Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

אנו מודים לפאקיני פרומסירי, בריאן ג'נצ'יק, ג'ינגהונג (ג'יימס) טאנג ורוג'ר וייט על הערותיהם על כתב היד. אנו מודים לפטריק אוקס, סטפנו די טליה וויקטוריה דנקה על שיתוף המומחיות שלהם כיצד לבצע ניתוח PIV. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות F31 HD100127 (ל- M. D. K.) ו- R01 GM102155 (ל- M. A. W).

<ol>
	<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li><li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11.">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=As+the+fat+flies:+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos.">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li><li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos.">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li><li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li><li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila.">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li><li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos.">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021 (2018).</li><li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+patterns,+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library.">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li><li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells:+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis,+autophagy,+and+mitochondrial+fusion+dynamics.">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos.">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+collection.">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999)</li><li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).</li><li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+size,+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species.">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance.">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy.">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li><li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy.">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li><li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs.">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li><li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid.">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

צבעים חיוניים ובדיקות מולקולריות הם כלים רבי עוצמה לדמות מבנים תאיים ספציפיים ואברונים חיים. בעובר Drosophila, אברונים רבים ושונים מציגים לוקליזציה מונעת ציטוסקטון 1,2,3,4, אך היישום של מולקולות קטנות אלה מאתגר מכיוון שקליפת הביצה אטומה לרבים מהם. פרוטוקול זה מתאר שיטה לשימוש בבדיקות פלואורסצנטיות (FPs) בעוברים חיים באמצעות מיקרו-איניג'קציה על מנת לזהות סחר בקנה מידה גדול של אברונים. ההליך כולל הכנת תמיסת ההזרקה, איסוף והכנת ביציות של עוברים, מיקרו-הטמעה, הדמיה וניתוח תמונות.
סידור מרחבי דרמטי של אברונים נפוץ בביצות, ביציות ועוברים רבים של בעלי חיים, בין השאר בגלל גודלם הגדול של תאים אלה. בעובר דרוזופילה , למשל, טיפות שומנים (LDs) ושלפוחיות חלמון נעות לכיוון מרכז העובר רגע לפני התאוליזציה5. תנועה זו תלויה במיקרוטובולים ומשאירה אזור של כ-40 מיקרומטר סביב שולי העובר מרוקנים משני האברונים. בשלבי מחשוף מוקדמים יותר, אברונים רבים מועברים על ידי זרמים ציטופלסמיים המונעים על ידי התכווצויות מבוססות אקטין-מיוזין במשטח העובר6. אף על פי שהעוברים של מינים רבים מפגינים סידור מחדש דומה, עובר דרוזופילה מתאים במיוחד למעקב אחר תהליכים אלה על ידי הדמיה מכיוון שהוא מתפתח חיצונית ב"טמפרטורת החדר" הסטנדרטית במעבדה, הוא שקוף יחסית, קטן מספיק כדי להתאים לרוב מערכי המיקרוסקופ, וניתן לתמרן אותו באמצעות כלים גנטיים רבי עוצמה.
עבור אברונים מסוימים, קיימים חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי המסמנים באופן ספציפי מבנים אלה. לדוגמה, LSD-2 (הידוע גם בשם dPLIN2) הוא חלבון שבעוברים מכוון באופן ספציפי ל-LDs7. קיימים קווי זבובים הנושאים טרנסגנים אינדוקטיביים המקודדים היתוך בין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו-LSD-28 או מלכודת גנים שבה מוחדר חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לאזור הקידוד של הגן האנדוגני LSD-2 9,10. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות, כולל העובדה שלחלבוני היתוך אלה יש תפוקה קוונטית נמוכה והם נוטים להלבין בקלות. בנוסף, תיוג מספר מבנים שונים בו זמנית יכול להיות מאתגר: עבור אברונים רבים, רק סוג אחד של תג פלואורסצנטי (לעתים קרובות GFP או mCherry) זמין כיום, ולכן הדמיה של שני אברונים בו זמנית עשויה לדרוש טרנסגנים חדשים או החדרות; כמו כן, גם אם קיימים תגים תואמים, החדרתם לזן יחיד יכולה לדרוש צלבים גוזלים זמן רב. זה גם הופך את השימוש במשאבים הגנטיים החזקים הרבים לפחות נוח, למשל, אם שני סמנים אברוניים, נהג Gal4 ומבנה RNAi אינדוקטיבי כולם צריכים להיות נוכחים באותה אם.
באופן עקרוני, ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות שימוש ב-FPs, כולל צבעים חיוניים (למשל, LysoTracker לסימון ליזוזומים), בדיקות מולקולריות (למשל, SiR-tubulin לסימון מיקרוטובולים), ומולקולות ביולוגיות המסומנות בפלואורסצנטיות (למשל, C12 BODIPY כדי לחקור את חילוף החומרים של חומצות שומן11). החל משימוש בתאים בתרבית, הם בדרך כלל מאומתים היטב ככלים רבי עוצמה לחקר הביולוגיה התאית. FPs הם רב-תכליתיים, בעלי תכונות תמונה מעולות ותואמים לחלבונים פלואורסצנטיים. ניתן לערבב צבעים מרובים וליישם אותם בו זמנית, לעתים קרובות עם היתרונות של הפרדה לאזורים סגולים/כחולים ואדומים רחוקים של הספקטרום ותזוזות סטוקס קטנות, מה שמונע דימום בתעלה. תזוזות סטוקס קטנות מאפשרות לכידה בו-זמנית של ערוצי הדמיה מרובים, ומאפשרות מעקב אחר מספר אברונים בו-זמנית. לבסוף, ניתן ליישם אותם באותה מידה על תיוג אברונים בעוברים של מיני דרוזופילה אחרים או אפילו חרקים אחרים שבהם לא יהיו חלבונים מתויגים באופן פלואורסצנטי.
עם זאת, רוב ה-FPs האלה לא יכולים לחצות את קליפת הביצית המשוכללת של עובר דרוזופילה . הוא מורכב מחמש שכבות: שלוש שכבות כוריוניות חיצוניות (כוריון) המונעות נזק מכני בתוספת שכבת שעווה המקיפה את קרום הוויטלין היוצרת מחסום כימי12. למען הפשטות, השילוב של שכבת השעווה וקרום הוויטלין ייקרא "קרום הוויטלין" שמתחת. כדי לעקוף את קליפת הביצית, פרוטוקול זה מתאים גישה מבוססת של מיקרו-זירת עוברים כדי להכניס FPs לעובר Drosophila . הפרוטוקול מתאר כיצד לנטר את הזרימה הציטופלסמית של LDs בעוברים בשלב המחשוף. הוא כולל הכנת מחטי הזרקה וכלובי איסוף ביצים, תהליך איסוף הביצים והסרה מכנית של הכוריון. זה עובר על איך microinject ותמונה של העוברים וכיצד לנתח את הזרימה הגדולה של LDs באמצעות velocimetry תמונה של חלקיקים (PIV, מותאם מ6). הוא מספק עצות לפתרון בעיות כדי להבטיח את הישרדות העוברים וליצור את המערכת הטובה ביותר להדמיה. כמו כן, נדון כיצד ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לדלם בו זמנית LDs ומיקרוטובולים או ליישם אותו במחקר של אברונים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, שלפוחיות חלמון ורשתית האנדופלסמית (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

עוברי דרוזופילה מוקדמים הם תאים גדולים המכילים מגוון עצום של אברונים קונבנציונליים וספציפיים לעובר. במהלך שלוש השעות הראשונות של יצירת העוברים, אברונים אלה עוברים תנועות דרמטיות המופעלות על ידי זרימה ציטופלסמית מבוססת אקטין וסחר מונע על ידי מנוע לאורך מיקרוטובולים. הפיתוח של שפע של בדיקות פלואורסצנטיות קטנות וספציפיות לאברונים (FPs) מאפשר לדמיין מגוון רחב של מבנים שונים המכילים שומנים בכל גנוטיפ, ומאפשר הדמיה חיה ללא צורך בפלואורופור מקודד גנטית. פרוטוקול זה מראה כיצד להזריק צבעים חיוניים ובדיקות מולקולריות לעוברי דרוזופילה כדי לנטר את הסחר באברונים ספציפיים על ידי הדמיה חיה. גישה זו מודגמת על ידי תיוג טיפות שומנים (LDs) ובעקבות תנועתן בתפזורת על ידי וולוצימטריה של תמונת חלקיקים (PIV). פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה מקובלת לחקר אברונים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, שלפוחיות חלמון ומיון, ולמעקב אחר תנועתם של LDs בודדים לאורך מיקרוטובולים. שימוש בצבעים הזמינים באופן מסחרי מביא את היתרונות של הפרדה לאזורים סגולים/כחולים ואדומים רחוקים של הספקטרום. על ידי תיוג משותף של ריבוי של אברונים ו/או יסודות שלדיים באמצעות מיקרו-איניג'קציה, כל המשאבים הגנטיים בדרוזופילה זמינים למחקרי סחר בבני אדם ללא צורך בהחדרת חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. שלא כמו פלואורופורים מקודדים גנטית, בעלי תפוקה קוונטית נמוכה ואקונומיקה בקלות, רבים מהצבעים הזמינים מאפשרים לכידה מהירה ובו זמנית של מספר ערוצים עם תפוקת פוטונים גבוהה.

לאחר ההזרקה, הצבע יתמקם רק באתר בו הוכנס קצה המחט. לאחר מכן הצבע יתפזר הרחק ממקום ההזרקה בהתאם למאפייניו המפוזרים. איור 1 מראה הזרקה של BODIPY 493/503, זמן קצר לאחר ההזרקה (פאנל A) ו-24 דקות מאוחר יותר (לוח B). לאחר 24 דקות, הצבע הגיע בערך לנקודת האמצע של הציר הארוך של העובר.
ניתוח תנועתיות אברונים יכול להיות מושגת באמצעות זריקות צבע והדמיה בהילוך מהיר. באיור 2, עובר הוזרק במשותף עם BODIPY 493/503 (איור 2A) ו-LysoTracker Red (איור 2B) וצולם באמצעות עירור לייזר ב-488 ו-596 ננומטר, בהתאמה. העובר הזה צולם לאחר מכן בהילוך מהיר (פריים אחד כל 30 שניות במשך 30 דקות, 5 דקות נותחו). לאחר מכן, סדרת הזמן הופעלה באמצעות ניתוח PIV, שהפלט שלו מוצג באמצעות תייעלות באיור 2A,B. שים לב שהזרמים אינם מייצגים את מסלולם של חלקיקים בודדים, אך הזרימה הציטופלסמית מסיקה מניתוח כל החלקיקים באזור זה של הציטופלסמה. באמצעות תיוג של שני מבנים תאיים בלתי תלויים (LDs ואברונים חומציים), ניתוח PIV מוצא זרימות דומות, כאשר שתי התוויות מתכנסות על האזור המרכזי של העובר שבו הציטופלסמה זורמת לתוך פנים העובר6.
ה- FPs הזמינים כיום מאפשרים תיוג של אברונים ומבנים תאיים רבים אחרים. איור 3 מראה את הסימון של ה-ER באמצעות גשש ER Green. גשש ER מספק רזולוציה יפה של המעטפת הגרעינית, ומאפשר הדמיה של שלבי מחזור תאים עיקריים. גשש ER Green מצולם באמצעות עירור של 488 ננומטר.
התיוג של המיטוכונדריה הוא מסובך, שכן נראה שרוב הצבעים שנבדקו נלכדו במיטוכונדריה הראשונה שהם נכנסים אליה. מצד שני, לא זוהה שום סימן לרעילות צבע, מה שמאפשר לעקוב אחר מיטוכונדריה מסומנת באמצעות התאים והמחזור הגרעיני האקטודרמלי 15. איור 4 מראה תא אקטודרמלי מספר שעות לאחר ההזרקה עם Mitoview 633 (אורך גל של עירור 633 ננומטר).
BODIPY, Lysotracker ו- LipidSpot הם חזקים וניתן להשתמש בהם כדי לרכוש ~ 500+ תמונות ב 512 x 512, שורה ממוצעת 3, קצבי פריימים מ 1/s עד 0.1/s. גשש ER ירוק, SiR-tubulin, והצבעים המיטוכונדריים שהוזכרו פחות חזקים ומניבים ~ 50-200 תמונות באותם תנאים.
החל משלבי הבלסטודרם, LDs נעים באופן דו-כיווני לאורך מיקרוטובולים, המופעלים על ידי מנועי הקוטביות ההפוכה קינסין-1 ודיינין ציטופלסמי5. ניתן לדמיין את התנועה הזו על ידי תיוג משותף של LDs ומיקרוטובולים באמצעות הזרקת BODIPY 493/503 ו-SiR-Tubulin (איור 5). מכיוון ש-LDs הופכים לעתים קרובות את כיוון התנועה שלהם (כשהם עוברים בין קינזין-1 לדינאין ציטופלסמי), קצבי פריימים גבוהים יותר במהלך הרכישה לוכדים טוב יותר פרטים קריטיים של תנועתיות LD.
הדמיה חיה של שלפוחיות חלמון אוטופלואורסצנטיות אפשרית ללא כל צורה של הזרקת צבע (איור 6). עם זאת, האוטו-פלואורסצנציה עמומה, ולייזר העירור הוא פוטוטוקסי. לפיכך, להדמיה חיה של חלמון אוטופלואורסצנטי יש יחס אות לרעש גרוע ביחס להזרקת צבע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> איור 1: דיפוזיה של BODIPY 493/503 דרך העובר. הצבע הוזרק לאורך הקצה הצדדי לכיוון הקצה הקדמי (מימין למעלה) ומתפזר מאתר ההזרקה הזה לתוך העובר, תוך שהוא מסמן LDs. (A) הצבע התפזר דרך חלקים מהעובר הסמוכים לאתר ההזרקה. (B) בערך 24 דקות/2 מחזורים גרעיניים מאוחר יותר, הצבע התפזר מעבר לנקודת האמצע של העובר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> איור 2: וולוצימטריה של תמונת חלקיקים (PIV) עבור LDs ואברונים חומציים. לעובר הוזרק גם BODIPY 493/503 וגם ל-LysoTracker Red. (A) ערוץ BODIPY. (B) LysoTracker ערוץ אדום. (א', ב') ייעל דיאגרמות שנוצרו על-ידי ניתוח PIV של שני הערוצים שנוצרו מ-10 מסגרות עוקבות, כולל אלה המוצגות ב-A וב-B. A' מתאים לזרימה של LDs, ו-B' מתאים לזרימה של אברונים חומציים. שימו לב שגם A' וגם B' מראים מפגש שמאלי של מרכז שבו התכולה העוברית זורמת מחוץ למישור הראייה, למרכז העובר. כמו כן, שים לב כי BODIPY התפזר יותר מאשר LysoTracker כמו צבעים שונים יש תכונות מפוזרות שונות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> איור 3: גשש ER מתייג חטיבות גרעיניות סינסיטיאליות. עובר בלסטודרם סינסיטיאלי הוכנס למיקרו-איניג'קט עם גשש ER וחלק מפני השטח שלו צולם לאורך זמן. (A) הרכבת ציר במהלך חטיבת גרעין. (ב) סילוק המעטפת הגרעינית באותה חלוקה. (ג) אינטרפאזה עוקבת. (D) תחילת החלוקה הבאה מסומנת על ידי מראה צנטרוזום (מופע של אזורים מעגליים נטולי ER, המסומנים בראשי חץ). שימו לב להלבנת הצבע ההדרגתית. אורך גל עירור: 488 ננומטר. סרגל קנה מידה: 5 μm. A: מסגרת ראשונית, B: 3 דקות חלפו, C: 10 דקות חלפו, D: 13 דקות חלפו. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> איור 4: מיטו-וויו 633 תיוג של מיטוכונדריה. לעובר הוזרק Mitoview 633 במהלך שלב הבלסטודרם הסינסיטיאלי וצולם כעבור 4 שעות, לאחר התא. התמונה מציגה תא נוירואקטודרמלי של עובר בהרחבת רצועת הנבט. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> איור 5: תיוג משותף של LDs ומיקרו-טובולים. לעובר התאולרי הוזרק תערובת של BODIPY 493/503 ( צהוב A,B,C) ו-SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' מראים את הערוצים הממוזגים. לוחות A, A', ו-A '' מציגים את המסגרת הראשונית, לוחות B, B' ו-B'' מציגים את המסגרת לאחר 5 שניות, ולוחות C, C' ו-C' מציגים את המסגרת לאחר 10 שניות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. מסגרת בגודל 512 x 512 (קו ממוצע 3) נרכשה כל 2.5 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> איור 6: הדמיה של שלפוחית החלמון באופן אוטומטי במהלך שלבי הבקיעה הסינסיטיאליים. (ב) אחרי 8 דקות (ג) אחרי 16 דקות. אורך גל עירור: 405 ננומטר. עוצמת עירור נמוכה שימשה כדי לשמור על העובר בחיים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
נתונים משלימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים עוברים תנועה בקנה מידה גדול. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד לנטר תנועה זו באמצעות צבעים פלואורסצנטיים שפותחו עבור תרבית תאים. בהשוואה לחלבונים פלואורסצנטיים, בדיקות פלואורסצנטיות הזמינות באופן מסחרי בהירות יותר ומשתרעות על פני טווח רחב יותר של הספקטרום.הם מאפשרים קולבלינג מולטיפלקס וניתן להשתמש בהם בכל רקע גנטי. נדרש תרגול וניסוי וטעייה כדי לדעת כמה זמן לייבש עוברים, כך שהם מתפוצצים במהלך ההזרקה או מתייבשים ומפסיקים להתפתח. כדי להתחיל להכין את מחטי ההזרקה על ידי הנחת הנימים במחזיק נימים על מושך המחטים ואבטחתו באמצעות אומי כנף.יישרו את מרכז הנימים עם גוף החימום. על פי הוראות היצרן, בחר הגדרות מתאימות על מושך המחט. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, בצע את בדיקת בקרת האיכות.לחץ את המחטים לתוך המרק אופקית עם קצות המחט תלויים באוויר. מכסים את המחטים במכסה ומאחסנים עד לשימוש. באמצעות שימוש בקצות העמסת מחט המחוברים למיקרופיפט, משכו מיקרוליטר אחד של תמיסת ההזרקה לתוך הקצה מבלי ללכוד בועות אוויר.באמצעות כפפות, החזיקו את המחט ביד אחת כשקצהה מצביע הרחק והכניסו לתוכה את קצה ההעמסה. מחלקים את הנוזל ליד קצה המחט, מסירים את הפיפטה ומחזיקים את המחט אנכית עד שהנוזל זורם לקצה. מכסים את המיכל בנייר אלומיניום מבלי לפגוע בקצות המחט כדי למנוע הלבנה של הצבעים.באמצעות פיפטת העברה, או מיקרופיפטר, מניחים טיפה קטנה של דבק הפטן במרכז החלקת כיסוי מלבנית, ומאפשרים לה להתאדות. להסרת המקהלה באופן מכני, מכסים את צלחת העובר המיושנת כראוי בשכבה דקה של שמן הלוקרבון 27 כדי להפוך את קליפת הביצה לשקופה. צפו בצלחת מתחת למיקרוסקופ דיסקציה עם תאורת טרנס כדי לאשר את שלב העובר ולבחור את העוברים בשלבי המחשוף.באמצעות פינצטה עדינה, הרימו עובר מהשלב הרצוי על ידי תפיסת התוספות הגביות והעבירו אותו למגלשת הזכוכית המוכנה המכוסה בנייר דבק דו-צדדי. מניחים את העובר על הקלטת וממזערים את העברת השמן. גלגלו את העובר בעדינות על פני השטח של הקלטת על ידי נדנוד עם הצד של קצה הפינצטה מבלי לדחוף אותו ישירות.ממשיכים לגלגל את העובר עד שהכורה נדבקת לקלטת ונסדקת. לאחר שהכוריון נסדק, המשיכו לגלגל את העובר כדי להפריד אותו מהכוריון, שנשאר דבוק לקלטת. גלגלו את העובר בחזרה אל הכוריון, שהוא פחות דביק מהסרט.לשפשף בעדינות את העובר עם הפינצטה עד שהוא מתחבר לפינצטה לצורך העברה. לאחר מכן, העבירו את העובר לתלוש הכיסוי והביאו אותו במגע עם הדבק כדי להחזיק את העובר במקומו, ולהפריד אותו מהפינצטה. התאם את כיוון העובר על תלוש הכיסוי.תנו לעוברים להתייבש במשך חמש עד 12 דקות על ידי הכנסת הכיסוי עם העוברים לתא ההתייבשות ואטימתו. הורידו את החלקת הכיסוי מהתא והניחו טיפה של שמן הלוקרבון 700, המכסה את העוברים כדי למנוע התייבשות נוספת. בחנו אותם תחת היקף הניתוח והמשיכו למיקרו-איניג'קציה אם העוברים הושחתו כראוי.מקם את המטרה פי 4 לנתיב האור ובאמצעות ידית המיקוד במיקרוסקופ, התאים את העוברים למיקוד. הזז את העוברים אופקית למרכז שדה הראייה באמצעות פקדי הבמה. יש לשמור את העוברים בקצה שדה הראייה ולהרחיק את העורף כהכנה להנמכת המחט.להישאר עם אותו מישור מוקד, להוריד את קצה המחט ולוודא שהוא נראה בשדה הראייה יחד עם העוברים. בדקו כי המחט מתפקדת על ידי חלוקת חלק מתמיסת ההזרקה לשמן הלוקרבון 700. אם תצליח, תופיע בועה של תמיסה בשמן ליד קצה המחט.באמצעות בקרות הבמה, הזז את העובר לכיוון קצה המחט עד שהקצה מנקב בעדינות את העובר ונכנס לתוכו. במקביל, מתחילים את זרימת תמיסת ההזרקה עד שמופיעה נקודה שקופה חולפת באתר קצה המחט, מה שמעיד על העברת תמיסה מוצלחת לעובר. הדק את החלקת הכיסוי במיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות מחזיק המגלשה.יש לנקוט משנה זהירות מכיוון שהחלקת הכיסוי שברירית. בדקו את העוברים באמצעות פונקציית האפיפלואורסצנציה במיקרוסקופ הקונפוקלי במטרה של פי 40 וודאו שהפלואורו 4 בעובר גלוי לפני שתמשיכו. עבור הדמיה חיה, במהלך השלבים הסינכיטיים, הגדר את גודל התמונה של 512 על 512 פיקסלים, ממוצע שורה של שלושה וקצב פריימים של 0.1 פריימים לשנייה.לאחר שהוזרק צבע BODIPY 493 503, הוא הוכנס לאתר שבו הוכנס קצה המחט ואז התפזר בסמוך לאתר ההזרקה. לאחר 24 דקות, הצבע התפזר מעבר לנקודת האמצע של העובר. תנועתיות האברונים נוטרה על ידי הזרקת העובר עם BODIPY 493 503 ו- LysoTracker Red.ניתוח הוולוצימטריה של תמונת החלקיקים גילה כי התוכן העוברי התכנס באזור המרכזי של העובר, שם הציטופלסמה זורמת אל פנים העובר. תיוג של ה-ER, באמצעות ER-Tracker Green, מספק רזולוציה חיה של המעטפת הגרעינית, ומאפשר הדמיה של שלבי מחזור התא העיקריים. לעובר הוזרק MitoView 633 בשלב הבלסטודרם והוא צולם ארבע שעות לאחר מכן.התמונה מציגה תא נוירואקטודרמלי של עובר בהרחבת רצועת הנבט. לעובר התאים הוזרקה תערובת של BODIPY 493 503 ו-SiR Tubulin, שמראה כי טיפות השומנים נעות באופן דו-כיווני לאורך מיקרוטובולים. יש לייבש את העובר באופן חלקי כדי שניתן יהיה להזריק נוזלים.מעט מדי ייבוש יגרום לעובר לדלוף כשהוא מוזרק, יותר מדי ייבוש יהרוג את העובר. ניתן לאפיין סרטונים של אברונים נעים באמצעות טכניקות ניתוח תמונה מגוונות. מעקב אחר חלקיקים חושף את התנהגותם של אברונים בודדים, הדמיית חלקיקים ולוסימטריה חושפת את הזרימה הגדולה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation (Video) | JoVE 

איסוף עוברי דרוזופילה והכנתם לגירוי אופטוגנטי