Name: characterization of blood outgrowth endothelial cells (boec) from porcine peripheral blood
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood at JoVE.com

המחברים מבקשים להכיר במימון מ-NIH/NHLBI R00 HL129068.

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בהתאמה במכללה הרפואית של ויסקונסין ומאיו קליניק.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בחזירי בית יורקשייר/לנדרייס/דורוק (Sus domesticus), זכר ונקבה, 40-80 ק"ג, בני 3-6 חודשים.
1. איסוף דם היקפי ח...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+I.+Structure,+function,+and+mechanisms.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).</li><li>Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+blood+vessel+cells+in+human+adaptive+immune+responses.">Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses.</a> Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).</li><li>Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+protein+C+receptor:+its+role+in+thrombosis.">The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis.</a> Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).</li><li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+1:+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis.">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li><li>Ormiston, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+blood+outgrowth+endothelial+cells+from+human+peripheral+blood.">Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).</li><li>Gulati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+origin+and+function+of+cells+with+endothelial+phenotype+obtained+from+adult+human+blood.">Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.</a> Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).</li><li>Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+endothelial+cells:+utility+from+ambiguity.">Blood endothelial cells: utility from ambiguity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).</li><li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitors:+A+consensus+statement+on+nomenclature.">Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).</li><li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+endothelial+progenitor+cell+(EPC)+subtypes+reveals+two+distinct+cell+populations+with+different+identities.">Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities.</a> BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).</li><li>Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+question+based+on+cross-platform+microarray+data+normalization:+are+BOEC+more+like+large+vessel+or+microvascular+endothelial+cells+or+neither+of+them.">A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them.</a> Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).</li><li>Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-supervised+learning+via+penalized+mixture+model+with+application+to+microarray+sample+classification.">Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification.</a> Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).</li><li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+identity,+phenotype,+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells.">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li><li>Fernandez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cells+from+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia+patients+reveal+abnormalities+compatible+with+vascular+lesions.">Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions.</a> Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).</li><li>Critser, P. J., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony-forming+cell+role+in+neoangiogenesis+and+tissue+repair.">Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+aortic+endothelial+cells+from+miniature+pigs.">Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).</li><li>Chang Milbauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+endothelial+systems+biology+of+sickle+stroke+risk.">Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk.</a> Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+endothelial+cell+gene+expression+by+African+Americans+versusCaucasian+Americans:+a+possible+contribution+to+health+disparity+in+vascular+disease+and+cancer.">Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer.</a> BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).</li><li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+1:+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis.">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li><li>Milbauer, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cell+migration+and+trapping+in+vivo:+a+window+into+gene+therapy.">Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy.</a> Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).</li><li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+gene+therapy+for+hemophilia+A+that+enhances+safe+delivery+and+sustained+in+vivo+factor+VIII+expression+from+lentivirally+engineered+endothelial+progenitors.">Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors.</a> Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).</li><li>De Meyer, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+correction+of+von+Willebrand+disease+type+3+blood-derived+endothelial+cells+with+lentiviral+vectors+expressing+von+Willebrand+factor.">Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor.</a> Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).</li><li>Bodempudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cell-based+systemic+delivery+of+antiangiogenic+gene+therapy+for+solid+tumors.">Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors.</a> Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).</li><li>Dudek, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inhibition+of+tumour+angiogenesis+by+endothelial+cell-based+gene+therapy.">Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy.</a> British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).</li><li>Moubarik, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+as+cell+therapy+product+for+stroke.">Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).</li><li>Pislaru Sorin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts.">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1), 314 (2006).</li><li>Satyananda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+of+immune+modulation+in+xenotransplantation.">New concepts of immune modulation in xenotransplantation.</a> Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+pigs+as+organ+donors+for+xenotransplantation.">Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).</li><li>Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipi&#324;ski, D., S&#322;omski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+technology+in+pig-to-human+xenotransplantation+research.">CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).</li><li>Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+pigs.">Genetically engineered pigs.</a> Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).</li><li>Cozzi, E., White, D. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+transgenic+pigs+as+potential+organ+donors+for+humans.">The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans.</a> Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).</li><li>Phelps, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+alpha+1,3-galactosyltransferase-deficient+pigs.">Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs.</a> Science. 299 (5605), 411-414 (2003).</li></ol>

BOECs הם כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו בגישות מדעיות וטיפוליות שונות 7,8,16. BOECs שימשו לניתוח ביטוי גנים EC כדי להבהיר את גורמי המפתח האחראים להתפתחות מחלות כלי דם וסרטן 5,19,20,21.</sup...

האנדותל הוא מבנה מורכב ודינמי ביותר ומרכיב חיוני בדופן כלי הדם. הוא מצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם כדי לספק ממשק פיזי בין מחזור הדם לבין הרקמות הסובבות אותו. מבנה הטרוגני זה ידוע לבצע פונקציות שונות כגון אנגיוגנזה, דלקת, vasoregulation, hemostasis 1,2,3,4. תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי הם סוג תא שנחקר באופן נרחב כדי להעריך את הפונקציונליות של תאי אנדותל. עם זאת, השתנות האצווה הספציפית למטופל, פנוטיפ לא עקבי ויעילות פיצול מינימלית מצביעים על צורך לקבוע מקור תא שיכול לשפר את כל התכונות הללו5.
השגת אוכלוסייה הומוגנית של תאי אנדותל ראשוניים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית, ולתאי אנדותל ראשוניים אין יכולת שגשוג גבוהה6. לפיכך, כדי לחקור התחדשות כלי דם ולהעריך תהליכים פתופיזיולוגיים, קבוצות שונות ניסו להשיג ולהעריך סוגים שונים של תאי אנדותל שמקורם בדם היקפי, למשל, תאי אב אנדותל (EPC) או תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs)6,7,8,9 . ה-EPCs המוקדמים בצורת ציר מקורם בתאי גזע המטופויטיים (HSC) ויש להם עוצמת גדילה מוגבלת ויכולת אנגיוגנית מוגבלת לייצר תאי אנדותל בוגרים. יתר על כן, הם דומים מאוד מונוציטים דלקתיים. בנוסף, יכולתם להמשיך ולהתמיין לתאי אנדותל מתפקדים, מתרבים ובוגרים עדיין שנויה במחלוקת 6,7,9,10. התרבית המתמשכת של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) יכולה להצמיח אוכלוסייה משנית של תאים הידועים בשם EPCs מאוחרים, BOECs או תאים יוצרי מושבות אנדותל (ECFCs)6,7,9,10. מדינה ואחרים בשנת 2018, הכירו במגבלות של EPCs, בעמימות של המינוח שלהם, יחד עם חוסר התאמה כללי עם סוגי תאים מובחנים רבים המקובצים ברציפות תחת EPCs11. לעומת זאת, BOECs הפכו מוכרים על תפקידם בתיקון כלי דם, בריאות ומחלות, וטיפול תאי. מחקר נוסף ושימוש טיפולי בתאים אלה יסתמכו על פרוטוקולים כדי להפיק באופן עקבי סוגי תאים אלה מתאי אב במחזור.
תאים ראשוניים כגון BOECs יכולים לשמש כפונדקאית להשגת תאי אנדותל בוגרים בעלי שגשוג גבוה6. BOECs נבדלים פנוטיפית מ- EPCs מוקדמים ומציגים תכונות אנדותל טיפוסיות כגון מורפולוגיה מרוצפת וביטוי של צמתים דבקים ומערות12. פרופיל גנים שנערך על ידי Hebbel et al.13,14,15 מצא כי BOECs או ECFCs הם תאי אנדותל אמיתיים כפי שהם מקדמים היווצרות כלי דם וכלי דם גדולים. לפיכך, BOECs יכולים לשמש ככלי להערכת תהליכים פתופיזיולוגיים ושונות גנטית16. הם נחשבים גם למקור תאי מצוין לטיפול תאי להתחדשות כלי הדם17. לפיכך, פרוטוקול סטנדרטי כדי לגזור באופן עקבי תאים אלה מאוד שגשוג הוא חיוני.
בעוד BOECs מספקים כלי רב עוצמה לחקר השונות הפתופיזיולוגית והגנטית האנושית, מקור הומוגני יותר של BOECs עשוי לספק תוצאות ניסוייות וטיפוליות חזקות ואמינות יותר. הומוגניות מעולה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במקורות תאים קסנוגניים שמקורם בבעלי חיים דומים גנטית שגדלו בתנאים דומים18. בעוד מקורות תאים קסנוגניים נוטים לעורר תגובה חיסונית של המאכסן, אסטרטגיות אימונומודולציה מפותחות במטרה לייצר בעלי חיים ומוצרים מן החי התואמים למערכת החיסון, כולל תאים. חזירים, בפרט, הם מקור שופע של דם היקפי והם משמשים בדרך כלל לחקר מכשירים רפואיים וטיפולים אחרים בשל דמיון אנטומי ופיזיולוגי לבני אדם. לפיכך, מחקר זה מזקק את הפרוטוקול לבידוד והרחבה של BOECs מתרבים מאוד מדם היקפי חזירי. הפרוטוקול המפורט להלן הוא שיטה פשוטה ואמינה להשגת מספר רב של BOECs מנפח קטן יחסית של דם. ניתן להרחיב את התרביות באמצעות מספר מעברים כדי ליצור מיליוני תאים מדגימת דם אחת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188818112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringes</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881560125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride solution (0.8%)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-253-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 culture medium</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td>
			<td>03382C6227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>F-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque 1077</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection (1,000 units/mL)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00069-0058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin pipette</td>
			<td>Celltreat Scientific</td>
			<td>229280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of blood outgrowth endothelial cells (boec) from porcine peripheral blood

האנדותל הוא מבנה משולב דינמי הממלא תפקיד חשוב בתפקודים פיזיולוגיים רבים כגון אנגיוגנזה, המוסטאזיס, דלקת והומאוסטזיס. האנדותל גם ממלא תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיות כגון טרשת עורקים, יתר לחץ דם וסוכרת. תאי אנדותל יוצרים את הרירית הפנימית של כלי הדם והלימפה ומפגינים הטרוגניות במבנה ובתפקוד. קבוצות שונות העריכו את הפונקציונליות של תאי אנדותל שמקורם בדם היקפי אנושי תוך התמקדות בתאי אב אנדותל שמקורם בתאי גזע המטופויטיים או בתאי אנדותל בוגרים (או תאים יוצרי מושבות אנדותל). תאים אלה מספקים משאב אוטולוגי לטיפולים ולמידול מחלות. תאים קסנוגניים עשויים לספק מקור חלופי לטיפולים בשל זמינותם וההומוגניות המושגת על ידי שימוש בבעלי חיים דומים גנטית שגודלו בתנאים דומים. לפיכך, הוצג פרוטוקול חזק לבידוד והרחבה של תאי אנדותל בעלי שגשוג דם גבוה מדם היקפי חזירי. תאים אלה יכולים לשמש ליישומים רבים כגון הנדסת רקמות לב וכלי דם, תרפיה תאית, מידול מחלות, בדיקת תרופות, לימוד ביולוגיה של תאי אנדותל, ותרביות מבחנה כדי לחקור תגובות דלקתיות וקרישה בהשתלת קסנו.

המורפולוגיה של התאים בתרבית נצפתה מתחילת התרבית ועד שנצפו מושבות BOEC (איור 1). אוכלוסייה קטנה יותר של תאים דבקים החלה להיצמד לצלחות התרבית ולגדול, בעוד שתאים לא נצמדים הוסרו עם שינויים בינוניים בתרבית (איור 1B). מושבות הופיעו לראשונה ביום 6 כאוסף של תאים דמויי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood at JoVE.com

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

אפיון צמיחת דם תאי אנדותל (BOEC) מדם היקפי חזירי

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

הפרוטוקול מספק תאי אנדותל בעלי צמיחת דם גבוהה שיכולים לשמש להנדסת רקמות שונות, תרפיה תאית וחקירות מידול מחלות. טכניקה זו מניבה באופן עקבי תאים רבים משאיבת דם אחת. כדי שטכניקה זו תצליח, חיוני להכניס במהירות את התאים למדיום התרבית ולסביבת האינקובטור בהקדם האפשרי.ראשית, לדלל את תמיסת הפרין ל -100 יחידות למיליליטר במי מלח סטריליים. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של תמיסת הפרין לכל אחד משני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר ושני מזרקים של 60 מיליליטר. לאחר מכן, למשוך undiluted 1, 000 יחידות לכל מיליליטר הפרין פתרון לתוך צינור הארכה.חבר מחט 19 מד לקצה אחד של צינור ההארכה המלא בהפרין, ומזרק 60 מיליליטר המכיל הפרין לקצה השני של הצינור המאריך. לאחר מכן, נקו את אזור המפשעה הירכית של חזיר מורדם עם תמיסת קרצוף בטדין. לנקב את וריד הירך או עורק עם מחט 19 מד ב אחד עד שני מיליליטר לשנייה, לאט למשוך 50 מיליליטר של דם לתוך מזרק.השארת המחט במקום, מיד לעקם את צינור ההארכה לנתק את מזרק 60 מיליליטר. מעבירים את הדם לאט לצינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל הפרין. מכסים היטב את הצינור החרוט, הופכים בעדינות את הצינור כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים אותו על קרח.חברו את המזרק הנותר המכיל הפרין בקוטר 60 מיליליטר לצינור המאריך. שחררו את צינור ההארכה, ולאט לאט משכו דם נוסף של 50 מיליליטר לתוך המזרק. מיד להסיר את המחט מן העורק או הווריד ולאט לאט למשוך את הדם שנותר מן הצינור הרחבה לתוך מזרק.נתקו את מזרק ה-60 מיליליטר מצינור ההארכה והעבירו באיטיות את הדם לצינור החרוטי הנותר המכיל הפרין בקוטר 50 מיליליטר. מכסים היטב את הצינור החרוטי בקוטר 50 מיליליטר, הופכים בעדינות כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים על קרח. יש להפעיל המוסטאזיס לחץ על אזור המפשעה של עצם הירך של החזיר.לדלל את הדם אחד על אחד עם PBS בארבעה צינורות חרוטי 50 מיליליטר. הוסף 25 מיליליטר של טמפרטורת החדר, פתרון שיפוע צפיפות מוכן לשימוש לשמונה צינורות חרוטי 50 מיליליטר. לאט פיפטה 25 מיליליטר של תמיסת מלח דם בתוך כל צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל תמיסת שיפוע צפיפות על ידי החזקת הצינור בזווית חדה לקצה פיפטה.צנטריפוגה את הצינורות במשך 30 דקות ב 560 גרם ובטמפרטורת החדר. בזהירות לאסוף את מעיל באפי, שהוא השכבה העכורה של תאים מונוגרעיניים מעל פתרון שיפוע צפיפות מתחת פלזמה ברורה, מכל צינור עם פיפטה דקה ולהפיץ אותו באופן שווה לתוך שני צינורות חרוטי 50 מיליליטר חדשים. יש להשליך את תמיסת שיפוע הצפיפות המכילה צינורות.כדי לצפות צלחת שש בארות עם פיברונקטין לעשות פתרון מלאי של פיברונקטין פלזמה אנושית על ידי דילול אותו למיליגרם אחד למיליליטר במים סטריליים. הפוך 3.6 מיליליטר של פתרון עבודה של פיברונקטין על ידי דילול 600 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פיברונקטין בשלושה מיליליטר של PBS. מעבירים 600 מיקרוליטר של תמיסת העבודה פיברונקטין לכל באר של צלחת בעלת שש בארות ורוקדים בעדינות עד לציפוי אחיד.ולשאוף בעדינות את הפתרון מכל באר. כדי לשטוף את התאים החד-גרעיניים בזמן ההמתנה לציפוי הפיברונקטין יש למלא את הצינורות בעד 45 מיליליטר PBS, צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-560 X גרם וארבע מעלות צלזיוס עם הפסקה נמוכה. שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות.השהה מחדש כל כדור תא ב -25 מיליליטר של PBS. יש להשהות מחדש כל כדור תא בחמישה מיליליטר PBS ולהוסיף 15 מיליליטר של תמיסת אמוניום כלוריד 0.8% לכל צינור. שטפו את התאים כמו קודם על ידי הוספת PBS.שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות. השהה מחדש כל כדור תא ב -25 מיליליטר של PBS. יש להשהות מחדש כל כדורית תא בשישה מיליליטר של מדיום תרבית EGM-2 בתוספת 10% FBS ותמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1X.מעבירים בעדינות שני מיליליטר מתרחיף התא לכל באר של צלחת שש בארות מצופות פיברונקטין ומנערים בעדינות עד לציפוי אחיד. 24 שעות לאחר זריעת התאים, הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי לכל באר. למחרת, שאפו בעדינות 1.5 מיליליטר של מדיום תרבית מכל באר, והחליפו אותו ב-1.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי.במשך חמשת הימים הבאים, החליפו בעדינות את מדיום התרבות עם שני מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר. דמיינו באופן קבוע את תרביות התאים תחת מיקרוסקופ אור אובייקטיבי 4X בהספק נמוך. המורפולוגיה של התאים בתרבית נצפתה מתחילת התרבית ועד שנצפו מושבות BOEC.אוכלוסייה קטנה יותר של תאים דבקים החלה להיצמד לצלחות התרבית ולגדול, בעוד תאים שאינם דבקים הוסרו עם שינויים במדיום התרבית. מושבות הופיעו לראשונה ביום השישי כאוסף של תאים דמויי אנדותל המתרבים רדיאלית החוצה מנקודה מרכזית. ככל שהתקדמה התרבית, מושבות התאים נעשו צפופות יותר והציגו מורפולוגיה מרוצפת הדומה לתאי אנדותל בוגרים.מיקרוסקופ ניגודיות פאזה דו-ממדי שימש להדמיה של היווצרות צינוריות בתווך נטול סרום ובמדיום צמיחה מלא. תאים בשני תנאי המדיה עברו התמיינות מורפולוגית והתארגנו במהירות ברשתות נרחבות של מבנים דמויי צינור נימי. BOECs אופיינו גם על ידי ביטוי של סמן תאי אנדותל בוגר CD31 או מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות 1.BOECs הראו ביטוי אחיד של CD31. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה של BOECs עם נוגדן CD14 AF 700 בהשוואה לביקורת חיובית אישר את היעדר EPC, שכן התא מוכתם שלילי עבור סמן מונוציטים CD14 בהשוואה לקבוצת הביקורת החיובית של PBMCs. צביעת CD14 חיובית מוצגת בכחול, ותאים לא מוכתמים מוצגים באדום.במהלך איסוף הדם, חיוני לאסוף כמה שיותר משכבת הפרווה האפי תוך איסוף כמה שפחות מהשכבות הסמוכות. טכניקה זו אפשרה לחוקרים לחקור אסטרטגיות חדשות לאנדותל התקנים קרדיווסקולריים מושתלים באמצעות מודל חזיר עם תאי אנדותל אוטולוגיים של צמיחת דם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...