Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Vi takker Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang og Roger White for deres kommentarer til manuskriptet. Vi takker Patrick Oakes, Stefano Di Talia og Victoria Deneke for at dele deres ekspertise om, hvordan man udfører PIV-analyse. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud F31 HD100127 (til MD K.) og R01 GM102155 (til M. A. W.).

<ol>
	<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li><li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11.">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=As+the+fat+flies:+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos.">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li><li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos.">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li><li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li><li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila.">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li><li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos.">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021 (2018).</li><li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+patterns,+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library.">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li><li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells:+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis,+autophagy,+and+mitochondrial+fusion+dynamics.">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos.">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+collection.">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999)</li><li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).</li><li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+size,+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species.">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance.">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy.">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li><li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy.">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li><li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs.">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li><li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid.">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Drosophila embryoet er en kraftfuld og bekvem model til at studere grundlæggende spørgsmål i cellulær og organismebiologi. Dens relative enkelhed, kraftfulde genetik og lille størrelse gør det til et fremragende system til billeddannelse af både cellulære processer og udvikling. Her er en standard mikroinjektionsprotokol tilpasset for at muliggøre FP-brug i embryoner. Denne tilgang giver mulighed for fluorescerende billeddannelse af specifikke cellulære strukturer uden behov for genetisk kodede fluoroforer, hvilket åbner mange genetiske baggrunde for billeddannelse. Kombination af flere farvestoffer plus strategisk udvalgte fluorescerende mærkede proteiner kan åbne multikanals levende billeddannelse, der spænder over hele spektret af synligt lys.
Kritiske trin i protokollen: Denne protokol bruger BODIPY 493/503 til at mærke ED'er. Denne tilgang kan let tilpasses til at markere andre cellulære strukturer. Til efterfølgende billedanalyse er en af de vigtigste faktorer signal-støj-forholdet, dvs. farvestoffets lysstyrke sammenlignet med baggrundssignalet. Lysosomer er blevet afbildet med succes (LysoTracker Red, 1 mM) såvel som mitokondrier (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) og mikrotubuli (SiR tubulin, 200 nM i DMSO), som vist i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5. Derudover er æggeblomme vesikler autofluorescerende og afgiver blåt lys ved UV-excitation (billede ved hjælp af 405 nm som excitationsbølgelængde (figur 6)). For andre farvestoffer skal du sigte mod, at farvestofkoncentrationen skal være 100-1.000x af, hvad der ville være nødvendigt for farvning af dyrkede celler levende; dette svarer til koncentrationen af en stamopløsning, der ville blive fortyndet i cellekulturmedier. Da denne protokol kræver en injektion på 100 fL, og Drosophila-embryoet er ca. 9 nL i volumen18, vil disse farvestofkoncentrationer i gennemsnit være en intern embryonal koncentration på under 1/100 af, hvad der er til stede i cellekulturmediet. Midlertidigt vil den lokale koncentration være højere på injektionsstedet, hvilket er mest relevant for FP'er, der ikke diffunderer godt (dvs. mitokondrielle farvestoffer og SiR-tubulin). For disse FP'er skal du starte ved de anbefalede høje koncentrationer; hvis uventet død observeres, fortyndes successivt to gange, indtil et acceptabelt kompromis mellem overlevelse og signalstyrke er nået.
Ved samtidig injektion af flere farvestoffer skal begge farvestoffer enten være i samme opløsningsmiddel, eller både opløsningsmidler og farvestoffer skal være kompatible med blandingen (alkoholkoncentrationer på over ~10% anbefales ikke).
Nålens kvalitet er afgørende for succesen med denne procedure, da spidsen skal være så fin som muligt. Ellers kan skader fra injektionssåret kompromittere den efterfølgende udvikling af embryoet. Da kommercielle nåletrækkere er forskellige, er det vigtigt at følge producentens forslag og afprøve flere trækparametre, indtil den ønskede form er opnået. Det er vigtigt at udføre kvalitetskontroltrin 1.1.3, da arbejde med en revnet, hakket eller stor borenålespids vil gøre den vellykkede injektion vanskeligere eller endda umulig.
Embryoet skal delvist udtørres, så der kan tilsættes yderligere mængder væske under injektionen. Hvis embryoet er underudtørret, kommer nålen ikke let ind, og cytoplasma sprøjter ud, når nålen trænger ind, eller når opløsningen injiceres. Hvis embryoet er overudtørret, vil det se deflateret ud og vil ikke udvikle sig ordentligt. Den nøjagtige tørretid afhænger af lokale forhold, f.eks. luftfugtighed, og kan ændre sig fra dag til dag. Det skal bestemmes empirisk for hver session.
Embryoets evne til at overleve efter mikroinjektion afhænger kritisk af nålens kvalitet, korrekt udtørring og begrænsning af injektionsvolumen til mindre end 1 pL (ideelt 100 fL). Så længe disse parametre er optimeret, er der ingen signifikant toksicitet, når de beskrevne farvestoffer injiceres i de anbefalede koncentrationer. Hvis embryoner overlever udtørrings- og injektionstrinnene, udvikler de sig typisk med succes godt ind i kimbåndsforlængelse, en undtagelse er mikrotubuli- og ER-sonderne, der forårsagede cellulariseringsdefekter på høje niveauer (100 fL injektion af lagerkoncentrationen af hver). Testning fandt ingen åbenlyse udviklingsfejl, når DMSO, vand og blandinger af de to blev injiceret ved de anbefalede volumener med en embryooverlevelsesrate gennem kimbåndsforlængelse på ~ 75% eller mere. Injektionsvolumener mere end over 1 pL forårsagede defekter og embryoner injiceret med ~ 4 pL volumener udviklet til mindre end 1 time. Derfor skal injektionsvolumenerne holdes lave, hvilket betyder, at farvestofkoncentrationerne skal være høje.
Generelt anbefales injektioner langs embryoets laterale kant, da de resulterer i mindst mulig skade. Det kan dog være nødvendigt at justere injektionsstedet afhængigt af de diffusive egenskaber hos de anvendte FP'er. BODIPY 493/503 og LysoTracker diffunderer hurtigere over hele embryoet end Lipid Spot 610 (et andet farvestof til at markere ND'er), mens SiR-Tubulin og Mitoview 633 aldrig diffunderer fuldt ud over embryoet (billeddannelse så sent som 7 timer efter injektion). Således kan injektion i eller i nærheden af det interessante sted være nødvendigt. Ved injektion i de forreste eller bageste områder anbefales en særlig fin nål.
Billedoptagelse er afhængig af konfokal mikroskopi for optisk at sektionere og løse små organeller og alle cytoskeletale komponenter. Teknikker, der kræver analyse af mange billeder (f.eks. STORM eller PALM), fungerer ikke, fordi det embryonale indhold er i bevægelse, og fluoroforerne ikke er optimeret til fotoskift. Epifluorescensmikroskopi mangler den laterale og aksiale opløsning til at udarbejde de fleste organeller og mindre cellulære strukturer. Af disse grunde anbefales det kraftigt at bruge et konfokalmikroskop eller anvende lysarkteknologi.
Billedanalysens reproducerbarhed afhænger i høj grad af konsistente billeddata. For den største chance for succes kræves optimering af injektionsteknikken og billedoptagelse. Etablering og øvelse af en teknik, hvor farvestoffet /farverne af interesse, injektionsstedet, embryoets alder, injektionsvolumen og erhvervelsesopsætning alle er konsistente, genererer de mest robuste data til billedanalyse.
Ændringer og fejlfinding af metoden Denne protokol demonstrerer en metode til analyse af bulkstrømmen af LER'er i spaltningsstadieembryoner ved hjælp af partikelbilledvelocimetri. Den samme tilgang kan anvendes til andre organeller, andre udviklingsstadier og andre analysemetoder. For eksempel viser figur 2 analyse af LER og sure organeller, der flyder i de syncytiale stadier af embryogenese, visualiseret ved co-injektion bodipy 493/503 og LysoTracker Red. Yderligere vellykket billeddannelse af LD-bevægelse i embryoner op til 7 timer efter befrugtning er opnået; disse embryoner bevarer injektionssåret, men er i stand til at udvikle sig i flere timer.
Data indsamlet ved hjælp af denne protokol er blevet brugt til partikelbilledvelocimetri, men mange andre analyseteknikker er tilgængelige. For eksempel kan partikelsporingsprogrammer som dem, der findes i ImageJ, Imaris eller manuel sporing, bruges til at opnå hastigheder og retningsbestemtheder af bevægelige strukturer. Bemærk, at de fleste sådanne sporingssoftware er bygget til at arbejde med data fra plane cellekultursystemer og ikke altid tilpasser sig godt til 3D-strukturer som Drosophila-embryoet . For at kunne producere partikelsporingsdata af bedste kvalitet skal der desuden afbildes flere Z-planer; dette bør være muligt, hvis erhvervelsestiderne for billedstakken er under ~ 2 s. Dette benchmark bør kunne nås på roterende skivekonfokal, gitterlysark og nylige laserscanningskonfokale systemer. Muligheden for partikelsporing for rigelige organeller som LD'er, mitokondrier og lysosomer er imidlertid lav, da mængden af positivt signal i et synsfelt er for høj til de nuværende sporingsmetoder. Sporing af mindre rigelige strukturer som kerner eller æggeblomme vesikler kan være muligt. PIV til flowanalyse fungerer godt for ND'er og sure organeller i spaltningsstadier, fordi begge organeller bevæger sig frit. Organeller som kerner, ER og mitokondrier er bundet til andre cellulære strukturer og bevæger sig således ikke frit og er ikke egnede til softwareanalyse, der antager fri bevægelse. Efterforskeren bør vælge de teknikker, der passer bedst til organellen af interesse.
Under de syncytiale og cellulære blastodermstadier bevæger LED'er (såvel som nogle andre organeller) sig langs radialt orienterede mikrotubuli5. Det er derfor muligt at finde tværsnitsbilleder (som i figur 5), hvor enkelte mikrotubuli er i fokus i lange afstande, hvilket muliggør partikelsporing i 2D. Da disse optiske planer er dybt inde i embryoet, reduceres den samlede signalstyrke, og signal-støj-forholdet reduceres.
Til sporingsanalyse kan billeddannelse så hurtigt som muligt afsløre vigtige detaljer om bevægelsen og dermed om det bevægelige maskineri. For eksempel er lipid-dråbebevægelse en blanding af to bevægelige tilstande, langsom kort bevægelse (~ 200 nm / s; gennemsnitlig rejseafstand ~ 100 nm) og hurtig-lang bevægelse (~ 450 nm / s; gennemsnitlig rejseafstand ~ 1.000 nm)19; således, hvis billeder tages hvert sekund eller endnu sjældnere, bliver den langsomme-korte tilstand uopdagelig. Imidlertid inducerer hyppig billeddannelse også fluoroforblegning og fototoksicitet. Billeddannelsesforholdene skal derfor justeres afhængigt af det nøjagtige spørgsmål, der skal behandles.
Begrænsninger af metoden Afhængigt af det ønskede farvestof kan metoden begrænses af kompatibiliteten mellem farvestofopløseligheden og injektionsopløsningens toksicitet. Alkoholer som isopropanol og ethanol er vanskelige at håndtere i en nål på grund af deres lavere viskositet og synes at beskadige cellulære komponenter og dræbe embryoet.
Metoden er heller ikke velegnet til at visualisere de tidligste trin i embryogenese, fordi det tager 30+ minutter at forberede embryonerne til injektion. Ved stuetemperatur er embryoets indledende cellecyklusser kun ~ 10 minutter lange hver; så selv hvis man skulle vælge et nybefrugtet æg i trin 5.2.3, ville de første par cellecyklusser allerede være afsluttet, når embryoet er klar til billeddannelse.
Belysning med lys i UV/blå-området er betydeligt mere fototoksisk end ved længere bølgelængder. Under sådanne forhold (f.eks. at følge autofluorescerende æggeblomme vesikler; Figur 6), skal man begrænse billedbehandlingstiden (hvilket fører til kortere tidsserier) eller bruge lavere lasereffekt (hvilket resulterer i et reduceret signal-støj-forhold).
Efter cellularisering har farvestoffer injiceret på et bestemt sted en tendens til at diffundere dårligt, da de skal krydse mange cellemembraner. Dette begrænser observationsområdet i senere udviklingsstadier.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder Bevægelsen af LED'er og andre lipidholdige organeller i tidlige embryoner kan visualiseres med genetisk kodede fluoroforer, etiketfrie teknikker og ved introduktion af FP'er. Sidstnævnte kan opnås ved permeabilisering af vitellinmembranen12 eller mikroinjektionsmetoden, der diskuteres her.
Genetisk kodede fluoroforer er alsidige markører, hvis niveauer typisk er meget reproducerbare fra embryo til embryo. De har dog lavere kvanteudbytter og blegemiddel lettere end FP'er. Typisk er de kun tilgængelige i en eller to mærkede versioner (f.eks. GFP eller mCherry), hvilket begrænser valget af, hvilke strukturer der kan afbildes samtidigt. FP'er findes der derimod ofte i et stort udvalg; for eksempel er forskellige lipiddråbespecifikke farvestoffer tilgængelige med emissionsspektre fra Autodot i UV / blå spektret til Lipidtox og LipidSpot 610 i det langt røde spektrum. FP'er kan også påføres direkte på enhver stamme af interesse og kræver derfor ikke belastningskonstruktion for f.eks. at indføre den ønskede organelmarkør i en mutant stamme af interesse. Denne fordel er særlig udtalt, når flere strukturer skal mærkes samtidigt; i stedet for tidskrævende krydsninger, der spænder over flere generationer, kan dette opnås på en enkelt dag ved at blande de relevante farvestoffer og introducere dem på samme tid. Endelig, hvis cellulære processer skal undersøges med farmakologisk hæmning, kan lægemidler og farvestoffer introduceres sammen.
Etiketfrie metoder er meget kraftfulde tilgange til påvisning af specifikke cellulære strukturer. For eksempel kan LER'er specifikt påvises i tidlige embryoner ved tredjeharmonisk generationsmikroskopi20 eller ved femtosekund stimuleret Raman Loss mikroskopi21. Ligesom FP'er kan disse tilgange anvendes i enhver genetisk baggrund, og fordi de ikke forårsager blegning, giver de potentielt mulighed for hurtigere billedoptagelse. De er dog typisk begrænset til specifikke organeller og understøtter således ikke i sig selv multiplexbilleddannelse; de kræver også specialiserede mikroskoper.
Der er to generelle strategier for at indføre små molekyler i embryoner. Den ene er den mikroinjektionsmetode, der anvendes her; den anden er kemisk (terpen) behandling for at permeabilisere vitellinmembranen. Sidstnævnte tilgang12 er mindre involveret end mikroinjektion, men også mere variabel fra embryo til embryo. Derudover kompromitteres beskyttelsen fra vitellinmembranen efter permeabilisering, og det egentlige embryo er tilgængeligt for det ydre medium, hvilket gør det mere udfordrende at holde det i live. Mikroinjektion er meget mindre tilbøjelig til at afspore embryonal udvikling end permeabilisering. Permeabilisering anbefales dog, hvis mange embryoner skal overvåges samtidigt, f.eks. til lægemiddelscreeningsformål. For at følge bevægelsen af cellulære strukturer og opnå reproducerbare billedserier, der er egnede til billedanalyse, er mikroinjektion den valgte metode.
Metodens betydning og potentielle anvendelsesmuligheder inden for specifikke forskningsområder Drosophila embryoet er et vigtigt modelsystem til at studere mange cellebiologiske og udviklingsmæssige processer 1,5,6. Mærkning af organeller med fluorescerende proteiner har ydet store bidrag til forståelsen af, hvordan det tidlige embryo udvikler sig, hvordan forskellige organeller trafikerer, og hvordan sådan handel moduleres udviklingsmæssigt og genetisk. Imidlertid begrænser deres tilbøjelighed til blegemiddel og udfordringerne ved at generere stammer, hvor flere organeller er mærket med forskellige farver, anvendelsen af denne tilgang. Brugen af FP'er introduceret ved mikroinjektion løser mange af disse udfordringer og kan endda kombineres med fluorescerende mærkede proteiner. Denne teknik muliggør billeddannelse af flere organeller, cellestrukturer og cytoskeletale komponenter i enhver genetisk baggrund. Som følge heraf kan flere genotyper sammenlignes via levende billeddannelse, hvilket gør det muligt at bestemme effekten af mutationer på handel med flere organeller.
Denne protokol viser FP-injektionsmetoden for embryoner af Drosophila melanogaster, men i princippet gælder denne tilgang for alle insektæg, for hvilke der er etableret mikroinjektionsteknikker, herunder andre arter af Drosophila, crickets22 og bladlus23.

Vitale farvestoffer og molekylære sonder er kraftfulde værktøjer til at afbilde specifikke cellulære strukturer og organeller levende. I Drosophila-embryoet viser mange forskellige organeller cytoskeletdrevet lokalisering 1,2,3,4, men anvendelsen af disse små molekyler er udfordrende, fordi æggeskallen er uigennemtrængelig for mange af dem. Denne protokol beskriver en metode til at anvende fluorescerende sonder (FP'er) i levende embryoner via mikroinjektion for at opdage storstilet handel med organeller. Proceduren omfatter fremstilling af injektionsopløsningen, ægopsamling og fremstilling af embryoner, mikroinjektion, billeddannelse og billedanalyse.
Dramatiske rumlige omlejringer af organeller er almindelige i mange animalske oocytter, æg og embryoner, dels på grund af den store størrelse af disse celler. I Drosophila embryoet bevæger lipiddråber (LK'er) og æggeblomme vesiler sig for eksempel mod embryocentret lige før cellularisering5. Denne bevægelse afhænger af mikrotubuli og efterlader en ~ 40 μm region rundt om periferien af embryoet udtømt af de to organeller. Under tidligere spaltningsstadier transporteres mange organeller af cytoplasmatiske strømme, der drives af actin-myosinbaserede sammentrækninger på embryooverfladen6. Selvom embryoner af mange arter udviser lignende omlejringer, er Drosophila embryoet særligt velegnet til at følge disse processer ved billeddannelse, fordi det udvikler sig eksternt ved standard laboratorie 'stuetemperatur', er relativt gennemsigtigt, lille nok til at passe på de fleste mikroskopopsætninger og kan manipuleres ved hjælp af kraftfulde genetiske værktøjer.
For nogle organeller er fluorescerende mærkede proteiner tilgængelige, der specifikt mærker disse strukturer. For eksempel er LSD-2 (også kendt som dPLIN2) et protein, der i embryoner specifikt er rettet mod LDs7. Flyvelinjer er tilgængelige, der bærer enten inducerbare transgener, der koder for en fusion mellem grønt fluorescerende protein (GFP) og LSD-28 eller en genfælde, hvor gult fluorescerende protein (YFP) indsættes i det kodende område af det endogene LSD-2-gen 9,10. Denne tilgang har imidlertid begrænsninger, herunder at disse fusionsproteiner har lave kvanteudbytter og har tendens til let at blege. Derudover kan mærkning af flere forskellige strukturer samtidigt være udfordrende: For mange organeller er der i øjeblikket kun en type fluorescerende tag (ofte GFP eller mCherry), så billeddannelse af to organeller på samme tid kan kræve nye transgener eller indsættelser; Selvom kompatible tags er tilgængelige, kan det også kræve tidskrævende kryds at introducere dem i en enkelt stamme. Det gør det også mindre bekvemt at bruge de mange kraftfulde genetiske ressourcer, f.eks. hvis to organellemarkører, en Gal4-driver og en inducerbar RNAi-konstruktion alle skal være til stede i den samme mor.
I princippet kan disse begrænsninger overvindes ved brug af FP'er, herunder vitale farvestoffer (f.eks. LysoTracker til mærkning af lysosomer), molekylære sonder (f.eks. SiR-tubulin til mærkning af mikrotubuli) og fluorescerende mærkede biologiske molekyler (f.eks. C12 BODIPY til sondefedtsyremetabolisme11). Fra brug i dyrkede celler er de typisk velvaliderede som kraftfulde værktøjer til at undersøge cellulær biologi. FP'er er alsidige, har overlegne fotoegenskaber og er kompatible med fluorescerende proteiner. Flere farvestoffer kan blandes og påføres samtidigt, ofte med fordelene ved adskillelse i de violette / blå og langt røde områder af spektret og små Stokes-skift, hvilket forhindrer kanalblødning igennem. Små Stokes-skift giver mulighed for samtidig optagelse af flere billedkanaler, hvilket muliggør sporing af flere organeller på én gang. Endelig kan de ligeledes anvendes til mærkning af organeller i embryoner af andre Drosophila-arter eller endda andre insekter, hvor der ikke kan være fluorescerende mærkede proteiner til rådighed.
Imidlertid kan de fleste af disse FP'er ikke krydse den udførlige æggeskal af Drosophila-embryoet . Den består af fem lag: tre ydre chorionlag (chorion), der forhindrer mekanisk skade plus et voksagtigt lag omkring vitellinmembranen, der skaber en kemisk barriere12. For nemheds skyld vil kombinationen af det voksagtige lag og vitellinmembranen blive omtalt som "vitellinmembranen" nedenfor. For at omgå æggeskallen tilpasser denne protokol en etableret embryomikroinjektionsmetode til at indføre FP'er i Drosophila-embryoet . Protokollen beskriver, hvordan man overvåger den cytoplasmatiske strøm af LER'er i spaltningsstadieembryoner. Det omfatter fremstilling af injektionsnåle og ægopsamlingsbure, processen med ægopsamling og mekanisk fjernelse af korionen. Det går over, hvordan man mikroinjekterer og afbilder embryonerne, og hvordan man analyserer bulkstrømmen af ND'er ved hjælp af partikelbilledvelocimetri (PIV, tilpasset fra6). Det giver råd om fejlfinding for at sikre embryooverlevelse og skabe det bedste system til billeddannelse. Også diskuteret er, hvordan protokollen kan ændres til samtidig at afbilde LD'er og mikrotubuli eller at anvende den til undersøgelse af andre organeller, herunder lysosomer, mitokondrier, æggeblomme vesikler og det endoplasmatiske retikulum (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

Tidlige Drosophila embryoner er store celler, der indeholder et stort udvalg af konventionelle og embryospecifikke organeller. I løbet af de første tre timer af embryogenese gennemgår disse organeller dramatiske bevægelser drevet af aktinbaseret cytoplasmatisk streaming og motordrevet handel langs mikrotubuli. Udviklingen af en lang række små, organelspecifikke fluorescerende sonder (FP'er) gør det muligt at visualisere en bred vifte af forskellige lipidholdige strukturer i enhver genotype, hvilket muliggør levende billeddannelse uden at kræve en genetisk kodet fluorofor. Denne protokol viser, hvordan man injicerer vitale farvestoffer og molekylære sonder i Drosophila embryoner for at overvåge handel med specifikke organeller ved levende billeddannelse. Denne fremgangsmåde demonstreres ved mærkning af lipiddråber (LD'er) og efter deres bulkbevægelse ved partikelbilledvelocimetri (PIV). Denne protokol giver en strategi, der er egnet til undersøgelse af andre organeller, herunder lysosomer, mitokondrier, æggeblomme vesikler og ER, og til sporing af bevægelsen af individuelle LD'er langs mikrotubuli. Brug af kommercielt tilgængelige farvestoffer bringer fordelene ved adskillelse i de violette / blå og langt røde områder af spektret. Ved multiplex co-mærkning af organeller og/eller cytoskeletale elementer via mikroinjektion er alle de genetiske ressourcer i Drosophila tilgængelige for undersøgelser af menneskehandel uden behov for at indføre fluorescerende mærkede proteiner. I modsætning til genetisk kodede fluoroforer, som har lave kvanteudbytter og blegemiddel let, giver mange af de tilgængelige farvestoffer mulighed for hurtig og samtidig indfangning af flere kanaler med høje fotonudbytter.

Efter injektion vil farvestoffet kun blive lokaliseret på det sted, hvor nålespidsen blev indsat. Farvestoffet diffunderer derefter væk fra injektionsstedet afhængigt af dets diffusive egenskaber. Figur 1 viser injektion af BODIPY 493/503, kort efter injektion (panel A) og 24 min senere (panel B). Efter 24 minutter er farvestoffet nået nogenlunde til midtpunktet af fosterets lange akse.
Analyse af organelmotilitet kan opnås gennem farvestofinjektioner og time-lapse-billeddannelse. I figur 2 blev et embryo co-injiceret med BODIPY 493/503 (figur 2A) og LysoTracker Red (figur 2B) og afbildet ved hjælp af laserexcitation ved henholdsvis 488 og 596 nm. Dette embryo blev derefter time-lapse afbildet (en ramme hver 30 s i 30 min, 5 min analyseret). Tidsserien blev derefter kørt gennem PIV-analyse, hvis output er vist via strømlinjer i figur 2A,B. Bemærk, at strømlinjerne ikke repræsenterer banen for individuelle partikler, men den cytoplasmatiske strøm udledes af at analysere alle partiklerne i det område af cytoplasmaet. Gennem mærkning af to uafhængige cellulære strukturer (ND'er og sure organeller) finder PIV-analysen lignende strømme, hvor begge etiketter konvergerer på det centrale område af embryoet, hvor cytoplasmaet strømmer ind i embryoets indre6.
Aktuelt tilgængelige FP'er tillader mærkning af mange andre organeller og cellulære strukturer. Figur 3 viser mærkningen af ER via ER tracker Green. ER tracker giver en god opløsning af den nukleare konvolut, hvilket muliggør visualisering af større cellecyklusfaser. ER tracker Green er afbildet ved hjælp af 488 nm excitation.
Mærkning af mitokondrierne er vanskelig, da de fleste testede farvestoffer synes at være fanget i den første mitokondrier, de kommer ind i. På den anden side blev der ikke påvist tegn på farvestoftoksicitet, hvilket gjorde det muligt at følge mærkede mitokondrier gennem cellularisering og den ektodermale nukleare cyklus 15. Figur 4 viser en ektodermal celle flere timer efter injektion med Mitoview 633 (excitationsbølgelængde 633 nm).
BODIPY, Lysotracker og LipidSpot er robuste og kan bruges til at erhverve ~ 500+ billeder ved 512 x 512, linjegennemsnit 3, billedhastigheder fra 1 / s til 0,1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulin og de nævnte mitokondrielle farvestoffer er mindre robuste og giver ~ 50-200 billeder under de samme forhold.
Begyndende ved blastodermstadier bevæger LED'er sig tovejs langs mikrotubuli, drevet af de modsatte polaritetsmotorer kinesin-1 og cytoplasmatisk dynein5. Denne bevægelse kan visualiseres ved at co-mærke LER og mikrotubuli via injektion af både BODIPY 493/503 og SiR-Tubulin (figur 5). Da LD'er ofte vender deres bevægelsesretning (da de skifter mellem kinesin-1 og cytoplasmatisk dynein), fanger højere billedhastigheder under erhvervelse bedre kritiske detaljer om LD-motilitet.
Levende billeddannelse af autofluorescerende æggeblomme vesikler er mulig uden nogen form for farvestofinjektion (figur 6). Autofluorescensen er imidlertid svag, og excitationslaseren er fototoksisk. Således har levende billeddannelse af autofluorescerende æggeblomme et dårligt signal-støj-forhold i forhold til farvestofinjektion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> Figur 1: Diffusion af BODIPY 493/503 gennem embryoet. Farvestoffet blev injiceret langs sidekanten mod den forreste ende (øverst til højre) og diffunderer fra dette injektionssted ind i embryoet og mærker LED'er. (A) Farvestoffet har diffunderet gennem dele af embryoet ved siden af injektionsstedet. (B) Ca. 24 min/2 nukleare cyklusser senere har farvestoffet diffunderet forbi embryonets midtpunkt. Vægtstang: 100 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> Figur 2: Partikelbilledvelocimetri (PIV) for ND'er og sure organeller. Et embryo blev injiceret med både BODIPY 493/503 og LysoTracker Red. (A) BODIPY kanal. (B) LysoTracker Rød kanal. (A',B') Strømlin diagrammer genereret ved PIV-analyse af de to kanaler, der genereres fra 10 sekventielle rammer, herunder dem, der er vist i A og B. A' svarer til strømmen af LER'er, og B' svarer til strømmen af sure organeller. Bemærk, at både A ' og B' viser en sammenløb til venstre for midten, hvor embryonalt indhold strømmer ud af synsplanet, ind i midten af embryoet. Bemærk også, at BODIPY har diffunderet mere end LysoTracker, da forskellige farvestoffer har forskellige diffusive egenskaber. Vægtstang: 100 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> Figur 3: ER tracker etiketter syncytial nukleare divisioner. Et syncytial blastoderm embryo blev mikroinjiceret med ER tracker og en del af overfladen blev afbildet over tid. (A) Spindelsamling under en nuklear division. B) Afskæring af den nukleare kuvert under samme opdeling. C) Efterfølgende interfase. D) Begyndelsen af den næste opdeling er angivet ved centrosomudseende (forekomst af cirkulære ER-frie områder, markeret med pilespidser). Bemærk den gradvise farvestofblegning. Excitation bølgelængde: 488 nm. Skalabjælke: 5 μm. A: indledende ramme, B: 3 min forløbet, C: 10 min forløbet, D: 13 min forløbet. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> Figur 4: Mitoview 633 mærkning af mitokondrier. Et embryo blev injiceret med Mitoview 633 under syncytial blastoderm-stadiet og afbildet 4 timer senere efter cellularisering. Billedet viser en neuroektodermal celle af et embryo i kimbåndsudvidelse. Vægtstang: 5 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> Figur 5: Co-mærkning af LER'er og mikrotubuli. Et cellulariserende embryo blev injiceret med en blanding af BODIPY 493/503 (gul A,B,C) og SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' viser de fusionerede kanaler. Panelerne A, A' og A'' viser den oprindelige ramme, panelerne B, B' og B'' viser rammen efter 5 s, og panelerne C, C' og C'' viser rammen efter 10 s. Vægtstang: 5 μm. En 512 x 512 ramme (linje gennemsnit 3) blev erhvervet hver 2,5 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> Figur 6: Billeddannelse af æggeblomme vesicle autofluorescens under syncytial spaltningsfaser. (A) Ved starten af erhvervelsen. (B) Efter 8 min. (C) Efter 16 min. Excitation bølgelængde: 405 nm. Lav excitationsintensitet blev brugt til at holde embryoet i live. Vægtstang: 100 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

I det tidlige Drosophila embryo er mange organeller bevægelige. I princippet kan de afbildes levende via specifikke fluorescerende sonder, men æggeskallen forhindrer direkte påføring på embryoet. Denne protokol beskriver, hvordan man introducerer sådanne sonder via mikroinjektion og derefter analyserer bulkorganelbevægelse via partikelbilledvelocimetri.

Visualisering af cytoskeletafhængig handel med lipidholdige organeller i drosophilaembryoner

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

I det tidlige Drosophila embryo gennemgår mange organeller stor skala bevægelse. Vores protokol beskriver, hvordan man overvåger denne bevægelse ved hjælp af fluorescerende farvestoffer udviklet til cellekultur. Sammenlignet med fluorescerende proteiner er kommercielt tilgængelige fluorescerende sonder lysere og spænder over et bredere spektrum af spektret.De giver mulighed for multiplex colabeling og kan bruges i enhver genetisk baggrund. Det kræver øvelse og forsøg og fejl at vide, hvor lang tid man skal udtørre embryoner, så de enten brister under injektion eller tørrer op og holder op med at udvikle sig. Til at begynde med skal du begynde at forberede injektionsnålene ved at placere kapillæren i en kapillærholder på nåletrækkeren og fastgøre den ved hjælp af vingemøtrikker.Juster midten af kapillæren med varmeelementet. I henhold til producentens anvisninger skal du vælge passende indstillinger på nåletrækeren. Udfør kvalitetskontroltesten ved hjælp af et dissekeringsmikroskop.Tryk nålene ind i kittet vandret med nålespidserne suspenderet i luften. Dæk nålene med låget og opbevar dem indtil brug. Brug nålefyldningsspidser, der er fastgjort til en mikropipette, til at trække en mikroliter af injektionsopløsningen ind i spidsen uden at fange luftbobler.Brug handsker til at holde nålen i den ene hånd med spidsen pegende væk og indsæt læssespidsen i den. Dispenser væsken nær nålespidsen, fjern pipetten og hold nålen lodret, indtil væsken strømmer til spidsen. Dæk beholderen med aluminiumsfolie uden at beskadige nålespidserne for at forhindre blegning af farvestofferne.Brug en overførselspipette eller en mikropipetter til at placere en lille dråbe heptanlim i midten af et rektangulært dæksel, og lad det fordampe. For at fjerne korionen mekanisk skal du dække den passende ældede embryoplade med et tyndt lag halocarbonolie 27 for at gøre æggeskallen gennemsigtig. Se pladen under et dissektionsmikroskop med transbelysning for at bekræfte embryostadiet og vælge embryonerne i spaltningsstadier.Brug en fin pincet til at hente et embryo af det ønskede stadium ved at gribe de dorsale vedhæng og overføre det til det forberedte glasglas dækket af dobbeltsidet tape. Placer embryoet på båndet og minimer overførslen af olie. Rul embryoet forsigtigt over båndets overflade ved at skubbe med siden af pincettens spids uden at stikke det direkte.Fortsæt med at rulle embryoet, indtil korionen klæber til båndet og revnerne. Når korionen revner, skal du fortsætte med at rulle embryoet for at adskille det fra korionen, som forbliver fast på båndet. Rul embryoet tilbage på korionen, som er mindre klæbende end båndet.Gnid forsigtigt embryoet med pincetten, indtil det fastgøres til pincetten til overførsel. Overfør derefter embryoet til dæksedlen og bring det i kontakt med limen for at holde embryoet på plads og adskille det fra pincetten. Juster embryoets retning på dæksedlen.Lad embryonerne udtørring i fem til 12 minutter ved at placere dækslet glide med embryoner ind i udtørringskammeret og forsegle det. Tag dækslet af fra kammeret og læg en dråbe halocarbonolie 700, der dækker embryonerne for at forhindre yderligere udtørring. Undersøg dem under dissekeringsomfanget og fortsæt til mikroinjektion, hvis embryonerne blev udtørret korrekt.Placer 4X-målet i lysbanen, og juster embryonerne i fokus ved hjælp af fokusknappen på mikroskopet. Flyt embryonerne vandret ind i midten af synsfeltet ved hjælp af scenekontrollerne. Hold embryonerne i kanten af synsfeltet og panorer væk som forberedelse til at sænke nålen.Opholder du dig med det samme brændplan, skal du sænke nålespidsen og sikre, at den er synlig i synsfeltet sammen med embryonerne. Kontroller, at nålen fungerer, ved at dispensere noget af injektionsopløsningen i halocarbonolie 700. Hvis det lykkes, vises en boble af opløsning i olien nær nålespidsen.Brug scenekontrollerne til at flytte embryoet mod nålespidsen, indtil spidsen forsigtigt punkterer embryoet og går ind i det. Samtidig begynder strømmen af injektionsopløsning, indtil der vises et forbigående klart sted på nålespidsens sted, hvilket indikerer en vellykket opløsningsoverførsel til embryoet. Fastgør dækslet på det konfokale mikroskop ved hjælp af diasholderen.Vær forsigtig, da dækslet er skrøbeligt. Undersøg embryonerne ved hjælp af epifluorescensfunktionen på det konfokale mikroskop med et 40X mål, og sørg for, at fluor 4 i embryoet er synligt, før du fortsætter. For live billeddannelse skal du i synkroniseringsfasen indstille billedstørrelsen på 512 gange 512 pixels, linjegennemsnit på tre og en billedhastighed på 0,1 billeder pr. Sekund.Efter at BODIPY 493 503 farvestoffet blev injiceret, blev det lokaliseret på det sted, hvor nålespidsen blev indsat og derefter diffunderet ved siden af injektionsstedet. Efter 24 minutter har farvestoffet diffunderet forbi embryoets midtpunkt. Organellemotiliteten blev overvåget ved at injicere embryoet med BODIPY 493 503 og LysoTracker Red.Partikelbilledvelocimetrianalysen afslørede, at det embryonale indhold konvergerede på embryoets centrale region, hvor cytoplasmaet strømmer ind i embryoets indre. Mærkning af ER, ved hjælp af ER-Tracker Green, giver en levende opløsning af den nukleare konvolut, hvilket muliggør visualisering af større cellecyklusfaser. Embryoet blev injiceret med MitoView 633 på blastoderm-stadiet og afbildet fire timer senere.Billedet viser en neuroektodermal celle af et embryo i kimbåndsforlængelse. Et cellende embryo blev injiceret med en blanding af BODIPY 493 503 og SiR Tubulin, hvilket viser, at lipiddråberne bevæger sig tovejs langs mikrotubuli. Embryoet skal være delvist udtørret, så væske kan injiceres.For lidt udtørring vil få embryoet til at lække, når det injiceres, for meget udtørring vil dræbe embryoet. Videoer af bevægelige organeller kan karakteriseres via forskellige billedanalyseteknikker. Partikelsporing afslører de enkelte organellers opførsel, partikelbilleddannelse velocimetri afslører bulkstrømmen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til sammenligning genekspression domæner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Stænger i Live Heat Stressed Drosophila Embryoner

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Visualisering af virkningerne af oxidative skader på Drosophila Egg Chambers ved hjælp af Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Konfokal og superopløsningsbilleddannelse af polariseret intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner under Drosophila oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Optogenetisk hæmning af rho1-medieret actomyosinkontraktilitet kombineret med måling af epitelspænding i Drosophila-embryoner

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...