Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

نشكر باكيني فرومسيري وبراين جينسيك وجينغهونغ (جيمس) تانغ وروجر وايت على تعليقاتهم على المخطوطة. نشكر باتريك أوكس وستيفانو دي تاليا وفيكتوريا دينيك على مشاركة خبراتهم حول كيفية إجراء تحليل PIV. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة F31 HD100127 (إلى M. D. K.) و R01 GM102155 (إلى M. A. W).

<ol>
	<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li><li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11.">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=As+the+fat+flies:+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos.">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li><li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos.">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li><li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li><li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila.">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li><li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos.">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021 (2018).</li><li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+patterns,+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library.">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li><li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells:+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis,+autophagy,+and+mitochondrial+fusion+dynamics.">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos.">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+collection.">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999)</li><li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).</li><li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+size,+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species.">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance.">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy.">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li><li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy.">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li><li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs.">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li><li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid.">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li></ol>

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

الأصباغ الحيوية والمجسات الجزيئية هي أدوات قوية لتصوير هياكل خلوية محددة والعضيات الحية. في جنين ذبابة الفاكهة ، تعرض العديد من العضيات المختلفة توطينا مدفوعا بالهيكل الخلوي1،2،3،4 ، لكن تطبيق هذه الجزيئات الصغيرة يمثل تحديا لأن قشر البيض غير منفذ للعديد منها. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخدام مجسات الفلورسنت (FPs) في الأجنة الحية عن طريق الحقن المجهري من أجل الكشف عن الاتجار واسع النطاق بالعضيات. يغطي الإجراء إعداد محلول الحقن ، وجمع البيض وإعداد الأجنة ، والحقن المجهري ، والتصوير ، وتحليل الصور.
إعادة الترتيب المكاني الدراماتيكي للعضيات شائعة في العديد من البويضات الحيوانية والبيض والأجنة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الكبير لهذه الخلايا. في جنين ذبابة الفاكهة ، على سبيل المثال ، تتحرك قطرات الدهون (LDs) وحويصلات صفار البيض نحو مركز الجنين قبل الخلية5. تعتمد هذه الحركة على الأنابيب الدقيقة وتترك منطقة ~ 40 ميكرومتر في جميع أنحاء محيط الجنين مستنفدة من العضيتين. خلال مراحل الانقسام المبكرة ، يتم نقل العديد من العضيات عن طريق تدفقات السيتوبلازم التي تحركها الانقباضات القائمة على الأكتين الميوسين على سطح الجنين6. على الرغم من أن أجنة العديد من الأنواع تظهر عمليات إعادة ترتيب مماثلة ، إلا أن جنين ذبابة الفاكهة مناسب بشكل خاص لمتابعة هذه العمليات عن طريق التصوير لأنه يتطور خارجيا في "درجة حرارة الغرفة" القياسية في المختبر ، وهو شفاف نسبيا ، وصغير بما يكفي ليتناسب مع معظم إعدادات المجهر ، ويمكن التلاعب به باستخدام أدوات وراثية قوية.
بالنسبة لبعض العضيات ، تتوفر البروتينات الموسومة بالفلورسنت التي تضع علامات على هذه الهياكل على وجه التحديد. على سبيل المثال ، LSD-2 (المعروف أيضا باسم dPLIN2) هو بروتين يستهدف في الأجنة LDs7 على وجه التحديد. تتوفر خطوط الذباب التي تحمل إما جينات متحولة قابلة للحث تشفر اندماجا بين بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) و LSD-28 أو فخ جيني يتم فيه إدخال بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) في منطقة ترميز جين LSD-2 الداخلي 9,10. ومع ذلك ، فإن هذا النهج له قيود ، بما في ذلك أن هذه البروتينات الاندماجية لها عوائد كمية منخفضة وتميل إلى التبييض بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون وضع العلامات على هياكل مختلفة متعددة في وقت واحد تحديا: بالنسبة للعديد من العضيات ، يتوفر حاليا نوع واحد فقط من علامات الفلورسنت (غالبا GFP أو mCherry) ، لذلك قد يتطلب تصوير عضيتين في نفس الوقت جينات أو إدخالات جديدة ؛ أيضا ، حتى لو كانت العلامات المتوافقة متوفرة ، فإن إدخالها في سلالة واحدة يمكن أن يتطلب تقاطعات تستغرق وقتا طويلا. كما أنه يجعل استخدام العديد من الموارد الوراثية القوية أقل ملاءمة، على سبيل المثال، إذا كان يجب أن تكون علامتا عضيتين، وبرنامج تشغيل Gal4، وبناء RNAi قابل للتحريض موجودة في نفس الأم.
من حيث المبدأ ، يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام FPs ، بما في ذلك الأصباغ الحيوية (على سبيل المثال ، LysoTracker لوضع علامة على الليزوسومات) ، والمجسات الجزيئية (على سبيل المثال ، SiR-tubulin لتسمية microtubules) ، والجزيئات البيولوجية المصنفة بالفلورسنت (على سبيل المثال ، C12 BODIPY للتحقيق في استقلاب الأحماض الدهنية11). من الاستخدام في الخلايا المستزرعة ، عادة ما يتم التحقق من صحتها جيدا كأدوات قوية لفحص البيولوجيا الخلوية. FPs متعددة الاستخدامات ، ولها خصائص صور فائقة ، ومتوافقة مع البروتينات الفلورية. يمكن خلط أصباغ متعددة وتطبيقها في وقت واحد ، وغالبا ما يكون ذلك مع فوائد الفصل في المناطق البنفسجية / الزرقاء والحمراء البعيدة من الطيف وتحولات ستوكس الصغيرة ، مما يمنع نزيف القناة من خلالها. تسمح تحولات ستوكس الصغيرة بالتقاط قنوات تصوير متعددة في وقت واحد، مما يتيح تتبع العديد من العضيات في وقت واحد. وأخيرا ، يمكن تطبيقها بنفس القدر على وضع العلامات على العضيات في أجنة أنواع ذبابة الفاكهة الأخرى أو حتى الحشرات الأخرى حيث قد لا تتوفر بروتينات موسومة بالفلورسنت.
ومع ذلك ، فإن معظم هذه FPs لا يمكنها اجتياز قشر البيض المتقن لجنين ذبابة الفاكهة . وهو يتألف من خمس طبقات: ثلاث طبقات مشيمية خارجية (كوريون) تمنع التلف الميكانيكي بالإضافة إلى طبقة شمعية تحيط بغشاء الفيتلين الذي يخلق حاجزا كيميائيا12. من أجل البساطة ، سيشار إلى مزيج من الطبقة الشمعية وغشاء vitelline باسم "غشاء vitelline" أدناه. لتجاوز قشر البيض ، يقوم هذا البروتوكول بتكييف نهج الحقن المجهري للأجنة المعمول به لإدخال FPs في جنين ذبابة الفاكهة . يصف البروتوكول كيفية مراقبة التدفق السيتوبلازمي ل LDs في أجنة مرحلة الانقسام. ويشمل إعداد إبر الحقن وأقفاص جمع البيض ، وعملية جمع البيض ، والإزالة الميكانيكية للكوريون. ويتناول كيفية الحقن الدقيق للأجنة وتصويرها وكيفية تحليل التدفق الأكبر ل LDs باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV ، مقتبس من6). ويقدم المشورة بشأن استكشاف الأخطاء وإصلاحها لضمان بقاء الجنين على قيد الحياة وإنشاء أفضل نظام للتصوير. كما نوقشت كيفية تعديل البروتوكول لتصوير LDs و microtubules في وقت واحد أو لتطبيقه على دراسة العضيات الأخرى ، بما في ذلك الليزوسومات والميتوكوندريا وحويصلات صفار البيض والشبكة الإندوبلازمية (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة هي خلايا كبيرة تحتوي على مجموعة واسعة من العضيات التقليدية والخاصة بالجنين. خلال الساعات الثلاث الأولى من التكوين الجنيني ، تخضع هذه العضيات لحركات دراماتيكية مدعومة بتدفق السيتوبلازم القائم على الأكتين والاتجار المدفوع بالمحرك على طول الأنابيب الدقيقة. إن تطوير العديد من مجسات الفلورسنت الصغيرة الخاصة بالعضيات (FPs) يجعل من الممكن تصور مجموعة واسعة من الهياكل المختلفة المحتوية على الدهون في أي نمط وراثي ، مما يسمح بالتصوير الحي دون الحاجة إلى فلوروفور مشفر وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيفية حقن الأصباغ الحيوية والمجسات الجزيئية في أجنة ذبابة الفاكهة لمراقبة الاتجار بعضيات معينة عن طريق التصوير الحي. ويتضح هذا النهج من خلال وضع علامات على قطرات الدهون (LDs) ومتابعة حركتها السائبة عن طريق قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV). يوفر هذا البروتوكول استراتيجية قابلة لدراسة العضيات الأخرى ، بما في ذلك الليزوزومات والميتوكوندريا وحويصلات صفار البيض و ER ، ولتتبع حركة LDs الفردية على طول الأنابيب الدقيقة. إن استخدام الأصباغ المتاحة تجاريا يجلب فوائد الفصل إلى المناطق البنفسجية / الزرقاء والحمراء البعيدة من الطيف. من خلال الوسم المشترك المتعدد للعضيات و / أو العناصر الخلوية الهيكلية عن طريق الحقن المجهري ، تتوفر جميع الموارد الوراثية في ذبابة الفاكهة لدراسات الاتجار دون الحاجة إلى إدخال بروتينات موسومة بالفلورسنت. على عكس الفلوروفورات المشفرة وراثيا ، والتي لها غلات كمية منخفضة وتبييض بسهولة ، فإن العديد من الأصباغ المتاحة تسمح بالتقاط سريع ومتزامن لعدة قنوات ذات عوائد فوتونية عالية.

بعد الحقن ، سيتم توطين الصبغة فقط في الموقع الذي تم فيه إدخال طرف الإبرة. ثم تنتشر الصبغة بعيدا عن موقع الحقن اعتمادا على خصائصها المنتشرة. ويبين الشكل 1 حقن BODIPY 493/503، بعد فترة وجيزة من الحقن (اللوحة A) وبعد 24 دقيقة (اللوحة B). بعد 24 دقيقة ، وصلت الصبغة إلى نقطة الوسط تقريبا للمحور الطويل للجنين.
يمكن تحقيق تحليل حركية العضيات من خلال حقن الصبغة والتصوير بفاصل زمني. في الشكل 2 ، تم حقن الجنين بشكل مشترك مع BODIPY 493/503 (الشكل 2A) و LysoTracker Red (الشكل 2B) وتم تصويره باستخدام إثارة الليزر عند 488 و 596 نانومتر ، على التوالي. ثم تم تصوير هذا الجنين بفاصل زمني (إطار واحد كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة ، 5 دقائق تم تحليلها). ثم تم تشغيل السلسلة الزمنية من خلال تحليل PIV ، والذي يتم عرض مخرجاته من خلال الانسيابية في الشكل 2A و B. لاحظ أن الانسيابية لا تمثل مسار الجسيمات الفردية ، ولكن يتم استنتاج التدفق السيتوبلازمي من تحليل جميع الجسيمات الموجودة في تلك المنطقة من السيتوبلازم. من خلال وضع العلامات على اثنين من الهياكل الخلوية المستقلة (LDs والعضيات الحمضية) ، يجد تحليل PIV تدفقات مماثلة ، مع تقارب كلا العلامتين على المنطقة الوسطى من الجنين حيث يتدفق السيتوبلازم إلى داخل الجنين6.
تسمح FPs المتاحة حاليا بوضع علامات على العديد من العضيات والهياكل الخلوية الأخرى. يوضح الشكل 3 وضع العلامات على ER عبر متعقب ER Green. يوفر متعقب ER دقة لطيفة للغلاف النووي ، مما يسمح بتصور مراحل دورة الخلية الرئيسية. يتم تصوير متعقب ER Green باستخدام إثارة 488 نانومتر.
يعد وضع العلامات على الميتوكوندريا أمرا صعبا ، حيث يبدو أن معظم الأصباغ التي تم اختبارها محاصرة في الميتوكوندريا الأولى التي تدخلها. من ناحية أخرى ، لم يتم الكشف عن أي علامة على سمية الصبغة ، مما يجعل من الممكن اتباع الميتوكوندريا المسماة من خلال الخلوية والدورة النووية للجلد الخارجي 15. يوضح الشكل 4 خلية جلدية خارجية بعد عدة ساعات من الحقن باستخدام Mitoview 633 (الطول الموجي للإثارة 633 نانومتر).
BODIPY و Lysotracker و LipidSpot قوية ويمكن استخدامها للحصول على أكثر من 500 صورة بدقة 512 × 512 ، ومتوسط الخط 3 ، ومعدلات الإطارات من 1 / s إلى 0.1 / s. تعقب ER Green و SiR-tubulin وأصباغ الميتوكوندريا المذكورة أقل قوة وتنتج ~ 50-200 صورة في ظل نفس الظروف.
بدءا من مراحل الأديم الأرومي ، تتحرك LDs ثنائية الاتجاه على طول الأنابيب الدقيقة ، مدعومة بمحركات القطبية المعاكسة kinesin-1 و dynein السيتوبلازمية5. يمكن تصور هذه الحركة عن طريق المشاركة في وضع العلامات LDs والأنابيب الدقيقة عن طريق حقن كل من BODIPY 493/503 و SiR-Tubulin (الشكل 5). نظرا لأن LDs تعكس في كثير من الأحيان اتجاه حركتها (أثناء انتقالها بين kinesin-1 و dynein السيتوبلازمي) ، فإن معدلات الإطارات الأعلى أثناء الاكتساب تلتقط بشكل أفضل التفاصيل المهمة لحركية LD.
التصوير الحي لحويصلات صفار البيض ذاتية الفلورسنت ممكن دون أي شكل من أشكال حقن الصبغة (الشكل 6). ومع ذلك ، فإن التألق الذاتي خافت ، وليزر الإثارة سام للضوء. وبالتالي ، فإن التصوير الحي لصفار البيض الفلوري الذاتي له نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة بالنسبة لحقن الصبغة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> الشكل 1: انتشار BODIPY 493/503 عبر الجنين. تم حقن الصبغة على طول الحافة الجانبية نحو الطرف الأمامي (أعلى اليمين) وتنتشر من موقع الحقن هذا إلى الجنين ، مع وضع علامات LDs. (أ) انتشرت الصبغة عبر أجزاء من الجنين المجاورة لموقع الحقن. (ب) بعد حوالي 24 دقيقة/2 دورة نووية، انتشرت الصبغة بعد نقطة منتصف الجنين. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">ثانية.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> الشكل 2: قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV) ل LDs والعضيات الحمضية. تم حقن جنين بكل من BODIPY 493/503 و LysoTracker Red. (أ) قناة BODIPY. (ب) قناة LysoTracker الحمراء. (أ'، ب') تبسيط الرسوم البيانية الناتجة عن تحليل PIV للقناتين المولدتين من 10 إطارات متسلسلة ، بما في ذلك تلك الموضحة في A و B. A ' يتوافق مع تدفق LDs ، و B ' يتوافق مع تدفق العضيات الحمضية. لاحظ أن كلا من A و B يظهران التقاء يسار الوسط حيث تتدفق المحتويات الجنينية من مستوى الرؤية ، إلى مركز الجنين. لاحظ أيضا أن BODIPY قد انتشر أكثر من LysoTracker لأن الأصباغ المختلفة لها خصائص منتشرة مختلفة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">ثانية.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> الشكل 3: تسميات تعقب ER للتقسيمات النووية المتزامنة. تم حقن جنين الأديم الأرومي المخلوي مع تعقب ER وتم تصوير جزء من سطحه بمرور الوقت. (أ) تجميع المغزل أثناء التقسيم النووي. (ب) قطع الغلاف النووي أثناء نفس التقسيم. (ج) الطور البيني اللاحق. (دال) يشار إلى بداية التقسيم التالي بمظهر مركزي (حدوث مناطق دائرية خالية من ER ، تتميز برؤوس أسهم). لاحظ تبييض الصبغة التدريجي. الطول الموجي للإثارة: 488 نانومتر. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. A: الإطار الأولي، B: 3 دقائق منقضية، C: 10 دقائق المنقضية، D: 13 دقيقة المنقضية. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">ثانية.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> الشكل 4: Mitoview 633 وضع العلامات على الميتوكوندريا. تم حقن الجنين ب Mitoview 633 خلال مرحلة الأديم الأرومي المخلوي وتصويره بعد 4 ساعات ، بعد التزيين. تظهر الصورة خلية عصبية جلدية لجنين في امتداد النطاق الجرثومي. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">ثانية.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> الشكل 5: الوسم المشترك ل LDs والأنابيب الدقيقة. تم حقن جنين خلوي بمزيج من BODIPY 493/503 (الأصفر A ، B ، C) و SiR Tubulin (أرجواني A ، B ، C). أ''، ب''، ج'' عرض القنوات المدمجة. تظهر اللوحات A و A و A' الإطار الأولي ، وتعرض اللوحات B و B و B الإطار بعد 5 ثوان ، وتعرض اللوحات C و C و C الإطار بعد 10 ثوان. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 512 × 512 (متوسط الخط 3) كل 2.5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">ثانية.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> الشكل 6: تصوير التألق الذاتي لحويصلات صفار البيض خلال مراحل الانقسام المتزامن . (أ) في بداية الاكتساب. (ب) بعد 8 دقائق (ج) بعد 16 دقيقة. الطول الموجي للإثارة: 405 نانومتر. تم استخدام كثافة الإثارة المنخفضة للحفاظ على الجنين على قيد الحياة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">ثانية.</a>
بيانات تكميلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

في جنين ذبابة الفاكهة المبكر ، تكون العديد من العضيات متحركة. من حيث المبدأ ، يمكن تصويرها مباشرة عبر تحقيقات فلورسنت محددة ، لكن قشر البيض يمنع التطبيق المباشر على الجنين. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مثل هذه المجسات عن طريق الحقن المجهري ، ثم تحليل حركة العضيات السائبة عبر قياس سرعة صورة الجسيمات.

تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

في جنين ذبابة الفاكهة المبكر ، تخضع العديد من العضيات لحركة واسعة النطاق. يصف بروتوكولنا كيفية مراقبة هذه الحركة باستخدام أصباغ الفلورسنت المطورة لزراعة الخلايا. بالمقارنة مع البروتينات الفلورية ، فإن مجسات الفلورسنت المتاحة تجاريا أكثر إشراقا وتمتد على نطاق أوسع من الطيف.فهي تسمح بوضع العلامات المشتركة متعددة الإرسال ويمكن استخدامها في أي خلفية وراثية. يستغرق الأمر ممارسة وتجربة وخطأ لمعرفة كم من الوقت لتجفيف الأجنة ، بحيث تنفجر أثناء الحقن أو تجف وتتوقف عن التطور. للبدء ، ابدأ في تحضير إبر الحقن عن طريق وضع الشعيرات الدموية في حامل شعري على مجتذب الإبرة وتأمينه باستخدام مكسرات الجناح.محاذاة مركز الشعيرات الدموية مع عنصر التسخين. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، اختر الإعدادات المناسبة على مجتذب الإبرة. باستخدام مجهر تشريح ، قم بإجراء اختبار مراقبة الجودة.اضغط على الإبر في المعجون أفقيا مع تعليق أطراف الإبرة في الهواء. غطي الإبر بالغطاء وخزنيها حتى الاستخدام. باستخدام أطراف تحميل الإبرة المرفقة بماصة دقيقة ، ارسم ميكرولتر واحد من محلول الحقن في الطرف دون حبس فقاعات الهواء.باستخدام القفازات ، أمسك الإبرة بيد واحدة مع توجيه طرفها بعيدا وأدخل طرف التحميل فيها. قم بتوزيع السائل بالقرب من طرف الإبرة ، وقم بإزالة الماصة وأمسك الإبرة عموديا حتى يتدفق السائل إلى الطرف. قم بتغطية الحاوية بورق الألومنيوم دون إتلاف أطراف الإبرة لمنع تبييض الأصباغ.باستخدام ماصة نقل ، أو ماصة صغيرة ، ضع قطرة صغيرة من غراء السباتان في وسط زلة غطاء مستطيلة ، واتركها تتبخر. لإزالة المشيمة ميكانيكيا ، قم بتغطية صفيحة الجنين المسنة بشكل مناسب بطبقة رقيقة من زيت الهالوكربون 27 لتحويل قشر البيض شفافا. عرض اللوحة تحت مجهر تشريح مع إضاءة عابرة لتأكيد مرحلة الجنين وتحديد الأجنة في مراحل الانقسام.باستخدام ملاقط دقيقة ، التقط جنينا من المرحلة المطلوبة عن طريق الاستيلاء على الزوائد الظهرية ونقلها إلى الشريحة الزجاجية المعدة المغطاة بشريط على الوجهين. ضع الجنين على الشريط وقلل من نقل الزيت. لف الجنين بلطف عبر سطح الشريط عن طريق الدفع بجانب طرف الملقط دون دسه مباشرة.استمر في لف الجنين حتى تلتصق المشيمية بالشريط وتتشقق. بعد تشققات المشيمة ، استمر في لف الجنين لفصله عن الكوريون ، الذي لا يزال عالقا بالشريط. لف الجنين مرة أخرى على الوتر ، وهو أقل لاصقة من الشريط.افركي الجنين بلطف باستخدام الملقط حتى يعلق على الملقط لنقله. ثم ، انقل الجنين إلى زلة الغطاء واجعله على اتصال بالغراء لتثبيت الجنين في مكانه ، وفصله عن الملقط. اضبط اتجاه الجنين على قسيمة الغطاء.دع الأجنة تجف لمدة خمس إلى 12 دقيقة عن طريق وضع الغطاء مع الأجنة في غرفة التجفيف وختمها. اخلع الغطاء من الغرفة وضع قطرة من زيت الهالوكربون 700 ، تغطي الأجنة لمنع المزيد من الجفاف. فحصها تحت نطاق التشريح والمضي قدما في الحقن المجهري إذا تم تجفيف الأجنة بشكل صحيح.ضع هدف 4X في مسار الضوء وباستخدام مقبض التركيز البؤري على المجهر ، اضبط الأجنة في التركيز. حرك الأجنة أفقيا إلى مركز مجال الرؤية باستخدام عناصر التحكم في المرحلة. حافظ على الأجنة على حافة مجال الرؤية وقم بتحريكها استعدادا لخفض الإبرة.البقاء مع نفس المستوى البؤري ، وخفض طرف الإبرة والتأكد من أنها مرئية في مجال الرؤية جنبا إلى جنب مع الأجنة. تحقق من أن الإبرة تعمل عن طريق توزيع بعض محلول الحقن في زيت الهالوكربون 700. إذا نجحت ، فستظهر فقاعة من المحلول في الزيت بالقرب من طرف الإبرة.باستخدام عناصر التحكم في المرحلة ، حرك الجنين نحو طرف الإبرة حتى يثقب الطرف الجنين بلطف ويدخل فيه. في الوقت نفسه ، ابدأ تدفق محلول الحقن حتى تظهر بقعة واضحة عابرة في موقع طرف الإبرة ، مما يشير إلى نقل المحلول بنجاح إلى الجنين. قم بتأمين انزلاق الغطاء على المجهر البؤري باستخدام حامل الشريحة.توخ الحذر لأن الغطاء هش. افحص الأجنة باستخدام وظيفة التألق على المجهر البؤري بهدف 40X وتأكد من أن الفلورو 4 في الجنين مرئي قبل المتابعة. بالنسبة للتصوير المباشر، خلال المراحل المتزامنة، اضبط حجم الصورة على 512 × 512 بكسل، ومتوسط الخط من ثلاثة، ومعدل إطارات قدره 0.1 إطار في الثانية.بعد حقن صبغة BODIPY 493 503 ، تم توطينها في الموقع الذي تم فيه إدخال طرف الإبرة ثم نشرها بجوار موقع الحقن. بعد 24 دقيقة ، انتشرت الصبغة بعد نقطة منتصف الجنين. تمت مراقبة حركة العضية عن طريق حقن الجنين ب BODIPY 493 503 و LysoTracker Red.كشف تحليل قياس سرعة صورة الجسيمات أن المحتويات الجنينية تقاربت في المنطقة الوسطى من الجنين ، حيث يتدفق السيتوبلازم إلى داخل الجنين. يوفر وضع العلامات على ER ، باستخدام ER-Tracker Green ، دقة حية للغلاف النووي ، مما يسمح بتصور مراحل دورة الخلية الرئيسية. تم حقن الجنين ب MitoView 633 في مرحلة الأديم الأرومي وتم تصويره بعد أربع ساعات.تظهر الصورة خلية عصبية جلدية لجنين في امتداد الفرقة الجرثومية. تم حقن جنين خلوي بمزيج من BODIPY 493 503 و SiR Tubulin ، مما يدل على أن قطرات الدهون تتحرك في اتجاهين على طول الأنابيب الدقيقة. يجب تجفيف الجنين جزئيا بحيث يمكن حقن السائل.سيؤدي الجفاف القليل جدا إلى تسرب الجنين عند حقنه ، والكثير من الجفاف سيقتل الجنين. يمكن وصف مقاطع الفيديو للعضيات المتحركة عبر تقنيات تحليل الصور المتنوعة. يكشف تتبع الجسيمات عن سلوك العضيات الفردية ، ويكشف قياس سرعة تصوير الجسيمات عن التدفق السائب.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

تصور آثار الضرر التأسدي على غرف البيض Drosophila باستخدام التصوير الحي

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

التصوير البؤري وفائق الدقة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي أثناء تكوين بويضات ذبابة الفاكهة

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation (Video) | JoVE 

جمع أجنة ذبابة الفاكهة وإعدادها للتحفيز البصري الوراثي