Name: subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion
Uploaded: 2022-07-06T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Köln Fortune Program / Medicinska fakulteten, Kölns universitet. Vi tackar den tekniska hjälpen från Susanne Neiss, Michaela Heitmann och Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo stöddes ekonomiskt av Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Författarna tackar Dr. Joshua D'Rozario för hans hjälp med språklig redigering.

En etablerad och välväxande SUB-kultur utgör grunden för en framgångsrik subkultur och kryokonservering som beskrivs i detta protokoll. Här genererades EAC-PDO: er från EAC-patienternas primära tumörvävnad med hjälp av protokollet som beskrivs av Karakasheva T. A. et al17. EAC-vävnader samlades in från biobanken under godkännande av BioMaSOTA (godkänd av etikkommittén vid Kölns universitet, ID: 13-091).
OBS: EAC-SUB har odlats i en fuktad inkubator vid ...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">The epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).</li><li>Rumgay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trends+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+incidence.">International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence.</a> The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).</li><li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+characteristics,+prognosis,+and+nomogram+for+esophageal+cancer+based+on+adenosquamous+carcinoma:+a+seer+database+analysis.">Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).</li><li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oesophageal+cancer.">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li><li>Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+newly+established+oesophageal+carcinoma+cell+lines:+phenotypic+and+immunological+characterization.">Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization.</a> British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).</li><li>Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+COX2+and+p53+in+rat+esophageal+cancer+induced+by+reflux+of+duodenal+contents.">Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents.</a> ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+and+inflammation+activate+gastric+cardia+stem+cells+in+a+mouse+model+of+barrett-like+metaplasia.">Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia.</a> Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).</li><li>Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Barrett's+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma-past,+present,+and+future.">Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future.</a> Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).</li><li>Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft:+a+developing+tool+for+screening+biomarkers+and+potential+therapeutic+targets+for+human+esophageal+cancers.">Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers.</a> Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).</li><li>Liu, D. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APR-246+potently+inhibits+tumour+growth+and+overcomes+chemoresistance+in+preclinical+models+of+oesophageal+adenocarcinoma.">APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma.</a> Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+adenocarcinoma+cells+and+xenograft+tumors+exposed+to+Erb-b2+receptor+tyrosine+kinase+2+and+3+inhibitors+activate+transforming+growth+factor+beta+signaling,+which+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition.</a> Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+recapitulate+esophageal+adenocarcinoma+heterogeneity+providing+a+model+for+clonality+studies+and+precision+therapeutics.">Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics.</a> Nature Communications. 9, 2983 (2018).</li><li>Ebbing, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-derived+interleukin+6+drives+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+therapy+resistance+in+esophageal+adenocarcinoma.">Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Ord&#243;&#241;ez, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+immunohistochemical+epithelial+markers:+a+review.">Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review.</a> Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).</li><li>Maniar, K. P., Umpires, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin+7+(CK7,+K7).">Cytokeratin 7 (CK7, K7).</a> Pathology Outlines.com website. , (2021).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li></ol>

I detta protokoll beskrivs två olika subkultur- och kryokonserveringsmetoder för EAC-SUB, dvs med och utan encellsförtunning. Flera studier rekommenderade passerande EAC-PDO: er med encellsförtunning15,17, vilket är fördelaktigt för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden kännetecknas emellertid av långsammare tillväxt efter reodling ...

Matstrupscancer (EC) är den tionde vanligaste och den sjätte vanligaste dödsorsaken i cancer världen över1. Esofagusadenokarcinom (EAC) är en av de viktigaste histologiska subtyperna av EC och förekommer främst i västländer2. Under det senaste decenniet har EAC-förekomsten ökat avsevärt i många utvecklade länder, inklusive Tyskland3. På grund av cancerns aggressivitet och bristen på symtom under det tidiga skedet av tumörutveckling är den totala prognosen hos EAC-patienter dålig, vilket visar en 5-årig överlevnad på cirka 20%2,4,5.
Sedan slutet av 1900-talet har flera modeller etablerats för EAC: s biomedicinska forskning. De klassiska humana EAC-cellinjerna som etablerades på 1990-talet6, utökar vår kunskap om EAC-tumörbiologi, tumörgenetik samt antitumörstrategier och används ofta i EAC-forskning. Dessutom har vissa forskargrupper framgångsrikt utvecklat djurmodeller av EAC eller Barretts matstrupe genom att utsätta djuren för kända riskfaktorer som gastroesofageal reflux genom kirurgiska eller inflammatoriska tillvägagångssätt 7,8,9. Dessutom utvecklades patienthärledda xenograftmodeller (PDX) som inympa EAC primära cancervävnader subkutant eller ortopiskt till immunbristfälliga möss för att simulera humant EAC-tumörbiologiskt beteende och tumörmiljö 10,11,12. Trots att dessa modeller förbättrar kliniska tillämpningar och vår förståelse av molekylära mekanismer bakom EAC-tumörigenes och progression, finns det fortfarande en stor utmaning att extrapolera resultat från dessa forskningsmodeller till människor.
Patient-härledda tumörorganoider (PDO) odlas i ett 3D-odlingssystem som efterliknar mänsklig utveckling och organregenerering in vitro. PDOs, som genereras från patienternas primära vävnad, rekapitulerar de molekylära och fenotypiska egenskaperna hos den humana tumören och har visat lovande tillämpningar inom läkemedelsutveckling och personlig cancerbehandling13,14. Genom att jämföra tio fall av EAC-SUB med deras parade tumörvävnad rapporteras EAC-SUB dela liknande histopatologiska egenskaper och genomiska landskap med primärtumören, behålla heterogeniteten inom tumören och underlätta effektiv läkemedelsscreening in vitro15. EAC-PDO användes också för att studera interaktionen mellan EAC-tumörceller och patient-härledda cancerassocierade fibroblaster (CAF), vilket indikerar en kraftfull tillämpning inom tumörmikromiljöforskning16. Tyvärr har det funnits begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla och sprida EAC-SUB. Här beskrivs två olika metoder för att subkulturera och bevara EAC-SUB i detalj: med och utan encellsförtunning. De standardiserade metoderna för underhåll av EAC-SUB och deras tillämpningar kan stödja forskare att välja lämpliga metoder för olika ändamål i sin EAC SUB-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Freezer</td>
			<td>Bosch</td>
			<td></td>
			<td>Economic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Freezer</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>MDF DU500VH-PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51022482</td>
			<td>Herasafe KS12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>75003060</td>
			<td>Megafuge 1.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td>Heracell 150i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted automated fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DMIL LED Fluo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Research Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Incubator</td>
			<td>Scientific Industries, sc.</td>
			<td>SI-1200</td>
			<td>Enviro-genie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>20727200</td>
			<td>BVC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Medingen</td>
			<td>p2725</td>
			<td>W22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Inc&#160;Screw cap tube PP 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vial 2 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379</td>
			<td>CryoPure 2.0 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.600</td>
			<td>Micro tube 1.5 mL protein LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low bind tube 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.302</td>
			<td>Protein LoBind Tube 5.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-8000</td>
			<td>200 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1011-9000</td>
			<td>1000 &#181;L Graduated tip, wide orifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.3050</td>
			<td>Pipette tip 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Filtropur 0.2 &#181;m sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3921</td>
			<td>12 well-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182/CS-0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin-25 (25 mg/ 500 &#181;L)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-36030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells</td>
			<td>Biotechne</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>152121-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93620-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3A conditioned medium</td>
			<td>Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers&#39; group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subculture and cryopreservation of esophageal adenocarcinoma organoids: pros and cons for single cell digestion

Bristen på lämpliga translationella forskningsmodeller som återspeglar primär sjukdom för att utforska tumorigenes och terapeutiska strategier är ett stort hinder i matstrupen adenokarcinom (EAC). Patient-härledda organoider (PDO) har nyligen framträtt som en anmärkningsvärd preklinisk modell i en mängd olika cancerformer. Det finns dock fortfarande begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla EAC PDOs. När underofficerarna har fastställts är förökning och kryokonservering avgörande för ytterligare analyser nedströms. Här har två olika metoder standardiserats för EAC PDOs subkultur och kryokonservering, dvs med och utan encellsförtunning. Båda metoderna kan på ett tillförlitligt sätt erhålla lämplig cellviabilitet och är tillämpliga för en mångsidig experimentell inställning. Den aktuella studien visade att subkulturerande EAC-SUB med encellsförtunning är lämplig för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden visar dock långsammare tillväxt i odling såväl som efter återodling från frysta lager. Dessutom kännetecknas subkulturering med encellsförtunning genom att bilda ihåliga strukturer med en ihålig kärna. Däremot är bearbetning av EAC-SUB utan encellsförtunning gynnsam för kryokonservering, expansion och histologisk karakterisering. I detta protokoll beskrivs fördelarna och nackdelarna med subkulturering och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja en lämplig metod för att bearbeta och undersöka sina organoider.

Detta protokoll presenterar förfarandena inklusive subkultur och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning.
Figur 1 visar representativa faskontrastbilder av de två olika subkulturstrategierna. EAC PDOs nådde lämplig densitet för subkulturering (figur 1, vänster). Subkulturering utan encellsförtunning tar mindre tid att nå jämförbar densitet och leder huvudsakligen till kompakta strukturer (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion at JoVE.com

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Detta protokoll beskriver metoderna för subkultur och kryokonservering av esofageal adenokarcinomorganoider med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja lämpliga strategier baserat på deras experimentella design.

Subkultur och kryokonservering av esofagusadenokarcinomorganoider: Fördelar och nackdelar för encellsförtunning

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Det är ett enkelt och visualiserat protokoll som visar hantering av esofageal adenokarcinomorganoider i två olika subkulturprocesser med och utan encellig matsmältning. Det standardiserade protokollet för subkulturering av EAC-organoider i två olika metoder kan stödja forskare i att välja lämpliga tekniker för olika nedströms applikationer i sina EAC SUB-baserade experiment. När du hanterar HANDDATOR: er är det viktigt att vara uppmärksam på detaljerna i varje steg.En teambaserad SOP är avgörande för kvaliteten på PODs. Demonstrerar proceduren gör en av våra doktorander Ning Bo och Lisa Raatz, laboratoriets teknikassistent. Förvärm en 12-brunnsplatta genom inkubation över natten vid 37 grader Celsius med koldioxid.Om tillgängligt, använd tomma brunnar från en tallrik med den patienthärledda organoidkulturen. Inkubera en lämplig volym ECM-gel i en timme på is för att kondensera. Placera cellåtervinningslösning på is.Ta bort plattan med växande PDF-filer från inkubatorn. Aspirera gammalt medium med en vakuumpump. Tillsätt 500 mikroliter per kupol av iskall cellåtervinningslösning i brunnen.Sönderdela ECM-gelén genom att pipettera upp och ner flera gånger för att fragmentera ECM-gelkupoler i små bitar med 1000 mikroliterspetsar med en bred öppning. Kombinera SUB, ECM-gel och cellåtervinningslösning från högst två brunnar och överför den till ett fem milliliter lågt bindande rör. Inkubera detta rör på is i 20 minuter.Blanda var femte minut genom att invertera röret. Centrifugera röret med en hastighet av 500 gånger G i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Om det inte finns någon synlig pellets, ta försiktigt bort supernatanten med en vakuumpump tills fasen som innehåller ECM gel SUB-lösning har uppnåtts och tillsätt tre milliliter iskall cellåtervinningslösning.Invertera röret några gånger och inkubera på is i ytterligare 10 minuter. Centrifug vid 500 gånger G i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten försiktigt med en vakuumpump eller en 1000 mikroliter pipett.Försök att ta bort supernatanten så mycket som möjligt. Förvara SUB-pelletsen på is. Ta bort förkylda 201 000 mikroliterspetsar med en bred öppning från frysen minus 20 grader Celsius och lägg dem på en ren bänk.Beräkna 50 mikroliter ECM-gel per kupol som planeras för sådd, plus 50 mikroliter extra. Använd sedan pelletsen i ECM-gel med en förkyld 1000 mikroliterspets och blanda genom att pipettera upp och ner cirka 10 gånger. Ta bort den förvärmda 12-brunnsplattan från inkubatorn innan du såddar kupolerna.Frö kupolerna som innehåller 50 mikroliter ECM-gel i den varma plattan. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 20 till 30 minuter för att stelna ECM-gelén. Tillsätt försiktigt förvärmt SUB-medium utan att störa kupolerna.Övervaka seedade PDO:er under mikroskopet. Odla UNDERDO: erna i 7 till 14 dagar tills den erforderliga densiteten och morfologin uppträder. Förbered matsmältningsmediet genom att blanda två milliliter 0,25% trypsin EDTA och 20 mikroliter DNAase I för att smälta PDO: er skördade från två brunnar.Resuspend den tidigare beredda pelleten i en lämplig volym av förvärmd 0,25% trypsin EDTA och DNAase I och blanda den cirka 10 gånger genom pipettering upp och ner med en 1000 mikroliter pipett. Inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius i en roterande inkubator med en rotationshastighet på minst 28 varv / min. Förbered ett 15 ml rör innehållande sex milliliter sojabönor trypsinhämmarlösning.Efter matsmältningen, blanda de smälta PDO: erna noggrant några gånger med en 1000 mikroliter pipett för att störa UNDERDO: erna. Överför de smälta PDO: erna till 15 ml rör som innehåller SDI-lösning för att stoppa matsmältningen. Centrifug vid 500 gånger G i fyra minuter vid fyra grader Celsius.Kassera supernatanten försiktigt med en vakuumpump eller en 1000 mikroliter pipett. Resuspend pelletsen i en milliliter basal medium. Bestäm cellkoncentration och livskraft med hjälp av en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer.Beräkna cellnumret enligt de kupoler som planeras för sådd, plus en kupol extra, och överför dem till ett nytt 1,5 ml lågbindande rör. Centrifug vid 500 gånger G i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Kassera försiktigt supernatanten med en 1000 mikroliter pipett.Tillsätt lämplig volym ECM-gel till pelletsen med en förkyld 1000 mikroliter bred öppningsspets. Blanda genom att pipettera upp och ner cirka 10 gånger. Frö de smälta PDO: erna i en 12-brunnsplatta som visats tidigare.Starta kryokonserveringsprocessen för osmälta PPO: er med tidigare beredd pellets. Använd 500 mikroliter kallt frysmedium för att återanvända pelletsen från två kupoler och överföra den till en kryogen injektionsflaska. Frys PPO: er över natten i frysen med en lämplig cellfrysbehållare.Överför de frysta HANDdatorerna till en frys på minus 150 grader Celsius. För kryokonservering av smälta PPO: er, överför celler till ett nytt 1,5 ml lågt bindningsrör. Centrifug vid 500 gånger G i fyra minuter vid fyra grader Celsius.Kassera supernatanten försiktigt med en 1000 mikroliter pipett. Resuspend pelletsen i 500 mikroliter frysmedium och överför den till en kryogen injektionsflaska. Frys PDO: er över natten i en minus 80 grader Celsius frys med en lämplig cellfrysbehållare och överför dem till en minus 150 grader Celsius frys för långvarig lagring.Subkulturering utan encellig matsmältning tar mindre tid att nå jämförbar densitet och leder huvudsakligen till kompakta strukturer. Däremot visar de encelliga smälta PPO: erna strukturer med en ihålig kärna. Figuren visar hematoxylin eosinfärgning och immunohistokemifärgning av paraffininbäddade EAC-PDO med kompakta och ihåliga strukturer.Pancytokeratin möjliggör identifiering av epiteliala tumörceller. Cytokeratinet 7 belyser de glandulära differentierade tumörcellerna. Den kompakta strukturen existerar övervägande i den osmälta kulturen, medan den ihåliga strukturen är dominerande i kulturen som genomgick encellig matsmältning.Ki67 belyser cellpopulationerna med högre cellulär proliferation. Ki67 i rött och PanCK i grönt fördelades på liknande sätt mellan EAC primär vävnad, EAC SUB kompakt struktur och EAC SUB ihålig struktur. Figuren visar morfologiska egenskaper hos EAC-SUB på den första dagen av återhämtning från frysta bestånd med encellsbaserad kryokonservering och osmält SUB-baserad kryokonservering.Vi rekommenderar att du gör en tydlig subkulturplan i förväg. Temperaturkontroll och skonsam pipettering är avgörande för korrekt hantering av ECM-geler vid subkulturering av SUB-subkulturering av SUB. Vårt protokoll ger forskare det väsentliga för att behålla sina EAC-SUB: er enligt deras studiesyfte för nedströmsanalys, såsom läkemedelsscreeninganalys, flödescytometri eller histologisk analys.Vi hoppas att vårt arbete kan hjälpa organoidforskare att fatta snabba och enkla beslut för lagring och subkultur av organoider, särskilt för robusta resultat av patienthärledda material i translationell forskning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotop Transplantation av syngena lunga adenokarcinom celler att studera PD-L1-uttryck

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flödescytometri med fluorescerande Cell streckkodning för enstaka Cell signalering analys och biomarkör identifiering

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering och karakterisering av tre afatinib-resistenta lung adenocarcinom PC-9 cellinjer som utvecklats med ökande doser av afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proximala vätskor för att undersöka tumörmikromiljön i bukspottskörtelns adenokarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generera och avbilda mus- och humana epitelorganoider från normal och tumörbröstvävnad utan att passera

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellering av oral-esofageal skivepitelcancer i 3D-organoider

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties (Video) | JoVE 

Skjuvanalysprotokoll för bestämning av encelliga materialegenskaper

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics-analys av TMEM200A som en pan-cancerbiomarkör

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...