. Подготовьте среду для пищеварения, смешав два миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА и 20 микролитров ДНК I для переваривания PDO, собранных из двух скважин.Повторно суспендируют ранее приготовленную гранулу в соответствующем объеме предварительно нагретых 0,25% трипсина ЭДТА и ДНК I и смешивают ее около 10 раз путем пипетки вверх и вниз с использованием пипетки 1000 микролитра. Инкубировать в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия во вращающемся инкубаторе со скоростью вращения не менее 28 об/мин. Приготовьте 15-миллилитровую трубку, содержащую шесть миллилитров раствора ингибитора трипсина сои.После пищеварения тщательно перемешайте переваренные PDO несколько раз с пипеткой 1000 микролитров, чтобы нарушить PDO. Переведите переваренные PDO в 15-миллилитровую трубку, содержащую раствор SDI, чтобы остановить пищеварение. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия.Осторожно выбросьте супернатант с помощью вакуумного насоса или пипетки объемом 1000 микролитров. Повторно суспендировать гранулу в одном миллилитре базальной среды. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.Рассчитайте количество ячеек в соответствии с куполами, запланированными к посеву, плюс один дополнительный купол и перенесите их в свежую 1,5-миллилитрную трубку с низким связующим звеном. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно выбросьте супернатант, используя пипетку объемом 1000 микролитров.Добавьте соответствующий объем геля ECM в гранулу, используя предварительно охлажденный наконечник отверстия шириной 1000 микролитров. Перемешайте, пипетируя вверх и вниз около 10 раз. Посейте переваренные PDO в 12-луночную пластину, как показано ранее.Запустите процесс криоконсервации непереваренных ПДО с предварительно приготовленными гранулами. Используйте 500 микролитров холодной морозильной среды, чтобы повторно суспендировать гранулу с двух куполов и перенести ее в криогенный флакон. Заморозьте PDO на ночь в морозильной камере, используя соответствующий контейнер для замораживания клеток.Переложите замороженные PDO в морозильную камеру с температурой минус 150 градусов по Цельсию. Для криоконсервации переваренных PDO перенесите клетки в свежую 1,5-миллилитрную трубку с низким связыванием. Центрифуга в 500 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия.Осторожно выбросьте супернатант, используя пипетку объемом 1000 микролитров. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитров морозильной среды и переложите ее в криогенный флакон. Заморозьте PDO на ночь в морозильной камере с температурой минус 80 градусов цельсия, используя соответствующий контейнер для замораживания ячеек, и переложите их в морозильную камеру при температуре минус 150 градусов Цельсия для длительного хранения.Субкультура без одноклеточного пищеварения занимает меньше времени для достижения сопоставимой плотности и в основном приводит к компактным структурам. Напротив, одноклеточные переваренные PDO показывают структуры с полым ядром. На рисунке показано окрашивание гематоксилиновым эозином и иммуногистохимическое окрашивание парафиновых ВАК КПК с компактными и полыми структурами.Панцитокератин позволяет идентифицировать эпителиальные опухолевые клетки. Цитокератин 7 выделяет железистые дифференцированные опухолевые клетки. Компактная структура преимущественно существует в непереваренной культуре, в то время как полая структура доминирует в культуре, которая подверглась одноклеточному пищеварению.Ki67 выделяет клеточные популяции с более высокой клеточной пролиферацией. Ki67 в красном цвете и PanCK в зеленом были аналогичным образом распределены между первичной тканью EAC, компактной структурой EAC PDO и полой структурой EAC PDO. На рисунке показаны морфологические характеристики ПДО ЭАК в первый день восстановления из замороженного сырья с одноклеточной криоконсервацией и непереваренной криоконсервацией на основе PDO.Рекомендуем заранее составить четкий план субкультуры. Контроль температуры и бережное пипетирование необходимы для правильного обращения с гелями ECM при субкультурной обработке PDO. Наш протокол предоставляет исследователям существенную возможность поддерживать свои PDO EAC в соответствии с их целью исследования для последующего анализа, такого как скрининговый анализ лекарств, проточная цитометрия или гистологический анализ.Мы надеемся, что наша работа может помочь исследователям органоидов принимать быстрые и простые решения для хранения и субкультуры органоидов, особенно для надежных результатов материалов, полученных от пациентов, в трансляционных исследованиях.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Целевые ячейки предварительного обогащения и весь геном усилители на одну ячейку вниз по течению характеристика

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Фосфоресцентный проточной цитометрии с люминесцентные клеток штриховое кодирование для сигнализации биомаркер обнаружение и анализ отдельной ячейки

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Создание и характеристика трех Afatinib-устойчивых легких аденокарциномы PC-9 Сотовые линии, разработанные с увеличением дозы Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Выделение проксимальных жидкостей для исследования микроокружения опухоли аденокарциномы поджелудочной железы

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Генерация и визуализация эпителиальных органоидов мыши и человека из нормальной и опухолевой ткани молочной железы без пассажа

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Моделирование плоскоклеточного рака полости рта и пищевода в 3D-органоидах

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Протокол сдвигового анализа для определения свойств одноячеистого материала

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Мультиомный анализ TMEM200A как панракового биомаркера

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...