Name: characterization of blood outgrowth endothelial cells (boec) from porcine peripheral blood
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood at JoVE.com

Yazarlar NIH / NHLBI R00 HL129068'den fon almayı kabul etmek istiyorlar.

Tüm hayvan çalışmaları, Wisconsin Tıp Fakültesi ve Mayo Clinic'teki ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu çalışmada Yorkshire/Landrace/Duroc çapraz evcil domuzları (Sus domesticus), 40-80 kg, 3-6 aylık erkek ve dişi kullanılmıştır.
1. Domuz periferik kanının toplanması
<ol><li>Malzemeleri hazırlayın.<ol><li>Heparin çözeltisini steril salin içinde 100...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+I.+Structure,+function,+and+mechanisms.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).</li><li>Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+blood+vessel+cells+in+human+adaptive+immune+responses.">Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses.</a> Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).</li><li>Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+protein+C+receptor:+its+role+in+thrombosis.">The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis.</a> Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).</li><li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+1:+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis.">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li><li>Ormiston, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culture+of+blood+outgrowth+endothelial+cells+from+human+peripheral+blood.">Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).</li><li>Gulati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+origin+and+function+of+cells+with+endothelial+phenotype+obtained+from+adult+human+blood.">Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.</a> Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).</li><li>Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+endothelial+cells:+utility+from+ambiguity.">Blood endothelial cells: utility from ambiguity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).</li><li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitors:+A+consensus+statement+on+nomenclature.">Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).</li><li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+endothelial+progenitor+cell+(EPC)+subtypes+reveals+two+distinct+cell+populations+with+different+identities.">Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities.</a> BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).</li><li>Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+question+based+on+cross-platform+microarray+data+normalization:+are+BOEC+more+like+large+vessel+or+microvascular+endothelial+cells+or+neither+of+them.">A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them.</a> Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).</li><li>Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-supervised+learning+via+penalized+mixture+model+with+application+to+microarray+sample+classification.">Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification.</a> Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).</li><li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+identity,+phenotype,+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells.">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li><li>Fernandez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cells+from+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia+patients+reveal+abnormalities+compatible+with+vascular+lesions.">Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions.</a> Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).</li><li>Critser, P. J., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony-forming+cell+role+in+neoangiogenesis+and+tissue+repair.">Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+aortic+endothelial+cells+from+miniature+pigs.">Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).</li><li>Chang Milbauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+endothelial+systems+biology+of+sickle+stroke+risk.">Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk.</a> Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+endothelial+cell+gene+expression+by+African+Americans+versusCaucasian+Americans:+a+possible+contribution+to+health+disparity+in+vascular+disease+and+cancer.">Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer.</a> BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).</li><li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+1:+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis.">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li><li>Milbauer, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cell+migration+and+trapping+in+vivo:+a+window+into+gene+therapy.">Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy.</a> Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).</li><li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+gene+therapy+for+hemophilia+A+that+enhances+safe+delivery+and+sustained+in+vivo+factor+VIII+expression+from+lentivirally+engineered+endothelial+progenitors.">Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors.</a> Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).</li><li>De Meyer, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+correction+of+von+Willebrand+disease+type+3+blood-derived+endothelial+cells+with+lentiviral+vectors+expressing+von+Willebrand+factor.">Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor.</a> Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).</li><li>Bodempudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cell-based+systemic+delivery+of+antiangiogenic+gene+therapy+for+solid+tumors.">Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors.</a> Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).</li><li>Dudek, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inhibition+of+tumour+angiogenesis+by+endothelial+cell-based+gene+therapy.">Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy.</a> British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).</li><li>Moubarik, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+as+cell+therapy+product+for+stroke.">Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).</li><li>Pislaru Sorin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts.">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1), 314 (2006).</li><li>Satyananda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+of+immune+modulation+in+xenotransplantation.">New concepts of immune modulation in xenotransplantation.</a> Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+pigs+as+organ+donors+for+xenotransplantation.">Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).</li><li>Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipi&#324;ski, D., S&#322;omski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+technology+in+pig-to-human+xenotransplantation+research.">CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).</li><li>Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+pigs.">Genetically engineered pigs.</a> Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).</li><li>Cozzi, E., White, D. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+transgenic+pigs+as+potential+organ+donors+for+humans.">The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans.</a> Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).</li><li>Phelps, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+alpha+1,3-galactosyltransferase-deficient+pigs.">Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs.</a> Science. 299 (5605), 411-414 (2003).</li></ol>

BOEC'ler çeşitli bilimsel ve terapötik yaklaşımlarda kullanılabilecek güçlü bir araçtır 7,8,16. BOEC'ler, vasküler hastalıkların ve kanserin gelişiminden sorumlu anahtar faktörleri aydınlatmak için EC gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanılmıştır 5,19,20,21. BOEC'ler ayrıca...

Endotel oldukça karmaşık, dinamik bir yapıdır ve vasküler duvarın hayati bir bileşenidir. Dolaşımdaki kan ve çevresindeki dokular arasında fiziksel bir arayüz sağlamak için kan damarlarının iç yüzeyini hizalar. Bu heterojen yapının anjiyogenez, inflamasyon, vazoregülasyon ve hemostaz gibi çeşitli işlevleri yerine getirdiği bilinmektedir 1,2,3,4. İnsan göbek damarı endotel hücreleri, endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için yaygın olarak çalışılan bir hücre tipidir. Bununla birlikte, hastaya özgü parti değişkenliği, tutarsız fenotip ve minimum ayrılma verimliliği, tüm bu özellikleri geliştirebilecek bir hücre kaynağının belirlenmesi ihtiyacını ortaya koymaktadır5.
Primer endotel hücrelerinin homojen bir popülasyonunu elde etmek teknik olarak zor olabilir ve primer endotel hücreleri yüksek proliferatif kapasiteye sahip değildir6. Bu nedenle, vasküler rejenerasyonu incelemek ve patofizyolojik süreçleri değerlendirmek için, çeşitli gruplar periferik kandan türetilen farklı endotel hücreleri tiplerini elde etmeye ve değerlendirmeye çalışmışlardır, örneğin endotel progenitör hücreleri (EPC'ler) veya kan büyümesi endotel hücreleri (BOEC'ler)6,7,8,9 . İğ şeklindeki erken EPC'ler hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) kaynaklanır ve olgun endotel hücreleri üretmek için sınırlı büyüme potansiyeline ve sınırlı anjiyojenik yeteneğe sahiptir. Ayrıca, enflamatuar monositlere çok benzerler. Ek olarak, işlevsel, çoğalan, olgun endotel hücrelerine daha da farklılaşma kapasiteleri hala tartışmalıdır 6,7,9,10. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) sürekli kültürü, geç büyüme EPC'leri, BOEC'ler veya endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC'ler) olarak bilinen ikincil bir hücre popülasyonuna yol açabilir6,7,9,10. Medina ve ark. 2018'de, EPC'lerin sınırlamalarını, isimlendirmelerinin belirsizliğini ve EPC'ler11 altında sürekli olarak gruplandırılmış birçok farklı hücre tipiyle genel bir uyum eksikliğini kabul etmiştir. Buna karşılık, BOEC'ler vasküler onarım, sağlık ve hastalık ve hücre tedavisindeki rolleri ile tanınmıştır. Bu hücrelerin daha fazla araştırılması ve terapötik kullanımı, bu hücre tiplerini dolaşımdaki progenitör hücrelerden tutarlı bir şekilde türetmek için protokollere dayanacaktır.
BOEC'ler gibi primer hücreler, yüksek proliferatif olgun endotel hücreleri elde etmek için bir vekil olarak kullanılabilir6. BOEC'ler fenotipik olarak erken EPC'lerden farklıdır ve parke taşı morfolojisi ve aderens kavşaklarının ve kaveoların ekspresyonu gibi tipik endotel özellikleri sergiler12. Hebbel ve ark.13,14,15 tarafından yapılan gen profillemesi, BOEC'lerin veya ECFC'lerin mikrovasküler ve büyük damar oluşumunu teşvik ettikleri için gerçek endotel hücreleri olduğunu bulmuştur. Bu nedenle, BOEC'ler patofizyolojik süreçleri ve genetik çeşitliliği değerlendirmek için bir araç olarak kullanılabilir16. Ayrıca vasküler rejenerasyon için hücre tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olarak kabul edilirler17. Bu nedenle, bu yüksek proliferatif hücreleri tutarlı bir şekilde türetmek için standartlaştırılmış bir protokol gereklidir.
BOEC'ler insan patofizyolojik ve genetik varyasyonunu incelemek için güçlü bir araç sağlarken, daha homojen bir BOEC kaynağı daha sağlam ve güvenilir deneysel ve terapötik sonuçlar sağlayabilir. Üstün homojenlik, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanlardan elde edilen ksenojenik hücre kaynakları kullanılarak elde edilebilir18. Ksenojenik hücre kaynakları konakçı immün yanıtını ortaya çıkarmaya eğilimli olsa da, immünomodülasyon stratejileri, hücreler de dahil olmak üzere immünouyumlu hayvanlar ve hayvansal ürünler üretmek amacıyla geliştirilmektedir. Özellikle domuzlar, bol miktarda periferik kan kaynağıdır ve insanlarla anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle tıbbi cihazları ve diğer terapileri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışma, domuz periferik kanından yüksek proliferatif BOEC'lerin izolasyonu ve genişlemesi için protokolü rafine etmektedir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, nispeten küçük bir kan hacminden çok sayıda BOEC elde etmek için basit ve güvenilir bir yöntemdir. Kültürler, tek bir kan örneğinden milyonlarca hücre üretmek için birkaç pasajla genişletilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188818112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringes</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881560125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride solution (0.8%)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-253-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 culture medium</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td>
			<td>03382C6227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>F-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque 1077</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection (1,000 units/mL)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>00069-0058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin pipette</td>
			<td>Celltreat Scientific</td>
			<td>229280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of blood outgrowth endothelial cells (boec) from porcine peripheral blood

Endotel, anjiyogenez, hemostaz, inflamasyon ve homeostaz gibi birçok fizyolojik fonksiyonda önemli rol oynayan dinamik entegre bir yapıdır. Endotel ayrıca ateroskleroz, hipertansiyon ve diyabet gibi patofizyolojilerde de önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücreleri kan ve lenfatik damarların iç astarını oluşturur ve yapı ve fonksiyonda heterojenlik gösterir. Çeşitli gruplar, hematopoetik kök hücrelerden veya olgun kan büyümesi endotel hücrelerinden (veya endotel kolonisi oluşturan hücrelerden) türetilen endotel progenitör hücrelerine odaklanarak insan periferik kanından türetilen endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmiştir. Bu hücreler tedavi ve hastalık modellemesi için otolog bir kaynak sağlar. Ksenojenik hücreler, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanların kullanılmasıyla elde edilen kullanılabilirlikleri ve homojenlikleri nedeniyle alternatif bir terapötik kaynak sağlayabilir. Bu nedenle, domuz periferik kanından yüksek proliferatif kan büyümesi endotel hücrelerinin izolasyonu ve genişlemesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu hücreler, ksenotransplantasyonda inflamatuar ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için kardiyovasküler doku mühendisliği, hücre tedavisi, hastalık modelleme, ilaç taraması, endotel hücre biyolojisinin incelenmesi ve in vitro ko-kültürler gibi sayısız uygulama için kullanılabilir.

Kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi, kültürün başlangıcından BOEC kolonileri gözlenene kadar gözlendi (Şekil 1). Daha küçük bir yapışkan hücre popülasyonu kültür kaplarına yapışmaya ve büyümeye başlarken, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamı değişiklikleriyle uzaklaştırıldı (Şekil 1B). Koloniler ilk olarak 6. günde, merkezi bir noktadan radyal olarak dışa doğru çoğalan endotel benzeri hücrelerin bir koleksiyonu ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood at JoVE.com

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Protokol, çeşitli doku mühendisliği, hücre tedavisi ve hastalık modelleme araştırmaları için kullanılabilecek oldukça proliferatif kan büyümesi endotel hücreleri sağlar. Bu teknik, tek bir kan alımından sürekli olarak birçok hücre verir. Bu tekniğin başarılı olması için, hücrelerin mümkün olan en kısa sürede kültür ortamına ve inkübatör ortamına hızlı bir şekilde sokulması çok önemlidir.İlk olarak, heparin çözeltisini steril salin içinde mililitre başına 100 birime seyreltin. İki adet 50 mililitrelik konik tüpün ve iki adet 60 mililitrelik şırınganın her birine üç ila dört mililitre heparin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, mililitre heparin çözeltisi başına seyreltilmemiş 1.000 üniteyi bir uzatma tüpüne çekin.Heparin dolgulu uzatma tüpünün bir ucuna 19 gauge iğne ve uzatma tüpünün diğer ucuna heparin içeren 60 mililitrelik bir şırınga bağlayın. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir domuzun femoral kasık bölgesini bir Betadine ovma çözeltisi ile temizleyin. Femoral veni veya arteri 19 gauge iğne ile delin ve saniyede bir ila iki mililitrede, şırıngaya yavaşça 50 mililitre kan çekin.İğneyi yerinde bırakarak, hemen uzatma tüpünü bükün ve 60 mililitrelik şırınganın bağlantısını kesin. Kanı yavaşça heparin içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.Kalan heparin içeren 60 mililitrelik şırıngayı uzatma tüpüne bağlayın. Uzatma tüpünü çıkarın ve yavaşça şırıngaya 50 mililitre daha kan çekin. İğneyi derhal arterden veya damardan çıkarın ve kalan kanı uzatma tüpünden yavaşça şırıngaya çekin.60 mililitrelik şırıngayı uzatma tüpünden ayırın ve kanı yavaşça kalan heparin içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. 50 mililitrelik konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin. Domuzun femoral kasık bölgesine basınç hemostazı uygulayın.Kanı PBS ile dört adet 50 mililitrelik konik tüpte bire bir seyreltin. Sekiz adet 50 mililitrelik konik tüpe 25 mililitre oda sıcaklığı, kullanıma hazır yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin. Yavaşça pipet içine 25 mililitre kan salin çözeltisi içeren her 50 mililitrelik konik tüpün içine yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyerek tüpü pipet ucuna keskin bir açıyla tutun.Tüpleri 560 g ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüj edin. Yoğunluk gradyanı çözeltisinin üstünde ve berrak plazmanın altındaki mononükleer hücrelerin bulutlu tabakası olan kabarık katı, ince bir pipetle her tüpten dikkatlice toplayın ve iki yeni 50 mililitrelik konik tüpe eşit olarak dağıtın. Tüpleri içeren yoğunluk gradyanı çözeltisini atın.Altı delikli bir plakayı fibronektin ile kaplamak için, steril suda mililitre başına bir miligrama seyrelterek insan plazma fibronektinin stok çözeltisini yapın. Üç mililitre PBS'de 600 mikrolitre fibronektin stok çözeltisini seyrelterek 3.6 mililitre çalışan bir fibronektin çözeltisi yapın. 600 mikrolitre fibronektin çalışma çözeltisini altı delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.Ve çözeltiyi her bir kuyudan nazikçe aspire edin. Fibronektinin kaplanmasını beklerken mononükleer hücreleri yıkamak için, tüpleri 45 mililitreye kadar PBS ile doldurun, 560 X g'de beş dakika santrifüj yapın ve düşük mola ile dört santigrat derece. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.Her hücre peletini 25 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Her hücre peletini beş mililitre PBS içinde yeniden askıya alın ve her tüpe 15 mililitre% 0.8 amonyum klorür çözeltisi ekleyin. PBS ekleyerek hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın.Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin. Her hücre peletini 25 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Her hücre peletini,% 10 FBS ve 1X antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş altı mililitre EGM-2 kültür ortamında tekrar askıya alın.Hücre süspansiyonunun iki mililitresini, fibronektin kaplı altı delikli plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın. Hücreleri tohumladıktan 24 saat sonra, her bir oyuğa yavaşça bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Ertesi gün, her bir kuyudan 1,5 mililitre kültür ortamını nazikçe aspire edin ve 1,5 mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin.Önümüzdeki beş gün boyunca, kültür ortamını kuyu başına iki mililitre taze kültür ortamı ile yavaşça değiştirin. Düşük güçlü 4X objektif ışık mikroskobu altında hücre kültürlerini düzenli olarak görselleştirin. Kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi, kültürün başlangıcından BOEC kolonileri gözlenene kadar gözlendi.Daha küçük bir yapışkan hücre popülasyonu kültür yemeklerine bağlanmaya ve büyümeye başlarken, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamı değişiklikleriyle uzaklaştırıldı. Koloniler ilk olarak altıncı günde, merkezi bir noktadan radyal olarak dışa doğru çoğalan endotel benzeri hücrelerin bir koleksiyonu olarak ortaya çıktı. Kültür ilerledikçe, hücre kolonileri daha yoğun hale geldi ve olgun endotel hücrelerine benzer bir parke taşı morfolojisi sergiledi.Serumsuz ortamda ve tam büyüme ortamında tüp oluşumunu görüntülemek için iki boyutlu faz kontrast mikroskobu kullanıldı. Her iki ortam koşullarındaki hücreler morfolojik farklılaşmaya uğradı ve hızla kılcal tüp benzeri yapıların geniş ağlarına organize oldu. BOEC'ler ayrıca olgun endotel hücre belirteci CD31 veya trombosit endotel hücre adezyon molekülü bir'in ekspresyonu ile karakterize edildi.BOEC'ler CD31'in tekdüze ekspresyonunu gösterdi. Ayrıca, CD14 AF 700 antikoru ile BOEC'lerin pozitif kontrole kıyasla akış sitometri analizi, PBMC'lerin pozitif kontrol grubuna kıyasla monosit belirteci CD14 için negatif boyandığı için EPC'lerin yokluğunu doğruladı.Kan toplama sırasında, bitişik katmanların mümkün olduğunca azını toplarken, buffy ceket tabakasının mümkün olduğunca çoğunu toplamak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların otolog kan büyümesi endotel hücrelerine sahip bir domuz modeli kullanarak implante edilebilir kardiyovasküler cihazları endotelalize etmek için yeni stratejiler incelemelerini sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Ultra Hızlı Doppler ile Kan Akışı Görüntüleme

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...