Name: characterization of blood outgrowth endothelial cells (boec) from porcine peripheral blood
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00
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Les auteurs souhaitent remercier le financement du NIH/NHLBI R00 HL129068.

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par les comités institutionnels respectifs de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Medical College of Wisconsin et de la Mayo Clinic.
NOTE: Dans cette étude, des porcs domestiques croisés Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), mâles et femelles, âgés de 40 à 80 kg, âgés de 3 à 6 mois, ont été utilisés.
1. Prélèvement de sang périphérique porcin
<ol><li...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+I.+Structure,+function,+and+mechanisms.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).</li><li>Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+blood+vessel+cells+in+human+adaptive+immune+responses.">Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses.</a> Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).</li><li>Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+protein+C+receptor:+its+role+in+thrombosis.">The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis.</a> Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).</li><li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+1:+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis.">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li><li>Ormiston, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+blood+outgrowth+endothelial+cells+from+human+peripheral+blood.">Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).</li><li>Gulati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+origin+and+function+of+cells+with+endothelial+phenotype+obtained+from+adult+human+blood.">Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.</a> Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).</li><li>Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+endothelial+cells:+utility+from+ambiguity.">Blood endothelial cells: utility from ambiguity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).</li><li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitors:+A+consensus+statement+on+nomenclature.">Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).</li><li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+endothelial+progenitor+cell+(EPC)+subtypes+reveals+two+distinct+cell+populations+with+different+identities.">Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities.</a> BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).</li><li>Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+question+based+on+cross-platform+microarray+data+normalization:+are+BOEC+more+like+large+vessel+or+microvascular+endothelial+cells+or+neither+of+them.">A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them.</a> Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).</li><li>Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-supervised+learning+via+penalized+mixture+model+with+application+to+microarray+sample+classification.">Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification.</a> Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).</li><li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+identity,+phenotype,+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells.">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li><li>Fernandez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cells+from+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia+patients+reveal+abnormalities+compatible+with+vascular+lesions.">Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions.</a> Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).</li><li>Critser, P. J., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony-forming+cell+role+in+neoangiogenesis+and+tissue+repair.">Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+aortic+endothelial+cells+from+miniature+pigs.">Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).</li><li>Chang Milbauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+endothelial+systems+biology+of+sickle+stroke+risk.">Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk.</a> Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+endothelial+cell+gene+expression+by+African+Americans+versusCaucasian+Americans:+a+possible+contribution+to+health+disparity+in+vascular+disease+and+cancer.">Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer.</a> BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).</li><li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+1:+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis.">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li><li>Milbauer, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cell+migration+and+trapping+in+vivo:+a+window+into+gene+therapy.">Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy.</a> Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).</li><li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+gene+therapy+for+hemophilia+A+that+enhances+safe+delivery+and+sustained+in+vivo+factor+VIII+expression+from+lentivirally+engineered+endothelial+progenitors.">Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors.</a> Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).</li><li>De Meyer, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+correction+of+von+Willebrand+disease+type+3+blood-derived+endothelial+cells+with+lentiviral+vectors+expressing+von+Willebrand+factor.">Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor.</a> Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).</li><li>Bodempudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cell-based+systemic+delivery+of+antiangiogenic+gene+therapy+for+solid+tumors.">Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors.</a> Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).</li><li>Dudek, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inhibition+of+tumour+angiogenesis+by+endothelial+cell-based+gene+therapy.">Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy.</a> British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).</li><li>Moubarik, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+as+cell+therapy+product+for+stroke.">Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).</li><li>Pislaru Sorin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts.">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1), 314 (2006).</li><li>Satyananda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+of+immune+modulation+in+xenotransplantation.">New concepts of immune modulation in xenotransplantation.</a> Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+pigs+as+organ+donors+for+xenotransplantation.">Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).</li><li>Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipi&#324;ski, D., S&#322;omski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+technology+in+pig-to-human+xenotransplantation+research.">CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).</li><li>Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+pigs.">Genetically engineered pigs.</a> Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).</li><li>Cozzi, E., White, D. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+transgenic+pigs+as+potential+organ+donors+for+humans.">The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans.</a> Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).</li><li>Phelps, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+alpha+1,3-galactosyltransferase-deficient+pigs.">Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs.</a> Science. 299 (5605), 411-414 (2003).</li></ol>

Les BOEC sont un outil puissant qui peut être utilisé dans diverses approches scientifiques et thérapeutiques 7,8,16. Les BOEC ont été utilisés pour analyser l’expression des gènes EC afin d’élucider les facteurs clés responsables du développement des maladies vasculaires et du cancer 5,19,20,21.<sup class="xref...

L’endothélium est une structure dynamique très complexe et un composant vital de la paroi vasculaire. Il tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins pour fournir une interface physique entre le sang circulant et les tissus environnants. Cette structure hétérogène est connue pour remplir diverses fonctions telles que l’angiogenèse, l’inflammation, la vasorégulation et l’hémostase 1,2,3,4. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine sont un type de cellule largement étudié pour évaluer la fonctionnalité des cellules endothéliales. Cependant, la variabilité des lots spécifique au patient, le phénotype incohérent et l’efficacité minimale de fractionnement suggèrent la nécessité de déterminer une source cellulaire qui pourrait améliorer toutes ces caractéristiques5.
L’obtention d’une population homogène de cellules endothéliales primaires peut être techniquement difficile, et les cellules endothéliales primaires ne possèdent pas une capacité proliférative élevée6. Par conséquent, pour étudier la régénération vasculaire et évaluer les processus physiopathologiques, divers groupes ont tenté d’obtenir et d’évaluer différents types de cellules endothéliales dérivées du sang périphérique, par exemple les cellules progénitrices endothéliales (CPE) ou les cellules endothéliales à excroissance sanguine (BOEC)6,7,8,9 . Les premiers CPE en forme de fuseau proviennent de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et ont un pouvoir de croissance limité et une capacité angiogénique limitée à produire des cellules endothéliales matures. De plus, ils ressemblent beaucoup aux monocytes inflammatoires. De plus, leur capacité à se différencier davantage en cellules endothéliales fonctionnelles, proliférantes et matures est encore discutable 6,7,9,10. La culture continue de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) peut donner naissance à une population secondaire de cellules appelées EPC à croissance tardive, BOEC ou cellules endothéliales formant colonies (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, ont reconnu les limites des CPE, l’ambiguïté de leur nomenclature, ainsi qu’un manque général de concordance avec de nombreux types de cellules distinctes continuellement regroupés sous EPC11. En revanche, les BOEC sont reconnus pour leur rôle dans la réparation vasculaire, la santé et la maladie, et la thérapie cellulaire. D’autres études et l’utilisation thérapeutique de ces cellules reposeront sur des protocoles visant à dériver systématiquement ces types de cellules à partir de cellules progénitrices circulantes.
Les cellules primaires telles que les BOEC peuvent être utilisées comme substitut pour obtenir des cellules endothéliales matures hautement prolifératives6. Les BOEC sont phénotypiquement distinctes des premiers EPC et présentent des caractéristiques endothéliales typiques telles que la morphologie pavée et l’expression des jonctions adhérentes et des cavéoles12. Le profilage génétique par Hebbel et al.13,14,15 a révélé que les BOEC ou ECFC sont les véritables cellules endothéliales car elles favorisent la formation de microvasculaires et de gros vaisseaux. Ainsi, les BOEC peuvent être utilisés comme un outil pour évaluer les processus physiopathologiques et la variation génétique16. Ils sont également considérés comme une excellente source cellulaire pour la thérapie cellulaire pour la régénération vasculaire17. Par conséquent, un protocole standardisé pour dériver de manière cohérente ces cellules hautement prolifératives est essentiel.
Alors que les BOEC fournissent un outil puissant pour étudier les variations physiopathologiques et génétiques humaines, une source plus homogène de BOEC peut fournir des résultats expérimentaux et thérapeutiques plus robustes et fiables. Une homogénéité supérieure peut être obtenue en utilisant des sources de cellules xénogéniques dérivées d’animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires18. Alors que les sources de cellules xénogéniques sont susceptibles de provoquer une réponse immunitaire de l’hôte, des stratégies d’immunomodulation sont en cours d’élaboration dans le but de générer des animaux et des produits animaux immunocompatibles, y compris des cellules. Les porcs, en particulier, sont une source abondante de sang périphérique et sont couramment utilisés pour étudier les dispositifs médicaux et autres thérapies en raison de similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Par conséquent, cette étude affine le protocole pour l’isolement et l’expansion des BOEC hautement prolifératifs à partir du sang périphérique porcin. Le protocole détaillé ci-dessous est une méthode simple et fiable pour obtenir un grand nombre de BOEC à partir d’un volume de sang relativement faible. Les cultures peuvent être étendues à travers plusieurs passages pour générer des millions de cellules à partir d’un seul échantillon de sang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188818112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringes</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881560125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride solution (0.8%)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-253-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 culture medium</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td>
			<td>03382C6227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>F-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque 1077</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection (1,000 units/mL)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00069-0058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin pipette</td>
			<td>Celltreat Scientific</td>
			<td>229280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of blood outgrowth endothelial cells (boec) from porcine peripheral blood

L’endothélium est une structure intégrée dynamique qui joue un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que l’angiogenèse, l’hémostase, l’inflammation et l’homéostasie. L’endothélium joue également un rôle important dans les physiopathologies telles que l’athérosclérose, l’hypertension et le diabète. Les cellules endothéliales forment la paroi interne des vaisseaux sanguins et lymphatiques et présentent une hétérogénéité dans la structure et la fonction. Divers groupes ont évalué la fonctionnalité des cellules endothéliales dérivées du sang périphérique humain en mettant l’accent sur les cellules progénitrices endothéliales dérivées de cellules souches hématopoïétiques ou de cellules endothéliales à excroissance sanguine mature (ou cellules formant des colonies endothéliales). Ces cellules fournissent une ressource autologue pour la thérapeutique et la modélisation des maladies. Les cellules xénogéniques peuvent constituer une autre source thérapeutique en raison de leur disponibilité et de leur homogénéité obtenues en utilisant des animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires. Par conséquent, un protocole robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules endothéliales de croissance sanguine hautement proliférative à partir du sang périphérique porcin a été présenté. Ces cellules peuvent être utilisées pour de nombreuses applications telles que l’ingénierie tissulaire cardiovasculaire, la thérapie cellulaire, la modélisation de maladies, le criblage de médicaments, l’étude de la biologie cellulaire endothéliale et les co-cultures in vitro pour étudier les réponses inflammatoires et de coagulation dans la xénotransplantation.

La morphologie des cellules cultivées a été observée depuis le début de la culture jusqu’à ce que les colonies de BOEC soient observées (figure 1). Une plus petite population de cellules adhérentes a commencé à se fixer aux boîtes de culture et à se développer, tandis que les cellules non adhérentes ont été éliminées avec des changements de milieu de culture (Figure 1B). Les colonies sont apparues pour la première fois le jour 6 sous la form...

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Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Le protocole fournit des cellules endothéliales à excroissance sanguine hautement prolifératives qui peuvent être utilisées pour diverses études d’ingénierie tissulaire, de thérapie cellulaire et de modélisation des maladies. Cette technique produit systématiquement de nombreuses cellules à partir d’une seule prise de sang. Pour que cette technique réussisse, il est crucial d’introduire rapidement les cellules dans le milieu de culture et l’environnement de l’incubateur dès que possible.Tout d’abord, diluer la solution d’héparine à 100 unités par millilitre dans une solution saline stérile. Ajouter trois à quatre millilitres de solution d’héparine à chacun des deux tubes coniques de 50 millilitres et des deux seringues de 60 millilitres. Ensuite, aspirez 1 000 unités non diluées par millilitre de solution d’héparine dans un tube d’extension.Connectez une aiguille de calibre 19 à une extrémité du tube d’extension rempli d’héparine et une seringue de 60 millilitres contenant de l’héparine à l’autre extrémité du tube d’extension. Ensuite, nettoyez la région fémorale de l’aine d’un porc anesthésié avec une solution de gommage à la bétadine. Percez la veine fémorale ou l’artère avec une aiguille de calibre 19 et à un à deux millilitres par seconde, aspirez lentement 50 millilitres de sang dans la seringue.En laissant l’aiguille en place, pliez immédiatement le tube d’extension et débranchez la seringue de 60 millilitres. Transférer lentement le sang dans un tube conique de 50 millilitres contenant de l’héparine. Fermez hermétiquement le tube conique, inversez doucement le tube plusieurs fois pour mélanger et placez-le sur de la glace.Connectez la seringue restante de 60 millilitres contenant de l’héparine au tube d’extension. Dépliez le tube d’extension et aspirez lentement 50 millilitres de sang supplémentaire dans la seringue. Retirez immédiatement l’aiguille de l’artère ou de la veine et aspirez lentement le sang restant du tube d’extension dans la seringue.Débranchez la seringue de 60 millilitres du tube d’extension et transférez lentement le sang dans le tube conique de 50 millilitres contenant de l’héparine restante. Fermez hermétiquement le tube conique de 50 millilitres, retournez doucement plusieurs fois pour mélanger et placez-le sur la glace. Appliquez l’hémostase de pression sur la région fémorale de l’aine du porc.Diluer le sang un à un avec du PBS dans quatre tubes coniques de 50 millilitres. Ajouter 25 millilitres de solution de gradient de densité prête à l’emploi à température ambiante à huit tubes coniques de 50 millilitres. Pipeter lentement 25 millilitres de solution saline sanguine à l’intérieur de chaque tube conique de 50 millilitres contenant une solution de gradient de densité en tenant le tube à un angle aigu par rapport à l’extrémité de la pipette.Centrifuger les tubes pendant 30 minutes à 560 g et à température ambiante. Prélevez soigneusement la couche leucocytaire, qui est la couche trouble de cellules mononucléaires au-dessus de la solution à gradient de densité et sous le plasma clair, de chaque tube avec une pipette mince et répartissez-la uniformément dans deux nouveaux tubes coniques de 50 millilitres. Jeter la solution de gradient de densité contenant les tubes.Pour enduire une plaque à six puits de fibronectine, préparez une solution mère de fibronectine plasmatique humaine en la diluant à un milligramme par millilitre dans de l’eau stérile. Faire 3,6 millilitres d’une solution de travail de fibronectine en diluant 600 microlitres de solution mère de fibronectine dans trois millilitres de PBS. Transférer 600 microlitres de la solution de travail à base de fibronectine dans chaque puits d’une plaque de six puits et rocher doucement jusqu’à ce qu’il soit uniformément enduit.Et aspirez doucement la solution de chaque puits. Pour laver les cellules mononucléaires en attendant que la fibronectine soit enrobée, remplissez les tubes avec jusqu’à 45 millilitres de PBS, centrifugez pendant cinq minutes à 560 X g et quatre degrés Celsius avec une rupture basse. Aspirer le surnageant des deux tubes.Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 25 millilitres de PBS. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans cinq millilitres de PBS et ajoutez 15 millilitres de solution de chlorure d’ammonium à 0,8% dans chaque tube. Lavez les cellules comme avant en ajoutant du PBS.Aspirer le surnageant des deux tubes. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 25 millilitres de PBS. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans six millilitres de milieu de culture EGM-2 complété par 10% FBS et 1X solution antibiotique-antimycotique.Transférer doucement deux millilitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à six puits recouverte de fibronectine et secouer doucement jusqu’à ce qu’elle soit uniformément recouverte. 24 heures après l’ensemencement des cellules, ajouter doucement un millilitre de milieu de culture frais à chaque puits. Le lendemain, aspirez doucement 1,5 millilitre de milieu de culture de chaque puits et remplacez-le par 1,5 millilitre de milieu de culture frais.Pendant les cinq prochains jours, changez doucement le milieu de culture avec deux millilitres de milieu de culture frais par puits. Visualisez régulièrement les cultures cellulaires sous microscopie optique objective 4X de faible puissance. La morphologie des cellules cultivées a été observée depuis le début de la culture jusqu’à ce que les colonies BOEC soient observées.Une plus petite population de cellules adhérentes a commencé à se fixer aux boîtes de culture et à se développer, tandis que les cellules non adhérentes ont été retirées avec des changements de milieu de culture. Les colonies sont apparues pour la première fois le sixième jour sous la forme d’une collection de cellules de type endothélial, proliférant radialement vers l’extérieur à partir d’un point central. Au fur et à mesure que la culture progressait, les colonies cellulaires devenaient plus denses et présentaient une morphologie pavée similaire à celle des cellules endothéliales matures.La microscopie à contraste de phase bidimensionnel a été utilisée pour imager la formation de tubes dans un milieu sans sérum et un milieu de croissance complet. Les cellules des deux milieux ont subi une différenciation morphologique et se sont rapidement organisées en vastes réseaux de structures capillaires en forme de tube. Les BOEC ont en outre été caractérisés par l’expression du marqueur de cellules endothéliales matures CD31 ou de la molécule d’adhésion plaquettaire des cellules endothéliales un.Les BOEC ont montré une expression uniforme de CD31. De plus, l’analyse par cytométrie en flux des BOEC avec anticorps CD14 AF 700 par rapport au groupe témoin positif a confirmé l’absence de CPE, car la cellule était colorée négativement pour le marqueur monocytaire CD14 par rapport au groupe témoin positif des PBMC. Coloration CD14 positive en bleu et cellules non colorées en rouge.Lors de la collecte de sang, il est essentiel de recueillir autant de couche de pelage leucocytaire que possible tout en recueillant le moins possible des couches adjacentes. Cette technique a permis aux chercheurs d’étudier de nouvelles stratégies d’endothélialisation de dispositifs cardiovasculaires implantables à l’aide d’un modèle porcin avec des cellules endothéliales autologues à excroissance sanguine.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Recherche

Bio-ingénierie

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d&#39;échantillons sanguins des patients

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Cathéter de lumière à tir latéral intra-cardiaque pour la surveillance du métabolisme cellulaire à l'aide de la spectroscopie d'absorption transmurale des cœurs de mammifères perfusés

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imagerie du flux sanguin avec Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...