Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Wir danken Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang und Roger White für ihre Kommentare zum Manuskript. Wir danken Patrick Oakes, Stefano Di Talia und Victoria Deneke für das Teilen ihres Fachwissens zur Durchführung von PIV-Analysen. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health F31 HD100127 (an M. D. K.) und R01 GM102155 (an M. A. W) unterstützt.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Der Drosophila-Embryo ist ein leistungsfähiges und bequemes Modell, um grundlegende Fragen der Zell- und Organismenbiologie zu untersuchen. Seine relative Einfachheit, leistungsfähige Genetik und geringe Größe machen es zu einem ausgezeichneten System zur Abbildung sowohl zellulärer Prozesse als auch Entwicklung. Hier wird ein Standard-Mikroinjektionsprotokoll angepasst, um die FP-Anwendung in Embryonen zu ermöglichen. Dieser Ansatz ermöglicht die fluoreszierende Bildgebung spezifischer zellulärer Strukturen, ohne dass genetisch kodierte Fluorophore erforderlich sind, wodurch viele genetische Hintergründe für die Bildgebung geöffnet werden. Die Kombination mehrerer Farbstoffe und strategisch ausgewählter, fluoreszierend markierter Proteine kann mehrkanalige Live-Bildgebung eröffnen, die das gesamte Spektrum des sichtbaren Lichts abdeckt.
Kritische Schritte im Protokoll: Dieses Protokoll verwendet BODIPY 493/503 zur Kennzeichnung von LDs. Dieser Ansatz kann leicht angepasst werden, um andere zelluläre Strukturen zu markieren. Für die anschließende Bildanalyse ist einer der wichtigsten Faktoren das Signal-Rausch-Verhältnis, also die Helligkeit des Farbstoffs im Vergleich zum Hintergrundsignal. Lysosomen wurden erfolgreich abgebildet (LysoTracker Red, 1 mM), ebenso wie Mitochondrien (Mitoview 633, 200 μM), der ER (ER Tracker Green, 10 μM) und Mikrotubuli (SiR-Tubulin, 200 nM in DMSO), wie in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 , Abbildung 5 gezeigt. Darüber hinaus sind Eigelbvesikel autofluoreszierend und geben bei UV-Anregung blaues Licht ab (Bild mit 405 nm als Anregungswellenlänge (Abbildung 6)). Für andere Farbstoffe sollten Sie die Farbstoffkonzentration auf das 100-1.000-fache dessen erhöhen, was für die Färbung kultivierter Zellen erforderlich wäre; Dies ist vergleichbar mit der Konzentration einer Stammlösung, die zu Zellkulturmedien verdünnt würde. Da dieses Protokoll eine Injektion von 100 fL vorsieht und der Drosophila-Embryo in Band18 etwa 9 nL beträgt, werden diese Farbstoffkonzentrationen auf eine interne embryonale Konzentration von unter 1/100 von dem, was in den Zellkulturmedien vorhanden ist, gemittelt. Vorübergehend wird die lokale Konzentration an der Injektionsstelle höher sein, was am relevantesten für FPs ist, die nicht gut diffundieren (d. h. mitochondriale Farbstoffe und SiR-Tubulin). Beginnen Sie für diese FPs mit den empfohlenen hohen Konzentrationen. Wenn ein unerwarteter Tod beobachtet wird, verwässern Sie nacheinander das Zweifache, bis ein akzeptabler Kompromiss zwischen Überleben und Signalstärke erreicht ist.
Bei der gemeinsamen Injektion mehrerer Farbstoffe sollten sich beide Farbstoffe entweder im selben Lösungsmittel befinden oder sowohl die Lösungsmittel als auch die Farbstoffe sollten mit der Mischung kompatibel sein (Alkoholkonzentrationen von mehr als ~ 10% werden nicht empfohlen).
Die Qualität der Nadeln ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, da die Spitze so fein wie möglich sein muss. Andernfalls können Schäden durch die Injektionswunde die spätere Entwicklung des Embryos beeinträchtigen. Da sich handelsübliche Nadelzieher unterscheiden, ist es wichtig, den Vorschlägen des Herstellers zu folgen und mehrere Zugparameter auszuprobieren, bis die gewünschte Form erreicht ist. Es ist wichtig, den Qualitätskontrollschritt 1.1.3 durchzuführen, da die Arbeit mit einer rissigen, gezackten oder großen Nadelspitze die erfolgreiche Injektion erschwert oder sogar unmöglich macht.
Der Embryo muss teilweise ausgetrocknet werden, damit während der Injektion zusätzliche Flüssigkeitsvolumina hinzugefügt werden können. Wenn der Embryo untergetrocknet ist, dringt die Nadel nicht leicht ein, und Zytoplasma spritzt heraus, wenn die Nadel eindringt oder wenn die Lösung injiziert wird. Wenn der Embryo übermäßig ausgetrocknet ist, sieht er entleert aus und entwickelt sich nicht richtig. Die genaue Trocknungszeit hängt von den örtlichen Gegebenheiten, z.B. der Luftfeuchtigkeit, ab und kann sich von Tag zu Tag ändern. Sie muss für jede Sitzung empirisch ermittelt werden.
Die Überlebensfähigkeit des Embryos nach der Mikroinjektion hängt entscheidend von der Qualität der Nadel, der richtigen Austrocknung und der Begrenzung des Injektionsvolumens auf weniger als 1 pL (idealerweise 100 fL) ab. Solange diese Parameter optimiert sind, ist keine signifikante Toxizität erkennbar, wenn die beschriebenen Farbstoffe in den empfohlenen Konzentrationen injiziert werden. Wenn Embryonen die Austrocknungs- und Injektionsschritte überleben, entwickeln sie sich typischerweise erfolgreich zu einer Keimbanderweiterung, mit Ausnahme der Mikrotubuli- und ER-Sonden, die Zellularisierungsdefekte in hohen Konzentrationen verursachten (100 fL Injektion der Stammkonzentration von jedem). Die Tests ergaben keine offensichtlichen Entwicklungsfehler, wenn DMSO, Wasser und Mischungen der beiden in den empfohlenen Volumina injiziert wurden, mit einer Überlebensrate des Embryos durch Keimbandausdehnung von ~ 75% oder mehr. Injektionsvolumina von mehr als 1 ml verursachten Defekte und Embryonen, denen ~ 4 ml Volumina injiziert wurden, die für weniger als 1 Stunde entwickelt wurden. Daher müssen die Injektionsvolumina niedrig gehalten werden, was bedeutet, dass die Farbstoffkonzentrationen hoch sein müssen.
Im Allgemeinen werden Injektionen entlang des seitlichen Randes des Embryos empfohlen, da diese zu den geringsten Schäden führen. Die Injektionsstelle muss jedoch möglicherweise in Abhängigkeit von den diffusiven Eigenschaften der eingesetzten FPs angepasst werden. BODIPY 493/503 und LysoTracker diffundieren schneller über den gesamten Embryo als Lipid Spot 610 (ein weiterer Farbstoff zur Markierung von LDs), während SiR-Tubulin und Mitoview 633 nie vollständig über den Embryo diffundieren (Bildgebung bis zu 7 h nach der Injektion). Daher kann eine Injektion in oder in der Nähe der interessierenden Stelle erforderlich sein. Bei der Injektion in den vorderen oder hinteren Bereich wird eine besonders feine Nadel empfohlen.
Die Bildaufnahme stützt sich auf konfokale Mikroskopie, um kleine Organellen und alle Zytoskelettkomponenten optisch zu schneiden und aufzulösen. Techniken, die die Analyse vieler Bilder erfordern (z. B. STORM oder PALM), funktionieren nicht, da der embryonale Inhalt in Bewegung ist und die Fluorophore nicht für das Photoswitching optimiert sind. Der Epifluoreszenzmikroskopie fehlt die laterale und axiale Auflösung, um die meisten Organellen und kleineren zellulären Strukturen zu erkennen. Aus diesen Gründen wird dringend empfohlen, ein konfokales Mikroskop zu verwenden oder die Lichtblatttechnologie zu verwenden.
Die Reproduzierbarkeit der Bildanalyse hängt stark von konsistenten Bilddaten ab. Für die größten Erfolgsaussichten ist eine Optimierung der Injektionstechnik und Bildaufnahme erforderlich. Durch die Etablierung und Anwendung einer Technik, bei der die interessierenden Farbstoffe, die Injektionsstelle, das Alter des Embryos, das Injektionsvolumen und der Aufnahmeaufbau konsistent sind, werden die robustesten Daten für die Bildanalyse generiert.
Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode Dieses Protokoll demonstriert eine Methode zur Analyse des Massenflusses von LDs in Embryonen im Spaltstadium unter Verwendung der Partikelbild-Velocimetrie. Der gleiche Ansatz kann für andere Organellen, andere Entwicklungsstadien und andere Analysemethoden verwendet werden. Zum Beispiel zeigt Abbildung 2 eine Analyse von LDs und sauren Organellen, die in den synzytialen Stadien der Embryogenese fließen, sichtbar durch gemeinsame Injektion von BODIPY 493/503 und LysoTracker Red. Eine weitere erfolgreiche Bildgebung der LD-Bewegung in Embryonen bis zu 7 h nach der Befruchtung wurde erreicht; Diese Embryonen behalten die Injektionswunde, können sich aber mehrere Stunden entwickeln.
Daten, die mit diesem Protokoll gesammelt wurden, wurden für die Velocimetrie von Partikelbildern verwendet, aber viele andere Analysetechniken sind verfügbar. Zum Beispiel können Partikelverfolgungsprogramme, wie sie in ImageJ, Imaris oder manueller Verfolgung zu finden sind, verwendet werden, um Geschwindigkeiten und Richtungsabhängigkeiten von sich bewegenden Strukturen zu erhalten. Beachten Sie, dass die meisten solcher Tracking-Software für die Arbeit mit Daten aus planaren Zellkultursystemen entwickelt wurden und sich nicht immer gut an 3D-Strukturen wie den Drosophila-Embryo anpassen. Darüber hinaus müssten für die Erzeugung von Partikelverfolgungsdaten von bester Qualität mehrere Z-Ebenen abgebildet werden. Dies sollte machbar sein, wenn die Bilderfassungszeiten unter ~2 s liegen. Dieser Benchmark sollte auf konfokalen Konfokalsystemen mit rotierenden Scheiben, Gitterlichtplatten und neueren konfokalen Laserscanning-Systemen erreichbar sein. Die Machbarkeit der Partikelverfolgung für reichlich vorhandene Organellen wie LDs, Mitochondrien und Lysosomen ist jedoch gering, da die Menge an positivem Signal in einem Sichtfeld für die derzeitigen Tracking-Methoden zu hoch ist. Die Verfolgung von weniger häufigen Strukturen wie Kernen oder Dottervesikeln kann möglich sein. PIV für die Strömungsanalyse funktioniert gut für LDs und saure Organellen in Spaltungsstadien, da sich beide Organellen frei bewegen. Organellen wie Kerne, ER und Mitochondrien sind an andere zelluläre Strukturen gebunden und bewegen sich daher nicht frei und eignen sich nicht für Softwareanalysen, die freie Bewegung voraussetzen. Der Ermittler sollte die Techniken auswählen, die für die interessierende Organelle am besten geeignet sind.
Während der synzytialen und zellulären Blastoderm-Stadien bewegen sich LDs (sowie einige andere Organellen) entlang radial orientierter Mikrotubuli5. Es ist daher möglich, Querschnittsansichten (wie in Abbildung 5) zu finden, in denen einzelne Mikrotubuli über große Entfernungen im Fokus stehen, was eine Partikelverfolgung in 2D ermöglicht. Da sich diese optischen Ebenen tief im Inneren des Embryos befinden, wird die Gesamtsignalstärke verringert und das Signal-Rausch-Verhältnis reduziert.
Für die Tracking-Analyse kann eine möglichst schnelle Bildgebung entscheidende Details der Bewegung und damit der beweglichen Maschinerie aufdecken. Zum Beispiel ist die Lipid-Tröpfchen-Bewegung eine Mischung aus zwei beweglichen Zuständen, Zeitlupe (~ 200 nm / s; durchschnittliche Verfahrstrecke ~ 100 nm) und schnelle lange Bewegung (~ 450 nm / s; durchschnittliche Reiseentfernung ~ 1.000 nm)19; Wenn also Bilder jede Sekunde oder sogar seltener aufgenommen werden, wird der langsam-kurze Zustand nicht mehr erkennbar. Häufige Bildgebung induziert jedoch auch Fluorophorbleiche und Phototoxizität. Die bildgebenden Bedingungen müssen daher in Abhängigkeit von der genauen Fragestellung, die behandelt werden soll, angepasst werden.
Einschränkungen der Methode Je nach gewünschtem Farbstoff kann das Verfahren durch die Verträglichkeit zwischen der Farbstofflöslichkeit und der Toxizität der Injektionslösung eingeschränkt werden. Alkohole wie Isopropanol und Ethanol sind aufgrund ihrer niedrigeren Viskosität in einer Nadel schwer zu handhaben und scheinen zelluläre Komponenten zu schädigen und den Embryo abzutöten.
Die Methode ist auch nicht gut geeignet, um die frühesten Schritte in der Embryogenese zu visualisieren, da es 30+ Minuten dauert, um die Embryonen für die Injektion vorzubereiten. Bei Raumtemperatur sind die anfänglichen Zellzyklen des Embryos jeweils nur ~ 10 Minuten lang; Selbst wenn man also in Schritt 5.2.3 ein neu befruchtetes Ei kommissionieren würde, wären die ersten Zellzyklen bereits abgeschlossen, wenn der Embryo für die Bildgebung bereit ist.
Die Beleuchtung mit Licht im UV/Blau-Bereich ist deutlich phototoxischer als bei längeren Wellenlängen. Unter solchen Bedingungen (z. B. nach autofluoreszierenden Dottervesikeln; Abbildung 6) muss man die Bildgebungszeit begrenzen (was zu kürzeren Zeitreihen führt) oder eine geringere Laserleistung verwenden (was zu einem reduzierten Signal-Rausch-Verhältnis führt).
Nach der Zellularisierung neigen Farbstoffe, die an einer bestimmten Stelle injiziert werden, dazu, schlecht zu diffundieren, da sie viele Zellmembranen durchqueren müssen. Dies schränkt den Beobachtungsbereich in späteren Entwicklungsstadien ein.
Die Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden Die Bewegung von LDs und anderen lipidhaltigen Organellen in frühen Embryonen kann mit genetisch kodierten Fluorophoren, markierungsfreien Techniken und durch die Einführung von FPs visualisiert werden. Letzteres kann durch Permeabilisierung der Vitellinmembran12 oder den hier diskutierten Mikroinjektionsansatz erreicht werden.
Genetisch kodierte Fluorophore sind vielseitige Marker, deren Konzentrationen typischerweise von Embryo zu Embryo hochgradig reproduzierbar sind. Sie haben jedoch geringere Quantenausbeuten und bleichen leichter als FPs. Typischerweise sind sie nur in einer oder zwei getaggten Versionen (z. B. GFP oder mCherry) verfügbar, was die Auswahl einschränkt, welche Strukturen gleichzeitig abgebildet werden können. FPs hingegen existieren oft in einer großen Vielfalt; So stehen beispielsweise verschiedene lipidtröpfchenspezifische Farbstoffe mit Emissionsspektren von Autodot im UV/Blau-Spektrum bis hin zu Lipidtox und LipidSpot 610 im Fernrotspektrum zur Verfügung. FPs können auch direkt auf jeden interessierenden Stamm angewendet werden und erfordern daher keine Dehnungskonstruktion, um beispielsweise den gewünschten Organellenmarker in einen mutierten Stamm von Interesse einzuführen. Dieser Vorteil ist besonders ausgeprägt, wenn mehrere Strukturen gleichzeitig beschriftet werden sollen; Statt zeitaufwändiger Kreuzungen über mehrere Generationen hinweg, kann dies an einem einzigen Tag erreicht werden, indem die relevanten Farbstoffe gemischt und gleichzeitig eingeführt werden. Schließlich, wenn zelluläre Prozesse mit pharmakologischer Hemmung untersucht werden sollen, können Medikamente und Farbstoffe zusammen eingeführt werden.
Markierungsfreie Methoden sind sehr leistungsfähige Ansätze zum Nachweis spezifischer zellulärer Strukturen. Zum Beispiel können LDs in frühen Embryonen spezifisch durch Mikroskopie der dritten harmonischen Generation20 oder durch Femtosekunden-stimulierte Raman-Verlust-Mikroskopie21 nachgewiesen werden. Wie FPs können diese Ansätze in jedem genetischen Hintergrund angewendet werden, und da sie kein Bleichen verursachen, ermöglichen sie möglicherweise eine schnellere Bildaufnahme. Sie sind jedoch typischerweise auf bestimmte Organellen beschränkt und unterstützen daher nicht allein die Multiplex-Bildgebung; Sie erfordern auch spezielle Mikroskope.
Es gibt zwei allgemeine Strategien, um kleine Moleküle in Embryonen einzuführen. Einer ist der hier verwendete Mikroinjektionsansatz; Die andere ist eine chemische (Terpen-) Behandlung zur Permeabilisierung der Vitellinmembran. Der letztgenannte Ansatz12 ist weniger involviert als die Mikroinjektion, aber auch variabler von Embryo zu Embryo. Darüber hinaus ist nach der Permeabilisierung der Schutz durch die Vitellinmembran beeinträchtigt und der eigentliche Embryo ist für das externe Medium zugänglich, was es schwieriger macht, ihn am Leben zu erhalten. Es ist viel weniger wahrscheinlich, dass die Mikroinjektion die Embryonalentwicklung entgleisen lässt als die Permeabilisierung. Eine Permeabilisierung wird jedoch empfohlen, wenn viele Embryonen gleichzeitig überwacht werden müssen, z. B. für Drogenscreening-Zwecke. Um die Bewegung zellulärer Strukturen zu verfolgen und reproduzierbare Bildserien zu erhalten, die für die Bildanalyse geeignet sind, ist die Mikroinjektion die Methode der Wahl.
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen Der Drosophila-Embryo ist ein wichtiges Modellsystem zur Untersuchung vieler zellbiologischer und entwicklungsbedingter Prozesse 1,5,6. Die Markierung von Organellen mit fluoreszierenden Proteinen hat wichtige Beiträge zum Verständnis geleistet, wie sich der frühe Embryo entwickelt, wie verschiedene Organellen verkehren und wie ein solcher Handel entwicklungs- und genetisch moduliert wird. Ihre Neigung zur Bleichung und die Herausforderungen bei der Erzeugung von Stämmen, bei denen mehrere Organellen mit unterschiedlichen Farben gekennzeichnet sind, schränken jedoch die Anwendung dieses Ansatzes ein. Der Einsatz von FPs, die durch Mikroinjektion eingeführt werden, löst viele dieser Herausforderungen und kann sogar mit fluoreszierend markierten Proteinen kombiniert werden. Diese Technik ermöglicht die Abbildung mehrerer Organellen, Zellstrukturen und Zytoskelettkomponenten in jedem genetischen Hintergrund. Dadurch können mehrere Genotypen mittels Live-Imaging verglichen werden, so dass die Wirkung von Mutationen auf den Handel mit multiplen Organellen bestimmt werden kann.
Dieses Protokoll demonstriert den FP-Injektionsansatz für Embryonen von Drosophila melanogaster, aber im Prinzip gilt dieser Ansatz für alle Insekteneier, für die Mikroinjektionstechniken etabliert wurden, einschließlich anderer Arten von Drosophila, Grillen22 und Blattläusen23.

Vitale Farbstoffe und molekulare Sonden sind leistungsstarke Werkzeuge, um bestimmte Zellstrukturen und Organellen live abzubilden. Im Drosophila-Embryo zeigen viele verschiedene Organellen eine zytoskelettgetriebeneLokalisation 1,2,3,4, aber die Anwendung dieser kleinen Moleküle ist eine Herausforderung, da die Eierschale für viele von ihnen undurchlässig ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Verwendung von fluoreszierenden Sonden (FPs) in lebenden Embryonen durch Mikroinjektion, um den großflächigen Handel mit Organellen zu erkennen. Das Verfahren umfasst die Zubereitung der Injektionslösung, die Eizellentnahme und die Präparation von Embryonen, die Mikroinjektion, die Bildgebung und die Bildanalyse.
Dramatische räumliche Umlagerungen von Organellen sind in vielen tierischen Eizellen, Eiern und Embryonen üblich, zum Teil wegen der Größe dieser Zellen. Im Drosophila-Embryo zum Beispiel bewegen sich Lipidtröpfchen (LDs) und Dottervesikel kurz vor der Zellularisation in RichtungEmbryozentrum 5. Diese Bewegung hängt von Mikrotubuli ab und hinterlässt eine ~ 40 μm-Region rund um die Peripherie des Embryos, die von den beiden Organellen erschöpft ist. Während früherer Spaltungsstadien werden viele Organellen durch zytoplasmatische Ströme transportiert, die durch Aktin-Myosin-basierte Kontraktionen an der Embryooberflächeangetrieben werden 6. Obwohl die Embryonen vieler Arten ähnliche Umlagerungen aufweisen, ist der Drosophila-Embryo besonders geeignet, diese Prozesse durch Bildgebung zu verfolgen, da er sich bei Standardlabor-Raumtemperatur extern entwickelt, relativ transparent ist, klein genug ist, um auf die meisten Mikroskop-Setups zu passen, und mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen manipuliert werden kann.
Für einige Organellen stehen fluoreszierend markierte Proteine zur Verfügung, die diese Strukturen spezifisch markieren. Zum Beispiel ist LSD-2 (auch bekannt als dPLIN2) ein Protein, das in Embryonen spezifisch auf LDs7 abzielt. Es gibt Fliegenschnüre, die entweder induzierbare Transgene tragen, die für eine Fusion zwischen Green Fluorescent Protein (GFP) und LSD-28 kodieren, oder eine Genfalle, in der gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) in die kodierende Region des endogenen LSD-2-Gens 9,10 eingefügt wird. Dieser Ansatz hat jedoch Einschränkungen, einschließlich der Tatsache, dass diese Fusionsproteine geringe Quantenausbeuten haben und dazu neigen, leicht zu bleichen. Darüber hinaus kann die gleichzeitige Markierung mehrerer verschiedener Strukturen eine Herausforderung darstellen: Für viele Organellen ist derzeit nur eine Art von fluoreszierendem Tag (oft GFP oder mCherry) verfügbar, so dass die gleichzeitige Abbildung von zwei Organellen neue Transgene oder Insertionen erfordern kann; Selbst wenn kompatible Tags verfügbar sind, kann das Einbringen in eine einzelne Sorte zeitaufwändige Kreuzungen erfordern. Es macht auch die Nutzung der vielen mächtigen genetischen Ressourcen weniger bequem, z.B. wenn zwei Organellenmarker, ein Gal4-Treiber und ein induzierbares RNAi-Konstrukt alle in derselben Mutter vorhanden sein müssen.
Im Prinzip können diese Einschränkungen durch die Verwendung von FPs überwunden werden, einschließlich lebenswichtiger Farbstoffe (z. B. LysoTracker zur Markierung von Lysosomen), molekularen Sonden (z. B. SiR-Tubulin zur Markierung von Mikrotubuli) und fluoreszierend markierten biologischen Molekülen (z. B. C12 BODIPY zur Untersuchung des Fettsäurestoffwechsels11). Von der Verwendung in kultivierten Zellen sind sie in der Regel als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Zellbiologie gut validiert. FPs sind vielseitig, haben überlegene Fotoeigenschaften und sind mit fluoreszierenden Proteinen kompatibel. Mehrere Farbstoffe können gleichzeitig gemischt und aufgetragen werden, oft mit den Vorteilen der Trennung in die violett / blauen und fernroten Bereiche des Spektrums und kleiner Stokes-Verschiebungen, wodurch ein Durchbluten des Kanals verhindert wird. Kleine Stokes-Verschiebungen ermöglichen die gleichzeitige Erfassung mehrerer Bildgebungskanäle und ermöglichen die Verfolgung mehrerer Organellen gleichzeitig. Schließlich können sie auch zur Markierung von Organellen in den Embryonen anderer Drosophila-Arten oder sogar anderer Insekten angewendet werden, bei denen möglicherweise keine fluoreszierend markierten Proteine verfügbar sind.
Die meisten dieser FPs können jedoch die ausgeklügelte Eierschale des Drosophila-Embryos nicht durchqueren. Es besteht aus fünf Schichten: drei äußeren Chorionschichten (Chorion), die mechanische Schäden verhindern, sowie einer wachsartigen Schicht, die die Vitellinmembran umgibt und eine chemische Barriere12 bildet. Der Einfachheit halber wird die Kombination der wachsartigen Schicht und der Vitellinmembran im Folgenden als "Vitellinmembran" bezeichnet. Um die Eierschale zu umgehen, passt dieses Protokoll einen etablierten Embryo-Mikroinjektionsansatz an, um FPs in den Drosophila-Embryo einzuführen. Das Protokoll beschreibt, wie der zytoplasmatische Fluss von LDs in Embryonen im Spaltstadium überwacht werden kann. Es umfasst die Vorbereitung von Injektionsnadeln und Eiersammelkäfigen, den Prozess der Eizellentnahme und die mechanische Entfernung des Chorions. Es geht darum, wie man die Embryonen mikroinjiziert und abbildet und wie man den Massenstrom von LDs mit Hilfe der Partikelbild-Velocimetrie (PIV, angepasst von6) analysiert. Es bietet Ratschläge zur Fehlerbehebung, um das Überleben des Embryos sicherzustellen und das beste System für die Bildgebung zu schaffen. Es wird auch diskutiert, wie das Protokoll modifiziert werden kann, um LDs und Mikrotubuli gleichzeitig abzubilden oder es auf die Untersuchung anderer Organellen anzuwenden, einschließlich Lysosomen, Mitochondrien, Dottervesikel und des endoplasmatischen Retikulums (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

Frühe Drosophila-Embryonen sind große Zellen, die eine Vielzahl konventioneller und embryospezifischer Organellen enthalten. Während der ersten drei Stunden der Embryogenese durchlaufen diese Organellen dramatische Bewegungen, die durch aktinbasiertes zytoplasmatisches Strömen und motorgetriebenen Verkehr entlang von Mikrotubuli angetrieben werden. Die Entwicklung einer Vielzahl kleiner, organellenspezifischer Fluoreszenzsonden (FPs) ermöglicht es, eine breite Palette verschiedener lipidhaltiger Strukturen in jedem Genotyp sichtbar zu machen, was eine Live-Bildgebung ermöglicht, ohne dass ein genetisch kodierter Fluorophor erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, wie man lebenswichtige Farbstoffe und molekulare Sonden in Drosophila-Embryonen injiziert, um den Handel mit bestimmten Organellen durch Lebendbildgebung zu überwachen. Dieser Ansatz wird durch die Markierung von Lipidtröpfchen (LDs) und die Verfolgung ihrer Massenbewegung durch Partikelbild-Velocimetrie (PIV) demonstriert. Dieses Protokoll bietet eine Strategie, die für die Untersuchung anderer Organellen, einschließlich Lysosomen, Mitochondrien, Dottervesikel und der Notaufnahme, sowie für die Verfolgung der Bewegung einzelner LDs entlang von Mikrotubuli geeignet ist. Die Verwendung kommerziell erhältlicher Farbstoffe bringt die Vorteile der Trennung in die violett / blauen und fernroten Bereiche des Spektrums. Durch die Multiplex-Co-Markierung von Organellen und/oder Zytoskelettelementen mittels Mikroinjektion stehen alle genetischen Ressourcen in Drosophila für Handelsstudien zur Verfügung, ohne dass fluoreszierend markierte Proteine eingeführt werden müssen. Im Gegensatz zu genetisch kodierten Fluorophoren, die geringe Quantenausbeuten und leicht Bleichmittel aufweisen, ermöglichen viele der verfügbaren Farbstoffe eine schnelle und gleichzeitige Erfassung mehrerer Kanäle mit hohen Photonenausbeuten.

Nach der Injektion wird der Farbstoff nur an der Stelle lokalisiert, an der die Nadelspitze eingeführt wurde. Der Farbstoff diffundiert dann in Abhängigkeit von seinen diffusiven Eigenschaften von der Injektionsstelle weg. Abbildung 1 zeigt die Injektion von BODIPY 493/503 kurz nach der Injektion (Panel A) und 24 Minuten später (Panel B). Nach 24 min hat es der Farbstoff ungefähr bis zur Mitte der langen Achse des Embryos geschafft.
Die Analyse der Organellenmotilität kann durch Farbstoffinjektionen und Zeitrafferbildgebung erreicht werden. In Abbildung 2 wurde ein Embryo mit BODIPY 493/503 (Abbildung 2A) und LysoTracker Red (Abbildung 2B) koinjiziert und mittels Laseranregung bei 488 bzw. 596 nm abgebildet. Dieser Embryo wurde dann im Zeitraffer abgebildet (ein Bild alle 30 s für 30 min, 5 min analysiert). Die Zeitreihe wurde dann durch die PIV-Analyse geführt, deren Ausgabe über Stromlinien in Abbildung 2A,B dargestellt ist. Beachten Sie, dass die Stromlinien nicht die Flugbahn einzelner Partikel darstellen, sondern dass der zytoplasmatische Fluss aus der Analyse aller Partikel in diesem Bereich des Zytoplasmas abgeleitet wird. Durch die Markierung von zwei unabhängigen zellulären Strukturen (LDs und saure Organellen) findet die PIV-Analyse ähnliche Strömungen, wobei beide Markierungen in der zentralen Region des Embryos konvergieren, wo das Zytoplasma in das Innere des Embryos fließt6.
Derzeit verfügbare FPs erlauben die Markierung vieler anderer Organellen und zellulärer Strukturen. Abbildung 3 zeigt die Beschriftung der Notaufnahme über den ER-Tracker Green. Der ER-Tracker bietet eine schöne Auflösung der Kernhülle und ermöglicht die Visualisierung wichtiger Zellzyklusstufen. ER-Tracker Green wird mit 488-nm-Anregung abgebildet.
Die Kennzeichnung der Mitochondrien ist schwierig, da die meisten getesteten Farbstoffe im ersten Mitochondrien, in das sie gelangen, gefangen zu sein scheinen. Auf der anderen Seite wurden keine Anzeichen von Farbstofftoxizität festgestellt, was es ermöglichte, markierte Mitochondrien durch Zellularisierung und den ektodermalen Kernzyklus 15 zu verfolgen. Abbildung 4 zeigt eine ektodermale Zelle mehrere Stunden nach der Injektion mit Mitoview 633 (Anregungswellenlänge 633 nm).
BODIPY, Lysotracker und LipidSpot sind robust und können verwendet werden, um ~ 500 + -Bilder bei 512 x 512, Liniendurchschnitt 3, Bildraten von 1 / s bis 0,1 / s zu erfassen. ER-Tracker Green, SiR-Tubulin und die genannten mitochondrialen Farbstoffe sind weniger robust und liefern ~ 50-200 Bilder unter den gleichen Bedingungen.
Ausgehend von Blastotermischen bewegen sich LDs bidirektional entlang von Mikrotubuli, angetrieben von den Gegenpolaritätsmotoren Kinesin-1 und zytoplasmatisches Dynein5. Diese Bewegung kann durch Co-Labeling von LDs und Mikrotubuli durch Injektion von BODIPY 493/503 und SiR-Tubulin visualisiert werden (Abbildung 5). Da LDs häufig ihre Bewegungsrichtung umkehren (da sie zwischen Kinesin-1 und zytoplasmatischem Dynein wechseln), erfassen höhere Bildraten während der Erfassung besser kritische Details der LD-Motilität.
Die Live-Bildgebung von autofluoreszierenden Dottervesikeln ist ohne jegliche Form der Farbstoffinjektion möglich (Abbildung 6). Die Autofluoreszenz ist jedoch schwach und der Anregungslaser ist phototoxisch. Daher hat die Live-Bildgebung von autofluoreszierendem Eigelb ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zur Farbstoffinjektion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> Abbildung 1: Diffusion von BODIPY 493/503 durch den Embryo. Der Farbstoff wurde entlang der lateralen Kante zum vorderen Ende (oben rechts) injiziert und diffundiert von dieser Injektionsstelle in den Embryo, wobei LDs markiert werden. (A) Der Farbstoff ist durch Teile des Embryos diffusiert, die an die Injektionsstelle angrenzen. (B) Etwa 24 min/2 Kernzyklen später hat sich der Farbstoff über den Mittelpunkt des Embryos hinaus verbreitet. Maßstabsstab: 100 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> Abbildung 2: Partikelbild-Velocimetrie (PIV) für LDs und saure Organellen. Einem Embryo wurde sowohl BODIPY 493/503 als auch LysoTracker Red injiziert. (A) BODIPY-Kanal. (B) LysoTracker Roter Kanal. (A',B') Optimieren Sie Diagramme, die durch PIV-Analyse der beiden Kanäle generiert werden, die aus 10 sequenziellen Frames generiert wurden, einschließlich der in A und B gezeigten. A' entspricht dem Fluss von LDs, und B' entspricht dem Fluss saurer Organellen. Beachten Sie, dass sowohl A 'als auch B ' einen Zusammenfluss links von der Mitte zeigen, bei dem embryonaler Inhalt aus der Sichtebene in die Mitte des Embryos fließt. Beachten Sie auch, dass BODIPY mehr diffundiert hat als LysoTracker, da verschiedene Farbstoffe unterschiedliche diffusive Eigenschaften haben. Maßstabsstab: 100 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> Abbildung 3: ER-Tracker kennzeichnen synzytiale nukleare Divisionen. Ein synzytialer Blastoderm-Embryo wurde mit ER-Tracker mikroinjiziert und ein Teil seiner Oberfläche wurde im Laufe der Zeit abgebildet. (A) Spindelmontage während einer nuklearen Division. b) Spaltung der Kernhülle während derselben Division. (C) Nachfolgende Interphase. (D) Der Beginn der nächsten Teilung wird durch das Auftreten von Zentrosomen (Auftreten von kreisförmigen ER-freien Regionen, gekennzeichnet durch Pfeilspitzen) angezeigt. Beachten Sie die allmähliche Farbstoffbleiche. Anregungswellenlänge: 488 nm Maßstabsstab: 5 μm. A: Ausgangsrahmen, B: 3 min verstrichen, C: 10 min verstrichen, D: 13 min verstrichen. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> Abbildung 4: Mitoview 633-Kennzeichnung von Mitochondrien. Ein Embryo wurde mit Mitoview 633 während des Synzytialblastodermstadiums injiziert und 4 h später, nach der Zellularisierung, aufgenommen. Das Bild zeigt eine neuroektodermale Zelle eines Embryos in Keimbandverlängerung. Maßstabsstab: 5 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> Abbildung 5: Co-Labeling von LDs und Mikrotubuli. Einem zellularisierenden Embryo wurde eine Mischung aus BODIPY 493/503 (gelb A,B,C) und SiR-Tubulin (Magenta A',B',C') injiziert. A'', B'', C'' zeigen die zusammengeführten Kanäle. Die Felder A, A' und A'' zeigen den Anfangsrahmen, die Felder B, B' und B'' zeigen den Rahmen nach 5 s und die Felder C, C' und C' ' zeigen den Rahmen nach 10 s. Maßstabsstab: 5 μm. Alle 2,5 s wurde ein 512 x 512 Rahmen (Liniendurchschnitt 3) erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> Abbildung 6: Abbildung der Autofluoreszenz von Dottervesikeln während synzytieller Spaltungsstadien. (A) Zu Beginn des Erwerbs. (B) Nach 8 min. (C) Nach 16 min. Anregungswellenlänge: 405 nm. Eine geringe Erregungsintensität wurde verwendet, um den Embryo am Leben zu erhalten. Maßstabsstab: 100 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Im frühen Drosophila-Embryo durchlaufen viele Organellen eine großflächige Bewegung. Unser Protokoll beschreibt, wie diese Bewegung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die für die Zellkultur entwickelt wurden, überwacht werden kann. Im Vergleich zu fluoreszierenden Proteinen sind kommerziell erhältliche fluoreszierende Sonden heller und decken einen breiteren Bereich des Spektrums ab.Sie ermöglichen eine Multiplex-Colabeling und können in jedem genetischen Hintergrund verwendet werden. Es braucht Übung und Versuch und Irrtum, um zu wissen, wie lange es dauert, Embryonen auszutrocknen, so dass sie entweder während der Injektion platzen oder austrocknen und aufhören, sich zu entwickeln. Beginnen Sie zunächst mit der Vorbereitung der Injektionsnadeln, indem Sie die Kapillare in einen Kapillarhalter auf den Nadelzieher legen und mit Flügelmuttern befestigen.Richten Sie die Mitte der Kapillare mit dem Heizelement aus. Wählen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers die entsprechenden Einstellungen am Nadelzieher. Führen Sie mit einem Seziermikroskop den Qualitätskontrolltest durch.Drücken Sie die Nadeln horizontal in den Kitt, wobei die Nadelspitzen in der Luft hängen. Decken Sie die Nadeln mit dem Deckel ab und lagern Sie sie bis zum Gebrauch. Ziehen Sie mit Nadelladespitzen, die an einer Mikropipette befestigt sind, einen Mikroliter der Injektionslösung in die Spitze, ohne Luftblasen einzufangen.Halten Sie die Nadel mit Handschuhen in einer Hand, wobei die Spitze nach vorne zeigt, und stecken Sie die Ladespitze hinein. Geben Sie die Flüssigkeit in der Nähe der Nadelspitze ab, entfernen Sie die Pipette und halten Sie die Nadel vertikal, bis die Flüssigkeit zur Spitze fließt. Decken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie ab, ohne die Nadelspitzen zu beschädigen, um das Ausbleichen der Farbstoffe zu verhindern.Legen Sie mit einer Transferpipette oder einem Mikropipetter einen kleinen Tropfen Heptankleber in die Mitte eines rechteckigen Deckglases und lassen Sie ihn verdampfen. Um das Chorion mechanisch zu entfernen, bedecken Sie die entsprechend gealterte Embryoplatte mit einer dünnen Schicht Halogenkohlenwasserstofföl 27, um die Eierschale transparent zu machen. Betrachten Sie die Platte unter einem Dissektionsmikroskop mit Transillumination, um das Embryonenstadium zu bestätigen, und wählen Sie die Embryonen in Spaltungsstadien aus.Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette einen Embryo des gewünschten Stadiums auf, indem Sie die dorsalen Anhängsel greifen und auf den vorbereiteten Glasobjektträger übertragen, der mit doppelseitigem Klebeband bedeckt ist. Legen Sie den Embryo auf das Band und minimieren Sie den Öltransfer. Rollen Sie den Embryo vorsichtig über die Oberfläche des Bandes, indem Sie mit der Seite der Spitze der Pinzette stupsen, ohne ihn direkt zu stoßen.Rollen Sie den Embryo weiter, bis das Chorion am Band haftet und reißt. Nachdem das Chorion gerissen ist, rollen Sie den Embryo weiter, um ihn vom Chorion zu trennen, das am Band klebt. Rollen Sie den Embryo zurück auf das Chorion, das weniger haftend ist als das Band.Reiben Sie den Embryo vorsichtig mit der Pinzette, bis er zur Übertragung an der Pinzette befestigt ist. Übertragen Sie dann den Embryo auf das Deckglas und bringen Sie ihn in Kontakt mit dem Kleber, um den Embryo an Ort und Stelle zu halten und ihn von der Pinzette zu trennen. Passen Sie die Ausrichtung des Embryos auf dem Deckblatt an.Lassen Sie die Embryonen fünf bis 12 Minuten austrocknen, indem Sie den Deckzettel mit den Embryonen in die Austrocknungskammer legen und verschließen. Nehmen Sie den Deckzettel aus der Kammer ab und geben Sie einen Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl 700 ab, der die Embryonen bedeckt, um eine weitere Austrocknung zu verhindern. Untersuchen Sie sie unter dem Sezierbereich und fahren Sie mit der Mikroinjektion fort, wenn die Embryonen richtig ausgetrocknet wurden.Legen Sie das 4X-Objektiv in den Lichtweg und stellen Sie mit dem Fokusknopf am Mikroskop die Embryonen in den Fokus. Bewegen Sie die Embryonen horizontal in die Mitte des Sichtfeldes mit den Stufensteuerungen. Halten Sie die Embryonen am Rand des Sichtfeldes und schwenken Sie sie weg, um die Nadel zu senken.Bleiben Sie bei der gleichen Fokusebene, senken Sie die Nadelspitze ab und stellen Sie sicher, dass sie zusammen mit den Embryonen im Sichtfeld sichtbar ist. Überprüfen Sie, ob die Nadel funktioniert, indem Sie einen Teil der Injektionslösung in Halogenkohlenwasserstofföl 700 dosieren. Bei Erfolg erscheint eine Blase aus Lösung im Öl in der Nähe der Nadelspitze.Bewegen Sie den Embryo mit den Stufenkontrollen in Richtung der Nadelspitze, bis die Spitze den Embryo sanft durchsticht und in ihn eintritt. Beginnen Sie gleichzeitig mit dem Fluss der Injektionslösung, bis an der Stelle der Nadelspitze ein vorübergehender klarer Punkt erscheint, der auf einen erfolgreichen Lösungstransfer in den Embryo hinweist. Befestigen Sie den Deckglas mit dem Objektträgerhalter auf dem Konfokalmikroskop.Seien Sie vorsichtig, da der Deckschlitten zerbrechlich ist. Untersuchen Sie die Embryonen mit der Epifluoreszenzfunktion am konfokalen Mikroskop mit einem 40X-Objektiv und stellen Sie sicher, dass das Fluor 4 im Embryo sichtbar ist, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie für Live-Imaging während der Synzytialphasen die Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, den Zeilendurchschnitt von drei und eine Bildrate von 0,1 Bildern pro Sekunde ein.Nachdem der Farbstoff BODIPY 493 503 injiziert worden war, wurde er an der Stelle lokalisiert, an der die Nadelspitze eingeführt wurde, und dann neben der Injektionsstelle diffundiert. Nach 24 Minuten ist der Farbstoff über den Mittelpunkt des Embryos hinaus diffundiert. Die Organellenmotilität wurde überwacht, indem dem Embryo BODIPY 493 503 und LysoTracker Red injiziert wurden.Die Teilchenbild-Velocimetrie-Analyse ergab, dass der embryonale Inhalt in der zentralen Region des Embryos konvergierte, wo das Zytoplasma in das Innere des Embryos fließt. Die Beschriftung des ER mit ER-Tracker Green bietet eine lebendige Auflösung der Kernhülle und ermöglicht die Visualisierung wichtiger Zellzyklusstufen. Der Embryo wurde im Blastodermstadium mit MitoView 633 injiziert und vier Stunden später aufgenommen.Das Bild zeigt eine neuroektodermale Zelle eines Embryos in Keimbandverlängerung. Einem zellularisierenden Embryo wurde eine Mischung aus BODIPY 493 503 und SiR Tubulin injiziert, was zeigt, dass sich die Lipidtröpfchen bidirektional entlang von Mikrotubuli bewegen. Der Embryo muss teilweise ausgetrocknet sein, damit Flüssigkeit injiziert werden kann.Zu wenig Austrocknung führt dazu, dass der Embryo bei der Injektion ausläuft, zu viel Austrocknung tötet den Embryo. Videos von sich bewegenden Organellen können durch verschiedene Bildanalysetechniken charakterisiert werden. Die Partikelverfolgung zeigt das Verhalten einzelner Organellen, die Velocimetrie der Partikelbildgebung zeigt den Massenfluss.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

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Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

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Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

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