Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
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Este trabajo fue apoyado por Köln Fortune Program/Facultad de Medicina de la Universidad de Colonia. Agradecemos la asistencia técnica de Susanne Neiss, Michaela Heitmann y Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan fue apoyado financieramente por el Consejo de Becas de Élite de Guangzhou (GESC). Los autores agradecen al Dr. Joshua D'Rozario por su ayuda en la edición lingüística.

Una cultura de DOP establecida y en buen crecimiento representa la base para una subcultura y criopreservación exitosas descritas en este protocolo. Aquí, las PDO de EAC se generaron a partir del tejido tumoral primario de los pacientes con EAC utilizando el protocolo descrito por Karakasheva T. A. et al17. Los tejidos de EAC se recolectaron del biobanco bajo la aprobación de BioMaSOTA (aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Colonia, ID: 13-091).
NOTA...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

En este protocolo, se describen dos métodos diferentes de subcultivo y criopreservación de las DOP de CAO, es decir, con y sin digestión unicelular. Varios estudios recomendaron pasar los PDO de EAC con digestión de una sola célula15,17, lo que es beneficioso para la mayoría de los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y una estructura hueca que facilita el seguimiento del tamaño. Sin embargo, el método basado en un...

El cáncer de esófago (CE) es la décima causa más común y la sexta causa de muerte por cáncer en todo el mundo1. El adenocarcinoma de esófago (CAO) es uno de los principales subtipos histológicos de la CE y se presenta principalmente en los países occidentales2. En la última década, la incidencia de la CAO ha aumentado significativamente en muchos países desarrollados, incluida Alemania3. Debido a la agresividad del cáncer y la falta de síntomas durante la etapa temprana del desarrollo del tumor, el pronóstico general en los pacientes con CAO es pobre, mostrando una tasa de supervivencia a 5 años de alrededor del 20%2,4,5.
Desde finales del siglo XX, se han establecido varios modelos para la investigación biomédica de la EAC. Las líneas celulares clásicas de EAC humanas que se establecieron en la década de 19906, amplían nuestro conocimiento de la biología tumoral de EAC, la genética tumoral y las estrategias antitumorales, y se utilizan comúnmente en la investigación de EAC. Además, algunos grupos de investigación han desarrollado con éxito modelos animales de EAC o esófago de Barrett al exponer a los animales a factores de riesgo conocidos como el reflujo gastroesofágico a través de enfoques quirúrgicos o inflamatorios 7,8,9. Además, se desarrollaron modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) que injertan tejidos de cáncer primario de EAC por vía subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes, para simular el comportamiento biológico del tumor EAC humano y el entorno tumoral 10,11,12. Sin embargo, a pesar de que estos modelos mejoran las aplicaciones clínicas y nuestra comprensión de los mecanismos moleculares detrás de la tumorigénesis y progresión de EAC, todavía existe un gran desafío para extrapolar los resultados de estos modelos de investigación a los humanos.
Los organoides tumorales derivados del paciente (PDO) se cultivan en un sistema de cultivo 3D que imita el desarrollo humano y la regeneración de órganos in vitro. Generadas a partir del tejido primario de los pacientes, las DOP recapitulan las características moleculares y fenotípicas del tumor humano y han mostrado aplicaciones prometedoras en el desarrollo de fármacos y el tratamiento personalizado del cáncer13,14. Al comparar diez casos de PDO de EAC con su tejido tumoral pareado, se informa que las PDO de EAC comparten características histopatológicas y un panorama genómico similares con el tumor primario, conservan la heterogeneidad intratumoral y facilitan el cribado farmacológico eficiente in vitro15. Los PDO de EAC también se utilizaron en el estudio de la interacción de las células tumorales de EAC con fibroblastos asociados al cáncer (CAF) derivados de pacientes, lo que indica una poderosa aplicación en el campo de la investigación del microambiente tumoral16. Desafortunadamente, ha habido protocolos limitados disponibles para desarrollar y propagar PDO de EAC. Aquí, se describen dos métodos diferentes para subculpir y preservar las DOP de LA CAO en detalle: con y sin digestión unicelular. Los métodos estandarizados para el mantenimiento de las DOP de EAC y sus aplicaciones pueden ayudar a los investigadores a elegir métodos apropiados para diferentes propósitos en su investigación de DOP de EAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

La falta de modelos de investigación traslacional adecuados que reflejen la enfermedad primaria para explorar la tumorigénesis y las estrategias terapéuticas es un obstáculo importante en el adenocarcinoma de esófago (CAO). Los organoides derivados de pacientes (PDO) han surgido recientemente como un modelo preclínico notable en una variedad de cánceres. Sin embargo, todavía hay protocolos limitados disponibles para desarrollar DOP de EAC. Una vez que se establecen las DOP, la propagación y la criopreservación son esenciales para futuros análisis posteriores. Aquí, se han estandarizado dos métodos diferentes para el subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC, es decir, con y sin digestión unicelular. Ambos métodos pueden obtener de manera confiable la viabilidad celular adecuada y son aplicables para una configuración experimental diversa. El estudio actual demostró que subcultivar las PDO de EAC con digestión de una sola célula es adecuado para la mayoría de los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y una estructura hueca que facilita el seguimiento del tamaño. Sin embargo, el método basado en una sola célula muestra un crecimiento más lento en el cultivo, así como después del recultivo de las poblaciones congeladas. Además, el subcultivo con digestión unicelular se caracteriza por formar estructuras huecas con un núcleo hueco. Por el contrario, el procesamiento de PDO de CAO sin digestión unicelular es favorable para la criopreservación, la expansión y la caracterización histológica. En este protocolo, se describen las ventajas y desventajas del subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC con y sin digestión unicelular para permitir a los investigadores elegir un método apropiado para procesar e investigar sus organoides.

Este protocolo presenta los procedimientos que incluyen el subcultivo y la criopreservación de las DOP de CAO con y sin digestión unicelular.
La Figura 1 muestra imágenes representativas de contraste de fase de las dos estrategias de subcultura diferentes. Las DOP de CAO alcanzaron la densidad adecuada para el subcultivo (Figura 1, izquierda). El subcultivo sin digestión unicelular tarda menos tiempo en alcanzar una densidad compa...

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Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Este protocolo describe los métodos de subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma de esófago con y sin digestión unicelular para permitir a los investigadores elegir estrategias apropiadas basadas en su diseño experimental.

Subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma esofágico: pros y contras para la digestión unicelular

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Es un protocolo fácil y visualizado que demuestra el manejo de organoides del adenocarcinoma esofágico en dos procesos de subcultivo diferentes con y sin digestión unicelular. El protocolo estandarizado para subcultivar organoides de EAC en dos métodos diferentes puede ayudar a los investigadores a elegir técnicas apropiadas para diferentes aplicaciones posteriores en sus experimentos basados en EAC PDO. Al tratar con las DOP, es esencial prestar atención a los detalles en cada paso.Un POE basado en equipos es crucial para la calidad de los POD. Demostrando el procedimiento estará uno de nuestros estudiantes de doctorado Ning Bo Fan y Lisa Raatz, asistente técnica del laboratorio. Precalentar una placa de 12 pocillos mediante incubación nocturna a 37 grados centígrados utilizando dióxido de carbono.Si está disponible, use pocillos vacíos de una placa con el cultivo de organoides derivado del paciente. Incubar un volumen apropiado de gel ECM durante una hora en hielo para licuar. Coloque la solución de recuperación celular sobre hielo.Retire la placa con PDO en crecimiento de la incubadora. Aspirar medio viejo usando una bomba de vacío. Agregue 500 microlitros por cúpula de solución de recuperación de células heladas en el pozo.Desintegre el gel ECM mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo varias veces para fragmentar las cúpulas de gel ECM en trozos pequeños utilizando puntas de 1.000 microlitros con un orificio ancho. Combine la DOP, el gel ECM y la solución de recuperación celular de un máximo de dos pocillos y transfiéralo a un tubo de unión baja de cinco mililitros. Incuba este tubo en hielo durante 20 minutos.Mezclar cada cinco minutos invirtiendo el tubo. Centrifuga el tubo a una velocidad de 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Si no hay un gránulo visible, retire cuidadosamente el sobrenadante con una bomba de vacío hasta que se alcance la fase que contiene la solución de DOP de gel ECM y agregue tres mililitros de solución de recuperación de células heladas.Invierta el tubo varias veces e incube en hielo durante otros 10 minutos. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante cuidadosamente usando una bomba de vacío o una pipeta de 1.000 microlitros.Trate de quitar el sobrenadante tanto como sea posible. Guarde el pellet de DOP en hielo. Retire las puntas de microlitros 201, 000 preenfriadas con un orificio ancho del congelador de menos 20 grados centígrados y colóquelas en un banco limpio.Calcule 50 microlitros de gel ECM por cúpula planificada para la siembra, más 50 microlitros adicionales. Luego vuelva a suspender el pellet en gel ECM usando una punta de 1, 000 microlitros preenfriada y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces. Retire la placa de 12 pocillos precalentada de la incubadora antes de sembrar las cúpulas.Sembra las cúpulas que contienen 50 microlitros de gel ECM en la placa caliente. Incubar la placa a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos para solidificar el gel ECM. Agregue el medio DOP precalentado con cuidado sin perturbar las cúpulas.Monitoree las PDO sembradas bajo el microscopio. Cultive las DOP durante 7 a 14 días hasta que se produzca la densidad y la morfología requeridas. Prepare el medio de digestión mezclando dos mililitros de TRIPSINA EDTA al 0,25% y 20 microlitros DNAase I para digerir los PDO cosechados de dos pozos.Vuelva a suspender el pellet previamente preparado en un volumen apropiado de tripsina EDTA y DNAasa I precalentados al 0,25% y mézclelo unas 10 veces mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de 1.000 microlitros. Incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora giratoria con una velocidad de rotación de un mínimo de 28 RPM. Prepare un tubo de 15 mililitros que contenga seis mililitros de solución inhibidora de tripsina de soja.Después de la digestión, mezcle los PDO digeridos a fondo varias veces con una pipeta de 1.000 microlitros para interrumpir los DOP. Transfiera los PDO digeridos al tubo de 15 mililitros que contiene la solución de SDI para detener la digestión. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante cuidadosamente usando una bomba de vacío o una pipeta de 1.000 microlitros. Resuspend el pellet en un mililitro de medio basal. Determine la concentración celular y la viabilidad utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro.Calcule el número de células de acuerdo con las cúpulas planificadas para la siembra, más una cúpula adicional, y transfiéralas a un tubo de unión baja fresco de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 1.000 microlitros.Agregue el volumen apropiado de gel ECM al pellet usando una punta de orificio de 1, 000 microlitros de ancho preenfriada. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces. Sembra los PDO digeridos en una placa de 12 pocillos como se demostró anteriormente.Iniciar el proceso de criopreservación de DOP no digeridas con pellet previamente preparado. Utilice 500 microlitros de medio de congelación en frío para resuspendir el pellet de dos cúpulas y transferirlo a un vial criogénico. Congele las DOP durante la noche en el congelador utilizando un recipiente de congelación celular apropiado.Transfiera las PDO congeladas a un congelador de menos 150 grados centígrados. Para la criopreservación de PDO digeridos, transfiera las células a un tubo de unión baja fresco de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta de 1.000 microlitros. Vuelva a suspender el pellet en un medio de congelación de 500 microlitros y transfiéralo a un vial criogénico. Congele los DOP durante la noche en un congelador de menos 80 grados Celsius usando un recipiente de congelación celular apropiado y transfiéralos a un congelador de menos 150 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo.El subcultivo sin digestión unicelular tarda menos tiempo en alcanzar una densidad comparable y conduce principalmente a estructuras compactas. En contraste, las PDO digeridas de una sola célula muestran estructuras con un núcleo hueco. La figura muestra la tinción de eosina de hematoxilina y la tinción inmunohistoquímica de PDO EAC incrustadas en parafina con estructuras compactas y huecas.La pancitoquinatina permite la identificación de células tumorales epiteliales. La citoqueratina 7 resalta las células tumorales diferenciadas glandulares. La estructura compacta existe predominantemente en el cultivo no digerido, mientras que la estructura hueca es dominante en el cultivo que se sometió a la digestión unicelular.El Ki67 destaca las poblaciones celulares con mayor proliferación celular. El Ki67 en rojo y el PanCK en verde se distribuyeron de manera similar entre el tejido primario de EAC, la estructura compacta de EAC PDO y la estructura hueca de EAC PDO. La figura muestra las características morfológicas de las DOP EAC en el primer día de recuperación de la población congelada con criopreservación basada en una sola célula y criopreservación basada en DOP no digerida.Recomendamos hacer un plan de subcultura claro con anticipación. El control de la temperatura y el pipeteo suave son esenciales para el manejo correcto de los geles ECM al subculpir las DOP. Nuestro protocolo proporciona a los investigadores lo sustancial para mantener sus PDO de EAC de acuerdo con el propósito de su estudio para el análisis posterior, como el ensayo de detección de drogas, la citometría de flujo o el análisis histológico.Esperamos que nuestro trabajo pueda ayudar a los investigadores de organoides a tomar decisiones rápidas y fáciles para el almacenamiento y subcultivo de organoides, particularmente para resultados sólidos de materiales derivados de pacientes en investigación traslacional.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Trasplante ortotópico de células de Adenocarcinoma de pulmón Syngeneic para estudiar la expresión de PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Establecimiento y caracterización de tres afatinas pulmonares resistentes a Afatinib PC-9 Líneas celulares desarrolladas con dosis crecientes de Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modelado del carcinoma de células escamosas oral-esofágico en organoides 3D

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Análisis multiómico de TMEM200A como biomarcador pancancerígeno

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...